農桿菌介導四季秋海棠遺傳轉化體系建立

李逸菲，王瑞博，夏惠婷，任璞玉，趙丹丹，秦肖潔，李永華，張開明

（河南農業大學風景園林與藝術學院，鄭州 450002）

四季秋海棠（Begonia semperflorens）別稱四季海棠，是秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠屬（Begonia）多年生宿根草本開花植物，原產巴西熱帶地區，是一類優良的觀賞景觀花卉?；ㄆ陂L且開花繁茂，廣泛應用于園林植物造景。四季秋海棠可通過扦插、播種、分株、組織培養等方法繁殖。葉片易受低溫、高光、干旱等脅迫變紅[1-2]。

對逆境脅迫響應和適應機制在一定程度上影響植物栽培繁育及園林價值。隨著分子生物學技術發展，園林植物逆境脅迫機理研究由生理水平進入分子水平[3]。轉基因技術是改良植物特性重要手段，但缺乏穩定高效的遺傳轉化體系仍是制約四季秋海棠轉基因技術發展的重要因素。國內外關于四季秋海棠綠葉紅花品系‘超級奧林匹克’遺傳轉化的研究鮮有報道，相關研究主要集中在秋海棠屬為數不多的40 余個種中離體培養和再生體系初步研究方面。Karpova 等通過比較大花海棠離體培養與溫室植物葉片色素含量與葉色參數，設計出再生和高效離體繁殖方案[4]；張明等以四季秋海棠葉片為外植體建立離體再生體系，移栽成活率為96%[5]；Aswathy 等經由組織解剖和遺傳特征解讀證實離體微繁是一種可靠的馬拉巴爾秋海棠大規模繁殖模式[6]；Hosseinabadi 等優化用于實現蟆葉秋海棠高效再生體外培養體系[7]。此類研究為秋海棠屬植物快速繁殖培育及基因工程研究提供必要的材料體系與技術條件。目前，關于秋海棠屬植物遺傳轉化體系與生物工程研究的報道較多，楊夢潔等借助葉盤轉化法確立瓦氏秋海棠穩定遺傳轉化體系[8]；趙志新以葉片為外植體初步建立四季秋海棠遺傳轉化體系[9]；Xu 等研究竹節秋海棠中異位表達KNOX基因產生4 種觀賞類型轉基因植株[10]；Kiyokawa等為3種商業秋海棠品種開發農桿菌介導的遺傳轉化體系[11]。此類研究對推進該屬植物分子育種進程和基因功能鑒定具有重要意義。

借由基因工程技術開展分子育種將成為優良品種選育與物種資源提升的重要手段，而穩定高效的遺傳轉化體系將為植物基因功能研究提供豐富基因資源，推動植物遺傳育種創新與新資源創制。Liang等基于農桿菌高效轉化小麥幼胚的Pure?Wheat技術篩選得到再生能力與農藝性狀更優的小麥品系，為小麥轉基因與基因編輯研究提供合適的植物材料[12]；王思凡等綜合國內外大麻遺傳轉化研究進展發現，大麻種質資源改良與高價值品種創制有賴于穩定高效的遺傳轉化方法[13]。

因此，本研究在課題組前期已建立四季秋海棠離體再生體系基礎上，以四季秋海棠無菌苗為試驗材料，探究農桿菌介導遺傳轉化體系的建立，優化預培養、農桿菌侵染液濃度（OD600）、侵染時間與共培養等參數，初步建立四季秋海棠高效遺傳轉化體系，為四季秋海棠分子育種與基因功能研究提供技術支撐，對開展多層次多領域四季秋海棠逆境脅迫應答機制及植物新種質創制提供材料資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

四季秋海棠綠葉紅花品系‘超級奧林匹克’種子購自廈門愛墾園藝有限公司。種子播種于1/2MS基本培養基中，置于光照培養箱中培養，培養溫度為晝25 ℃/夜23 ℃，光周期為晝14 h/夜10 h，光照強度為10 000 lx，相對濕度為60%，約25 d 后發芽。待無菌苗長至約有10 片展開葉時，選取生長健壯植株的葉片作為外植體材料。

