累積運動對胰島素抵抗小鼠心肌膠原纖維的影響

張玉麗,帥祥煜,梁 飛,齊園圃,張麗美,閆旭潔,梁偉寶,王松濤

(華南師范大學體育科學學院,廣州 510006)

久坐是指清醒狀態下采取坐姿或臥姿且身體能耗小于1.5 METs的狀態,一般以個人清醒狀態下每天或每周的總靜坐時間占清醒狀態時間的百分比來評價[1]。大量研究[2-6]指出：久坐是獨立于中等強度到大強度運動(Moderate to Vigorous Physical Activity,MVPA)以外的引起代謝性疾病的風險因素,與肥胖、胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR)、2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)等代謝性疾病的發生具有顯著的相關性。因此,在保證日常身體活動量的基礎上,如何有效地減少久坐行為已成為改善代謝性疾病的研究重點[7]。

累積運動是指短時、多次并且分布在全天的運動,是間斷久坐行為最主要的運動干預方式。大量研究[8-17]表明：累積運動降低了久坐或代謝性疾病人群的體質量(Body Weight,BW)、餐后血脂和空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,FPG)。但由于累積運動涉及的運動變量多,運動方案豐富,相關變量(如運動形式、運動強度、單次運動持續時間、次間間隔時間等)在代謝性疾病干預實踐中的量效關系與基本規律仍不明確。大部分研究[14,18]認為,為了保證一定的運動效果,累積運動的單次運動時間應該大于10 min,運動強度應該處在中等強度范圍之內。但也有研究[13]認為,運動的干預效果取決于機體的總能量消耗,每次運動的持續時間屬于次要因素。同時,有研究[11]證實了單次運動時間少于10 min的累積運動具有一定的健康干預價值。除此之外,本課題組在進行與累積運動相關的研究時發現,累積運動的次間間隔時間和運動頻率也是影響運動效果的因素。因此,哪種累積運動方案更加有效地改善代謝性疾病,目前還不能完全明確。

基于此,本研究以高脂喂養誘導的IR小鼠為研究對象,以中等強度持續運動、中等強度累積運動和大強度累積運動為干預手段,探究不同強度的累積運動對小鼠IR狀態、心肌膠原纖維和心肌纖維化蛋白表達的影響,以及比較等運動量的累積運動和持續運動的干預效果是否存在差異。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

4周齡雄性C57BL/6J小鼠112只,BW為0～30 g,由中山大學實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK(粵)2016-0029)。研究方案獲華南師范大學體育科學學院科學研究倫理專責小組批準(批準編號：SCNU-SPT-2017-002)。小鼠分籠飼養,每籠4～5只。采用12 h循環光照,飼養環境溫度為20～23 ℃,相對濕度為50%～70%。

1.2 IR小鼠造模

小鼠適應性喂養1周后,隨機分為普食對照組(NC,18只)和高脂造模組(HFD,94只)。NC組小鼠食用普通飼料,HFD組小鼠食用高脂飼料。高脂飼料配方參考美國Research diets公司生產的D12451高脂飼料(脂肪含量占總熱量的45%),由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(生產許可證號：SCXK(京)2014-0008)。造模期間,各組小鼠自由攝食和飲水,記錄每日食量和每周BW。高脂喂養第10周末,檢測小鼠FPG,進行口服葡萄糖耐量實驗(Oral Glucose Tolerance Test,OGTT),通過OGTT各時間點的血糖(Plasma Glucose,PG)計算OGTT曲下線面積(OGTT-AUC)。從NC組和HFD組各隨機抽取6只小鼠,摘除眼球后取血檢測小鼠血清空腹胰島素(Fasting Insulin,FINS)水平,計算小鼠定量胰島素敏感指數(QUICKI)和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)。綜合2組小鼠的OGTT-AUC、QUICKI、HOMA-IR和FINS水平來判定高脂喂養的造模效果,最后根據HFD組單只小鼠的OGTT-2小時血糖(OGTT-2hPG)水平,篩選糖耐量損傷的小鼠個體,確定為IR小鼠模型。

