雷帕霉素抑制口腔鱗癌細胞增殖及其分子機制研究

焦會杰

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是嚴重危害人類健康的口腔疾病，其發病率呈逐年上升趨勢[1，2]。全球范圍內OSCC 占所有新發癌癥病例的4%～7%[3]。據統計，口腔鱗癌占口腔癌的90%以上[4]，加強對口腔鱗癌的研究在我國具有重要的理論和現實意義。臨床上對于OSCC 的治療以手術為主輔以放化療的綜合治療，近年來OSCC的治療取得了很多的創新和改革，但患者的5 年生存率仍不超過60%[5]。OSCC 細胞比一般腫瘤細胞更容易發生轉移，因此研究藥物對于OSCC 的治療和預防具有重要意義。目前大量實驗研究表明：OSCC的發生涉及多因素、多環節、多階段的復雜過程，由于大量基因表達的異常，致使分子代謝異常及細胞正常生理過程發生改變，轉導相關信號受阻，細胞結構改變、免疫調節紊亂及細胞增殖等異常[6～8]。

雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特異性抑制劑,多樣性的生物活性，具有抗腫瘤、免疫抑制、抗真菌、保護神經及抗老化等眾多作用[9，10]。研究證實mTOR 的靶蛋白參與細胞生命活動的重要過程，mTOR 信號通路則在細胞分化、增殖、存活和轉移中扮演著重要的角色。雷帕霉素通過抑制mTOR 與下游靶蛋白之間的相互作用，而呈現出抑制腫瘤細胞的作用[11]。隨著相關研究的不斷深入，人們發現PI3K/AKT/mTOR 信號轉導途徑在腫瘤的產生和發展過程中地位顯著[12，13]。mTOR 作為平衡細胞生長的重要調節因子，在維持細胞生理狀態和應對外部環境壓力的過程中起著至關重要的作用，mTOR 的抑制劑可以通過mTOR 相關信號通路對腫瘤細胞的生長發揮調控作用[14～17]。目前，雷帕霉素臨床上主要用作免疫抑制劑及抗腫瘤藥物。它多樣性的生物活性極大激發了科研工作者對其作用機制的研究興趣。因此本實驗探討雷帕霉素對口腔鱗癌細胞 SCC-4 增殖的抑制作用并探討其作用機制，為雷帕霉素防治口腔鱗癌提供臨床前研究依據。

材料與方法

1.材料與儀器

口腔鱗癌細胞株SCC-4，購自美國ATCC 公司；雷帕霉素，購自美國Selleck 公司；兔抗人P-S6K1單克隆抗體，購自天津三箭生物技術股份有限公司；辣根過氧化物酶標記抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物有限公司；兔抗人p-AKT 單克隆抗體、兔抗人p-STAT3 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記抗兔IgG，均購自泊灣生物技術有限公司；B7 同系物（B7-H1)酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒，購自武漢基因美生物技術股份有限公司。PM-10A 熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司、5414D 離心機購自德國EPPENDORF 公司、SUAAISETIV 酶標儀購自奧地利TECAV 公司、AX-80 多功能顯微鏡購自日本Olympus 公司、IQLAS400 化學發光成像分析儀等均購自美國通用電氣醫療集團公司。

2.方法

（1）MTT 法測定雷帕霉素對SCC-4 增殖作用的影響：取對數生長期的SCC-4 細胞，先用胰酶消化，再制成SCC-4 的單細胞懸液，調整細胞數為2×104/mL，按照200 μL/孔接種于96 孔板中。實驗分為空白組（無SCC-4，僅DMEM 培養基）、對照組（0 μmol/L 雷帕霉素）及不同濃度（20、40、80 μmol/L）的雷帕霉素給藥組,每組設4 個復孔。SCC-4 細胞與藥物作用24 h 后,加入MTT 溶液（5 mg/ml）20 μL,繼續孵育4 h,棄掉培養基。每孔加入DMSO 150 μL，振蕩器振蕩10 min 溶解甲結晶。在酶聯免疫檢測儀上選擇570 nm 波長，測定各孔光吸收值，記錄結果。計算細胞的抑制率,公式為：抑制率（%）＝1-（處理組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）/（對照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）×100%。