1.1.2 菌株與載體

試驗所需根癌農桿菌（Agrobacterium tumefa?ciens）菌株GV3101 購自北京擎科生物科技有限公司；pCanG-EGFP超表達載體為深圳仙湖植物園李凌飛老師饋贈，該載體含有35S啟動子，NOS終止子，NPTⅡ基因（卡那霉素抗性基因）和EGFP基因（增強型綠色熒光蛋白基因）；pCanG-EGFP-BsR?bohD過表達載體為實驗室保存。

1.1.3 試劑與培養基

乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）、利福平（Rifampicin，Rif）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）、羧芐青霉素（Carbenicillin，Carb）、6-芐氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthl?cetic acid，NAA）等激素購自鄭州金圖生物科技有限公司。反轉錄和熒光定量試劑盒購自杭州碩盟生物科技有限公司。

①LB（農桿菌培養基）：酵母提取物5 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1；

②MS 培養基：MS 4.4 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.8 g·L-1；

1/2MS（基本培養基）：MS 2.2 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.8 g·L-1；

③MS1（預培養基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA；

④MS2（懸浮液）：MS；

⑤MS3（共培養基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA+AS 100 mol·L-1；

⑥MS4（過渡培養基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA+Carb 400 mg·L-1；

⑦MS5（篩選培養基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA+Carb 400 mg·L-1+Kan 25 mg·L-1；

⑧MS6（生根培養基）：1/2MS+0.12 mg·L-1NAA+Carb 400 mg·L-1+Kan 25 mg·L-1。

用于四季秋海棠組織培養的培養基除MS2外，均加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.8 g·L-1，pH 5.8。121 ℃高溫高壓滅菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 篩選抗生素Kan與抑菌劑Carb濃度的確定

以無菌培養的四季秋海棠葉片為外植體，切成1 cm×1 cm 大小，分別接種至含有不同濃度Kan（0，15，25，35，45 mg·L-1）初代培養基MS1 上。弱光培養每15 d繼代一次，40 d后觀察統計不同處理中外植體分化率，確定合適篩選濃度。每個處理重復2 次，每次重復接種30 個外植體。通過查閱文獻分析農桿菌對Carb 抗性，確定最優抑菌濃度。

1.2.2 四季秋海棠葉片預培養

取無菌苗葉片切成1 cm×1 cm大小，接種至預培養基MS1中暗培養，設置溫度23~25 ℃，保持其他條件一致，僅設置不同預培養時間分別為1、2與3 d，誘導外植體處于不同感受態，探究預培養時間對遺傳轉化效率的影響。

1.2.3 農桿菌侵染液濃度及侵染時間

將攜帶有目的載體質粒pCanG-EGFP-BsRbohD的根癌農桿菌GV3101 于LB 液體培養基中（含Kan 50 mg·L-1和Rif 50 mg·L-1）28 ℃、220 r·min-1搖菌培養36 h，MS2 懸浮液（MS 4.43 g·L-1）兩次重懸農桿菌菌體，條件分別為25 ℃、4 000×g離心10 min收集菌液，棄上清，MS2 懸浮液重懸浮菌體并清洗，25 ℃、5 000×g 離心5 min 收集菌液，再次用MS2重懸液重懸菌體。方法參考劉紅利[14]。

兩次重懸菌體后，利用MS2 懸浮液分別調整農桿菌菌液終濃度OD600為0.6、0.7 與0.8，保持其他條件一致，加入AS（按體積比AS∶菌液=1∶500）搖勻，黑暗靜置1~3 h后侵染葉片。選取預培養后形態完整且長勢良好葉片置于侵染液中分別侵染10、12、14 min，侵染過程中不斷搖晃使葉片與菌液充分接觸，侵染后將葉片置于無菌濾紙上吸干多余菌液。40 d后統計誘導愈傷組織數量，探究遺傳轉化最適宜侵染時間。