1.3 運動干預

將成為IR模型的小鼠隨機分為4組(每組12只)：IR安靜對照組(IRC)、IR中等強度持續運動組(MCE)、IR中等強度累積運動組(MAE)和IR大強度累積運動組(HAE)。所有小鼠均以普通飼料喂養。正式運動干預前,IR模型小鼠進行為期2周的晝夜節律調節和運動預適應。2周后,3個運動組小鼠按照相應的運動干預方案(表1)進行每周5天、為期8周的跑臺運動。

表1 小鼠運動干預方案Table 1 The program of exercise intervention for mice

運動干預時,所有組小鼠均處于人為設置的暗環境中。小鼠跑臺坡度為0°,3個運動組小鼠每天運動的總量相同。MAE組和HAE組小鼠,早上8：00開始進行第1次運動,第1次運動結束后開始計時,3 h后進行第2次運動,依次類推;MCE組小鼠在16：25～16：30之間開始運動。保證3個運動組小鼠每天的運動結束時間相近。

1.4 樣本收集和指標檢測

運動干預第8周,檢測各組小鼠的FPG水平,并進行OGTT。運動干預第8周的末次運動48 h后取材,取材前所有小鼠禁食不禁水12 h。稱量小鼠BW,對小鼠進行異氟烷麻醉,摘除眼球后取血,血液靜置 1～2 h,4 ℃,3 000 r/min離心15 min,分離血清后保存于-80 ℃冰箱內備用。解剖小鼠后迅速取出心臟并稱重,將心臟組織分為3份,用錫紙包裹放入-80 ℃冰箱內備用。

1.4.1 酶聯免疫吸附檢測(ELISA) 取小鼠心肌組織50 mg,按照1 g組織加入9 mL PBS的比例加入PBS緩沖液進行勻漿,勻漿后提取上清液,4 ℃、3 000 r/min 離心 20 min,保留離心后的上清液備用。根據ELISA試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)檢測步驟,使用酶標儀(TECAN infinite P200 PRO)在450 nm處檢測吸光度,根據相應標準曲線計算小鼠血清FINS水平和小鼠心肌組織I型膠原(Collagen I,COLI)、III型膠原(Collagen III,COLIII)和α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)含量。

1.4.2 Western blot實驗 將裂解后的心肌樣品放入離心管內,12 000 r/min離心20 min,取上清液,用BCA蛋白定量檢測試劑盒進行組織蛋白定量,取定量裂解后的樣品100 μL加入5×蛋白上樣緩沖液25 μL混勻。電泳時總上樣量為50 μg總蛋白。然后進行轉膜、封閉、孵育一抗、洗滌、孵育二抗、洗滌、蛋白印跡成像,用Alpha Ease FC軟件進行數據采集,檢測小鼠心肌組織轉化生長因子β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)、Smad3和結締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)蛋白表達水平?？贵w來源為TGF-β1(Abcam)、CTGF(CST)、Smad3(CST)和β-actin(CST)。

1.5 統計分析

2 結果

2.1 IR小鼠模型

本研究通過高脂飼料喂養C57BL/6J小鼠,誘導IR小鼠模型。結果(表2,圖1)顯示：(1)喂養高脂飼料10周后,HFD組小鼠的BW明顯高于NC組(P<0.01),HFD組小鼠的OGTT-AUC和OGTT各時間點的PG值均明顯高于NC組(P<0.01),說明HFD組小鼠可能出現了糖耐量損傷。(2)HFD組小鼠與NC組小鼠的FINS水平存在明顯差異(P<0.05),FPG水平、QUICKI和HOMA-IR也存在明顯差異(P<0.01)。以上研究結果證明：用高脂飼料喂養C57BL/6J小鼠10周,可引起HFD組小鼠出現糖耐量損傷。最后,根據HFD組單只小鼠的OGTT-2 h PG水平,篩選糖耐量損傷的小鼠個體,確定為IR小鼠模型(本研究IR小鼠成模率為76%)。

圖1 高脂飼料喂養對C57BL/6J小鼠OGTT的影響Figure 1 Influence of OGTT by high-fat diet in C57BL/6J mice