（2）Western blot 檢測相關蛋白的表達：實驗組使用劑量為80 mol/L 雷帕霉素干預SCC-4 細胞株24 h，空白對照組SCC-4 細胞株在相同環境下未作干預24 h 后，分別收集細胞、提取細胞總蛋白。按照BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量。利用蛋白印跡（Weastern Blot）技術，以細胞漿中的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 為抗原，分別以兔抗人p-S6K1 單克隆抗體、兔抗人p-AKT 單克隆抗體、兔抗人p-STAT3 單克隆抗體作為第一抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 為第二抗體，內參基因為管家基因GAPDH。分別取SCC-4 細胞蛋白樣品40 μg，經過Tris-HCl 凝膠電泳分離后，轉至PVDF膜（0.45 μm）上，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，將兔抗人p-S6K1 單克隆抗體、兔抗人p-AKT 單克隆抗體、兔抗人p-STAT3 單克隆抗體稀釋，比例為1:1000，兔抗人GAPDH 單克隆抗體稀釋，比例為1:3000?；旌铣浞址湃朊芊獯?。將經過漂洗的PVDF 膜分別放入對應的一抗中，4℃過夜。TBST 漂洗5 次，5 分鐘/次。用TBST 稀釋辣根酶標記山羊抗兔IgG，比例為1:2500?；旌铣浞址湃朊芊獯校ㄗⅲ核姆N蛋白用同一種二抗）。將經過漂洗的PVDF 膜置入密封袋中，室溫，繼續孵育1 h。用TBST 清洗3 次，每次10 min，ECL 顯色后，以管家基因GAPDH 作為內參基因，利用Image Quant LAS4000 化學發光成像分析儀曝光PVDF 膜上條帶圖像并儲存。用Quantity One 圖像分析軟件記錄內參條帶與目的條帶灰度值，并計算細胞SCC-4 中p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 的相對蛋白表達量。

（3）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測共刺激分子（B7-H1）的變化情況：取處于對數生長期的SCC-4細胞,先用胰酶消化，再制成細胞數為5×105/mL，并以1 mL/孔接種于6 孔板。當細胞貼壁、生長至70%，收集細胞培養液，8000 r/min 離心5 min。離心沉淀之后即刻檢測，小試管準備7 只，按照說明書指示稀釋標準品。稀釋后各管濃度依次為：1000 pg/ml,500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.25 pg/ml，15.63 pg/ml。分別設空白孔（空白孔不加酶標試劑、樣品及生物素標記的抗B7-H1 抗體）、待測樣品孔（每個樣本設立3 個復孔）、標準品孔。每孔加入300 μl 1×洗液靜置浸泡30 s。棄掉洗液，在吸水紙上將微孔板拍干。每孔加入50 μl 1×檢測緩沖液，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品50 μl，標準孔加入50 μl 倍比稀釋的標準品，然后每孔再加稀釋后生物素標記的抗B7-H1 抗體50 μl。用封板膜封板后，300 轉/分鐘振蕩，室溫孵育2.5 h。棄掉液體并甩干，并每孔洗滌液添加300 μl，靜置30 s后棄掉并在吸水紙上拍干，此步驟重復6 次。每孔酶標試劑添加100 μl，空白孔除外。使用新的封板模封板，300 轉/分鐘振蕩，室溫孵育1 h。洗滌，棄掉洗液，在吸水紙上將微孔板拍干。每孔顯色底物TMB 添加100 μl,震蕩混勻，并在37 ℃避光環境中顯色15 min。每孔終止液加入100 μl 終止反應?？瞻卓诪榱泓c，以波長為450 nm 依次測量各孔OD值（吸光度）。為保證實驗數據準確性，測定步驟應在加入終止液后30 min 以內進行。橫坐標為標準品的濃度，縱坐標為OD 值，并繪制標準曲線，算出標準曲線的直線回歸方程。將樣品的OD 值代入方程式，就能算出每個樣品的實際濃度。使用80 μmol/L的mTOR 抑制劑雷帕霉素干預SCC-4 細胞株，采用ELISA 檢測干預24 h 后其下游共刺激分子（B7-H1）的變化情況。

3.結果分析和相關統計學方法

本研究運用統計分析軟件SPSS13.0 對數據進行統計學處理。實驗結果采用單因素方差分析，當P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

結果

1.MTT 結果顯示雷帕霉素可以顯著抑制口腔鱗癌細胞SCC-4 的增殖，且呈劑量依賴性。

不同濃度雷帕霉素對SCC-4 增殖的影響（結果如圖1 所示），隨著雷帕霉素給藥濃度增大，SCC-4細胞增殖的抑制率依次升高。當雷帕霉素作用24 h，濃度為20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 時，SCC-4 細胞抑制率分別為8.2%、17.8%、36.7%，表明高劑量（≥80 μmol）雷帕霉素對SCC-4 細胞具有明顯的抑制作用，因此選擇80 μmol/L 對細胞抑制率較為明顯的劑量作為雷帕霉素的給藥劑量進行下一步的研究。

圖1 不同濃度雷帕霉素對口腔鱗癌SCC-4 細胞增殖的影響

2.雷帕霉素對細胞增殖相關蛋白表達的影響

80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預后檢測p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 等蛋白的表達情況。Western Blot檢測結果與對照組比，雷帕霉素給藥組的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 等蛋白的表達均下降（結果如圖2所示），其差異有統計學意義（P＜0.05）（結果如表1所示）。表明雷帕霉素能夠抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關蛋白p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 的活化從而對SCC-4 細胞增殖具有抑制作用。

表1 WB 檢測80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預前后口腔鱗癌SCC-4 細胞中的p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 蛋白的相對表達量

圖2 WB 檢測80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預前后口腔鱗癌SCC-4細胞中p-AKT、p-STAT3 及p-S6K1 蛋白的相對表達量,*號表示其差異有統計學意義（P＜0.05）