為初步篩選遺傳轉化4個參數最佳條件，設置預培養2、3 d，共培養2、3、4 d，侵染液濃度OD600=0.6、0.7、0.8，侵染時間10、12、14 min，4個參數不同條件共54 個排列組合；根據初步篩選結果調整預培養和侵染時間設置后3組試驗；最終得出遺傳轉化效率較高的參數組合。

1.2.4 四季秋海棠葉片各培養階段

①共培養

將侵染后葉片外植體背面向下整齊接種于共培養基MS3 中暗培養，保持其他條件一致，共培養時間分別為2、3與4 d。60 d后統計產生抗性再生植株數量，探究遺傳轉化最適宜共培養時間。

②過渡培養

選擇共培養后生長較好葉片外植體轉移至過渡培養基MS4中，于23~25 ℃光照培養箱中弱光培養7 d。

③篩選培養

選擇過渡培養后生長較好葉片外植體轉移至篩選培養基MS5 中，誘導愈傷組織大量分化出芽。弱光培養每15~20 d繼代一次。

④生根培養

30~35 d 后選擇篩選培養基中長至一定大小且生長狀態良好不定芽切下，轉移至生根培養基MS6中，10~15 d可誘導生根。

⑤煉苗移栽

當生根培養基中再生植株生根達到一定數目時，將植株移栽至基質（蛭石∶泥炭土=1∶3）中，于溫度23~25 ℃、光照強度10 000 lx光照培養箱中培養。待植株生長健壯后進行轉基因植株鑒定。

1.2.5 轉基因植株分子鑒定

使用十六烷基三甲基溴化銨法（來自華大基因）提取再生植株葉片DNA，設計引物作PCR 檢測。BsRbohD基因（基因登錄號MH784503）鑒定引物：BsRbohD-F1：5'CCAGCAGAACACCCCCATC3'，BsRbohD-R1：5'CCCAATACACTCGCCGAAC3'（即載體一端引物pCanG-F和目的基因一端引物BsRbo?hD-R，擴增長度為799 bp）。PCR反應體系（25 μL）：模板（DNA）1 μL，1×T3 Super PCR Mix 22 μL，上下游引物各1 μL。PCR 擴增程序（35 個循環）：98 ℃2 min 預變性，98 ℃10 s 變性，60 ℃10 s 退火，72 ℃10 s 延伸，72 ℃2 min 延伸，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

使用十六烷基三甲基溴化銨法（來自華大基因）提取野生型和轉基因植株葉片總RNA，以反轉錄試劑盒（TOROIVD，RTQ-202P）提供方法獲得各株系cDNA，并以此為模板，設計引物進行半定量PCR 檢測。四季秋海棠內參基因Bs18S（基因登陸號No．KJ959633）引物：Bs18S-F：5'GCTACCAC ATCCAAGGAAGG3'，Bs18S-R：5'CAATGGATCCT CGTTAAGGG3'；BsRbohD基因半定量引物、PCR反應體系與擴增程序同DNA水平檢測。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用上段所述模板、內參，以野生型四季秋海棠中BsRbohD基因相對表達量為對照，根據熒光定量試劑盒（TOROIVD，QST-100P）提供方法檢測野生型和轉基因各株系中BsRbohD基因相對表達量。BsRbohD基因定量引物：BsRbohD-F2：5'AA TGAACGAGGTGGCTGAGA3'，BsRbohD-R2：5' T CCTTTTGTACACTTGGCGC3'。PCR反應程序（45個循環）：50 ℃2 min 反應，95 ℃1 min 預變性，95 ℃10 s 變性，60 ℃30 s 退火。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.2.6 pCanG-EGFP轉化四季秋海棠

采用pCanG-EGFP 載體代替重組質粒pCanGEGFP-BsRbohD，參照上述遺傳轉化方法將pCanGEGFP 空載轉化四季秋海棠，根據EGFP基因序列設計引物作PCR檢測，引物序列為：EGFP-F：5'A TGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT3'，EGFP-R：5'G GATCCATCGATTTCGAACCCGGGG 3'（擴增長度為747 bp）。