表2 普通飼料或高脂飼料喂養后小鼠的BW和IR評價結果Table 2 Mice’s BW and IR model results after dietary intervention

2.2 累積運動對小鼠BW和IR狀態的影響

為探究累積運動和持續運動改善小鼠BW和IR狀態的效果差異,本研究對比了運動干預8周后各組小鼠之間的BW、OGTT-AUC、FPG水平和FINS水平。研究結果(表3)顯示：(1)3個運動組小鼠的BW均明顯低于IRC組小鼠(P<0.01),HAE組小鼠的BW明顯低于MCE組小鼠(P<0.01)。(2)3個運動組小鼠的OGTT-AUC和FPG水平均明顯低于IRC組小鼠(P<0.01),并且3個運動組小鼠的FPG接近正常水平(<6.8 mmol/L)。(3)MCE組和HAE組小鼠的FINS水平均明顯低于IRC組小鼠(P<0.01),MAE組小鼠的FINS水平也低于IRC組小鼠(P<0.05),說明3種運動都改善了IR小鼠的高血糖和高胰島素血癥;3個運動組小鼠的OGTT-AUC、FPG水平和FINS水平均沒有明顯差異。

表3 運動干預后各組小鼠的BW、FPG、OGTT-AUC和FINSTable 3 The BW,FPG,OGTT-AUC and FINS in mice after exercise

2.3 累積運動對IR小鼠心肌組織膠原纖維含量的影響

由表4可知：(1)3個運動組小鼠心肌組織COLI、COLIII含量均明顯低于IRC組小鼠(P<0.01)。3個運動組之間,MAE組小鼠心肌組織COLI含量明顯高于MCE組(P<0.05)。(2)MCE組小鼠心肌組織COLI/COLIII明顯低于IRC組(P<0.05);3個運動組之間,MAE組小鼠心肌組織COLI/COLIII明顯高于MCE組(P<0.05),其余各組之間無明顯差異。此外,本研究還檢測了各組小鼠心肌組織中的α-SMA 蛋白含量,發現各組小鼠心肌組織均沒有表達α-SMA 蛋白(數據未顯示)。

表4 運動干預后各組小鼠心肌組織膠原纖維含量Table 4 The content of myocardial collagen fibers in mice after exercise

2.4 累積運動對IR小鼠心肌纖維化蛋白的影響

由圖2可知：運動干預8周后,MCE組和HAE組小鼠心肌組織TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表達均明顯低于IRC組(P<0.01或P<0.05),MAE組與IRC組無明顯差異;3個運動組之間,MAE組小鼠心肌組織TGF-β1、Smad3和CTGF蛋白表達均明顯高于MCE組(P<0.01),HAE組小鼠心肌組織CTGF蛋白表達也明顯高于MCE組(P<0.05),HAE組小鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達明顯低于MAE組(P<0.05)。

3 討論

本研究利用高脂飼料喂養C57BL/6J小鼠10周[19],成功建立IR小鼠模型;然后探究中等強度和大強度的累積運動對小鼠IR狀態、心肌膠原纖維和心肌纖維化蛋白表達的作用,并在等運動量的前提下,對比了累積運動和持續運動對IR小鼠影響的差異,擬明確改善IR及相關疾病的適宜累積運動方案。

除遺傳因素以外,肥胖是導致IR發生的主要因素[20]。運動可改善機體肥胖,增加游離脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)的清除能力,增強機體的糖、脂代謝能力,改善機體胰島素敏感性。本研究結果顯示：運動干預8周后,3個運動組小鼠的BW均明顯低于IR安靜對照組;大強度累積運動組小鼠的BW明顯低于中等強度持續運動組,說明大強度累積運動對降低IR小鼠BW的效果優于中等強度持續運動,這可能與大強度運動后的過量氧耗較高有關[21-23]。另外,本研究結果顯示,運動干預8周后,中等強度和大強度累積運動組小鼠的OGTT-AUC、FPG水平和FINS水平明顯低于IR安靜對照組,且與中等強度持續運動組之間無明顯差異,說明2種強度的累積運動均有效地改善了小鼠的IR和高胰島素血癥,并與中等強度持續運動具有相同的效果。