3.雷帕霉素對細胞共刺激分子的影響

80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預后檢測共刺激分子（B7-H1)的濃度變化情況。ELISA 結果顯示使用80 μmol/L 的雷帕霉素給藥后，SCC-4 細胞株共刺激分子（B7-H1) 濃度均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（結果如圖3、表2 所示）；表明雷帕霉素能夠降低PI3K/AKT/mTOR 信號通路下游相關共刺激分子（B7-H1)的濃度，從而抑制鱗癌細胞增殖。

表2 80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預前后口腔鱗癌SCC-4 細胞中B7-H1 濃度

圖3 80 μmol/L 雷帕霉素給藥干預前后口腔鱗癌SCC-4 細胞中B7-H1 濃度的直方圖，*號表示其差異有統計學意義（P＜0.05）

討論

口腔鱗癌是嚴重危害人類健康的口腔疾病，其發病率呈逐年上升趨勢[18～20]。據統計，中國OSCC 的發病率明顯高于其他國家[21，22]。因此，加強OSCC 的研究具有重要的醫學意義。盡管手術和輔助治療方面取得了一定的進展，但OSCC 患者的預后仍很差，主要原因是診斷晚、生存率低、局部復發和預后不良。因此，迫切需要探索口腔鱗癌發生發展的機制，完善口腔鱗癌的治療和管理策略。本研究以口腔鱗癌SCC-4 為研究對象,主要探究雷帕霉素對鱗癌細胞的影響和作用機制，為雷帕霉素防治口腔鱗癌提供臨床前研究依據。

雷帕霉素（mTOR）抑制劑的機制靶點是來自吸水鏈霉菌的大環內酯類抗生素，可阻止T 淋巴細胞活化和B 細胞分化,具有抑制腫瘤、抑制機體免疫、抗真菌、保護神經及抗老化等眾多作用[23，24]。由于mTOR 調控許多下游通路，mTOR 抑制劑可以影響這些通路來控制各種疾病。其中PI3K/AKT/mTOR通路就是細胞內至關重要的信號轉導通路,在細胞的生長、存活、增殖和凋亡等過程中扮演著極重要的生物學角色[25]且對多種腫瘤具有抑制作用。信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是該通路最重要的一個調節因子，STAT3 蛋白是決定腫瘤微環境中免疫反應向著腫瘤形成還是抑制方向發展的關鍵因素[26]，STAT3 參與了腫瘤細胞和機體免疫系統的相互作用，活化的STAT3 能降低機體免疫系統對腫瘤細胞的監視和殺傷功能，從而為腫瘤細胞的生長提供便利條件[26]。本實驗將80 μmol/L 雷帕霉素作用于口腔鱗癌細胞24 h,抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路，發現該調節因子的磷酸化水平較對照組明顯降低。

AKT 是PI3K/AKT 信號通路的中心調節效應分子。利用Weastern Blot 檢測雷帕霉素作用于SCC-4后,發現AKT 蛋白磷酸化水平降低，表明雷帕霉素作用后，PI3K/AKT 信號通路在一定程度上被抑制[27]。

B7-H1 可在腫瘤細胞和腫瘤組織樹突狀細胞上表達,并在誘導特異性T 細胞凋亡和腫瘤免疫逃逸過程中發揮重要作用。雖然人的正常組織中表達B7-H1 的轉錄產物，但卻很難檢測到B7-H1 蛋白的表達。相反在大多數實體腫瘤中可以檢測到B7-H1蛋白的高表達，提示可能在腫瘤發生的某一階段B7-H1 的轉錄后翻譯過程明顯增加[28]。Parsa 等研究表明神經膠質瘤中抑癌基因的缺失調控PI3K/AKT/mTOR 信號下游的核糖體蛋白S6 激酶1（S6 kinase 1，S6K1）通路實現對B7-H1 基因翻譯水平的調控,導致B7-H1 蛋白表達增加,從而促進腫瘤免疫逃逸[29]。利用酶聯免疫吸附法檢測雷帕霉素作用于口腔鱗癌后，發現B7-H1 的表達降低，表明雷帕霉素在一定程度上抑制了鱗癌細胞的免疫逃逸。

綜上所述，本研究的結果證實雷帕霉素通過調節PI3K/AKT/mTOR 信號通路的關鍵因子，抑制口腔鱗癌細胞SCC-4 增殖，并表現出濃度依賴性的抗腫瘤作用。雷帕霉素引起共刺激分子（B7-H1)的表達降低，進而降低鱗癌逃避機體免疫監視，從而抑制鱗癌細胞增殖。此外，下調信號通路PI3K/AKT/mTOR 相關蛋白的表達可能是雷帕霉素抑制口腔鱗癌細胞免疫逃逸的機制之一,雷帕霉素可下調凋亡相關p-S6K1、p-AKT、p-STAT3 蛋白磷酸化水平，這可能是促進腫瘤細胞凋亡的機制之一。本研究結果表明雷帕霉素對于防治口腔鱗癌具有一定應用研究價值。為口腔鱗癌防治提供新的理論基礎，為雷帕霉素在口腔鱗癌及其他惡性腫瘤的臨床應用提供了實驗依據。為其進一步應用于臨床提供理論依據。