2 結果與分析

2.1 篩選抗生素Kan與抑菌劑Carb濃度確定

在含有一定濃度Kan的MS1培養基上生長一段時間后外植體褐化死亡（見圖1）。將外植體分別接種于梯度濃度Kan的MS1培養基上培養40 d后，不同濃度Kan 對葉片分化的影響見表1，四季秋海棠葉片對濃度15 mg·L-1以下Kan有一定適應能力，Kan濃度為15 mg·L-1時，愈傷組織分化率為16.7%，隨Kan濃度增加，濃度25 mg·L-1及以上Kan不誘導愈傷組織不定芽分化，因此，25 mg·L-1Kan 作為抗性愈傷組織篩選最適濃度。

圖1 卡那霉素對外植體生長的影響Fig.1 Effects of kanamycin on the growth of explants

Carb 在共培養后篩選培養中發揮抑制農桿菌生長的作用，同時，適宜濃度Carb 對受體細胞具有一定生物效應，Carb 分解產物是生長素和萘乙酸，可促進愈傷組織增殖。本研究中Carb 濃度選擇400 mg·L-1[15]，且經后期試驗可知，400 mg·L-1Carb 濃度抑菌效果較好且無害于愈傷組織誘導生根。

2.2 四季秋海棠遺傳轉化體系條件篩選

54組不同遺傳轉化條件組合結果表明（見表2），預培養2 d，共培養4 d，侵染液濃度OD600=0.7，侵染時間為10 min 時，可獲得成苗數為18，陽性率為11.1%。當預培養與侵染時間較長分別為3 d 與12、14 min時，陽性率均為0。為進一步提升遺傳轉化效率，在組合22 基礎上縮短預培養和侵染時間設置后3組試驗。由表2可知，預培養1 d，共培養4 d，侵染濃度OD600=0.7，侵染時間為8 min時，成苗數為17，陽性率較高為58.8%。從葉片外植體初代培養到誘導愈傷組織需30 d，繼代培養15~20 d后愈傷組織分化產生大量不定芽，將不定芽移至生根培養基后需10 d生根，待2周后生根數量達到一定程度即可移栽培養（見圖2）。

表2 遺傳轉化體系不同條件組合篩選Table 2 Combination screening of genetic transformation system under different conditions

圖2 農桿菌介導四季秋海棠遺傳轉化過程Fig.2 Agrobacterium-mediated genetic transformation process of B.semperflorens

2.3 轉基因植株分子鑒定

對轉化試驗中獲得的兩批攜帶Kan抗性再生植株及野生型植株分別提取葉片DNA，以BsRbohD基因鑒定引物（即載體一端引物pCanG-F和目的基因一端引物BsRbohD-R）作PCR 擴增檢測，其中第一批共檢測再生植株18 株，第二批共檢測再生植株17株。轉基因植株共有12株擴增出與陽性質粒一致的條帶，非轉基因植株與野生型植株均未擴增出條帶（見圖3）。將PCR擴增條帶正確產物送至河南尚亞生物技術有限公司測序，序列比對正確，表明目的基因BsRbohD已整合至四季秋海棠基因組。

圖3 轉BsRbohD基因四季秋海棠幼苗DNA分子水平鑒定Fig.3 DNA molecular level identification of B.semperflorens seedlings with BsRbohD gene

為進一步檢測目的基因BsRbohD在四季秋海棠轉化植株中是否轉錄，對上述兩批轉基因陽性植株與野生型植株作半定量PCR 分析。內參基因Bs18S在轉基因陽性植株與野生型植株中均表達，而使用特異性引物（載體一端引物pCanG-F和目的基因一端引物BsRbohD-R）檢測時，轉基因陽性植株均擴增出亮度不一的目標條帶，野生型植株均未擴增出條帶（見圖4）。表明目的基因BsRbohD在四季秋海棠轉化植株中轉錄表達。

圖4 轉基因四季秋海棠BsRbohD半定量PCR檢測Fig.4 Semi-quantitative PCR detection of BsRbohD in transgenic B.semperflorens