IR機體內心肌組織脂質積聚增多,引起心肌炎癥和損傷,可導致心肌膠原纖維含量增加,誘導機體出現心肌纖維化等心肌病[24-27]。但有研究[28]指出,在小鼠體質量減輕后,高脂飲食誘導和轉基因肥胖小鼠的心肌纖維化可出現一定程度的逆轉,說明該疾病模型下的心肌纖維化是一個動態過程。本研究中,運動干預8周后,各組小鼠心肌組織內均未發現α-SMA蛋白的表達(數據未顯示),說明IR小鼠心肌纖維化可能處于反應性或修復性的早期階段[29-30]。另外,3種運動均降低了IR小鼠心肌組織COLI、COLIII含量,但中等強度累積運動組小鼠心肌組織COLI含量仍然明顯高于中等強度持續運動組,大強度累積運動組小鼠心肌組織COLI、COLIII含量與中等強度持續運動組沒有明顯差異,說明大強度累積運動的作用效果與中等強度持續運動相當,而中等強度累積運動的作用效果可能較差。

TGF-β1是一種多功能的細胞因子,可控制成纖維細胞的增殖、分化、遷移和細胞外基質的產生。TGF-β1與TGF-β II型受體形成異聚體復合物后,磷酸化TGF-β I型受體,并磷酸化最主要的受體調控型Smad(Receptor-Regulated Smad,R-Smad)蛋白——Smad3蛋白,與Smad4結合后產生效應,促進纖維化進程的發展。由本研究結果可知,大強度累積運動和中等強度持續運動均有效地降低了IR小鼠心肌組織TGF-β1和Smad3蛋白的表達,且2種運動之間沒有明顯的差異。說明大強度累積運動下調IR小鼠心肌纖維化通路TGF-β1和Smad3蛋白的作用效果與中等強度持續運動相當。CTGF是CCN蛋白家族成員,TGF-β1可通過Smads、PKC和AngⅡ/MEK/ERK等途徑誘導成纖維細胞內的CTGF高表達[31-32],促進組織纖維化持續發展[33]。本研究結果顯示,運動干預8周后,大強度累積運動組小鼠心肌組織CTGF蛋白表達雖有改善,但仍然明顯高于中等強度持續運動組小鼠。說明8周大強度累積運動雖然可以降低IR小鼠心肌組織CTGF蛋白表達,但可能不如中等強度持續運動的干預效果。另外,中等強度累積運動組小鼠心肌組織TGF-β1、Smad3和CTGF的蛋白表達均顯著高于中等強度持續運動組,說明中等強度累積運動可能不足以抑制或下調IR小鼠心肌纖維化蛋白表達。

4 結論

本研究以C57BL/6J小鼠為研究對象,通過高脂喂養將其誘導為IR小鼠模型,探究了不同強度的累積運動對小鼠IR狀態和心肌膠原纖維及致心肌纖維化通路蛋白表達的影響。研究結果表明：長期中等強度和大強度累積運動可改善高脂飼料誘導的IR小鼠的IR狀態,與中等強度持續運動具有相同的作用效果;長期大強度累積運動可改善IR小鼠心肌膠原纖維和心肌纖維化蛋白TGF-β1、Smad3的表達,與中等強度持續運動具有相同的作用效果;長期中等強度累積運動可改善IR小鼠心肌膠原纖維的表達,其作用效果較弱。

本研究以累積運動間斷久坐行為,改善IR等代謝性疾病為初衷,探究了不同強度的累積運動對IR小鼠的治療作用,探討了累積運動改善IR引起的心肌纖維化的分子機制,為尋求合理、有效的久坐間斷運動模式提供一定的理論支撐。但由于累積運動的組成變量較多,后續研究可進一步探討不同的運動方式、不同的次間間隔時間或不同的單次運動時間等組成的累積運動的干預效果,為不同類型疾病和不同需求的人群提供更多可選擇的運動方案。