以野生型植株基因表達水平為對照，將12 株轉基因陽性植株與野生型植株作實時熒光定量PCR分析。轉基因陽性植株BsRbohD基因表達水平均高于野生型植株，為野生型植株5.38~57.74 倍（見圖5）。表明BsRbohD基因已轉入四季秋海棠并穩定表達，可用于后續試驗。至此，農桿菌介導四季秋海棠遺傳轉化體系已成功建立。

圖5 轉基因四季秋海棠BsRbohD熒光定量PCR檢測Fig.5 Fluorescence quantitative PCR detection of BsRbohD in transgenic B.semperflorens

2.4 轉pCanG-EGFP空載體植株獲得

為排除載體對受體植物正常生命活動的影響，驗證穩定遺傳轉化體系、檢測轉化效率并創建多種植物材料資源以利后續研究，通過農桿菌介導將pCanG-EGFP 空載體轉化四季秋海棠，經歷預培養、共培養、過渡培養、篩選生根和煉苗移栽等過程獲得再生植株。以再生植株葉片總DNA 為模板，以EGFP-F/R為引物作PCR擴增檢測，可擴增出相應片段8株，表明此pCanG-EGFP空載體已成功轉入四季秋海棠基因組（見圖6）。

圖6 轉pCanG-EGFP四季秋海棠幼苗DNA分子水平鑒定Fig.6 DNA molecular level identification of B.semperflorens seedlings transferred to pCanG-EGFP

3 討 論

秋海棠屬植物遺傳轉化受多種因素聯合制約，影響農桿菌介導的四季秋海棠遺傳轉化效率因素主要包含以下方面：無菌苗狀態、外植體類型、抗生素類型及配比、侵染液濃度及侵染、預培養、共培養時間等。

選擇合適外植體用于基因轉化是成功建立遺傳轉化體系前提，合適外植體需穩定高效的再生能力。不同植物品種、組織、器官之間分化能力具有較大差異，通常需選擇處于生長初期或盛期植株幼嫩部位，此時外植體處于分裂旺盛期，再生能力強，更易于外源基因轉化及再生植株培養[16]。秋海棠屬植物離體和再生培養相對容易，目前用于其轉化的受體體系有葉片、葉柄、芽尖、花梗、花瓣、花粉及嫩莖等。四季秋海棠主要以葉片為外植體，也有用莖段[17]。Aswathy 等研究表明，馬拉巴爾秋海棠葉片外植體較莖段外植體愈傷組織產量更為顯著[6]；陳英轉等研究表明，以盾葉秋海棠葉片作為外植體建立高效繁育離體再生體系，再生植株移栽成活率可達90.63%以上[18]；Hirutani 等以四季秋海棠葉片為外植體成功實現植株再生與遺傳轉化[19]。從植物細胞全能性看，無論選取植物體哪一部分作為外植體均可誘導出完整植株，但誘導效果不同[20]。本試驗在前人研究基礎上，最終選擇葉片作為誘導再生植株外植體。因四季秋海棠含水量較大，在菌液侵染過程中較易失水萎蔫，此時生長狀態良好葉片外植體抵抗力相對較強，經侵染等過程后存活率更高。

在植物遺傳轉化過程中，需兩種類型抗生素，分別作為抑制農桿菌生長的抑菌劑和篩選轉化體的篩選劑，抗生素種類選擇和配比是遺傳轉化體系建立關鍵環節。本研究中抑菌劑選擇400 mg·L-1Carb，且經后期試驗可知其抑菌效果較好且無害于愈傷組織誘導生根。篩選劑由轉基因植株所攜帶的載體抗性決定，本試驗選擇目前植物基因工程中最早廣泛使用的Kan，其濃度確定對抗性芽篩選發揮關鍵作用[21]。四季秋海棠對不同篩選劑敏感性具有差異，課題組前期遺傳轉化選用的載體抗性是潮霉素（Hygromycin，Hyg），是一種較強的細胞生長篩選劑，對四季秋海棠葉片產生高毒性，外植體在Hyg抗性篩選培養基上約15 d完全褐化死亡。本試驗在更換載體后選用Kan作為篩選劑，25 mg·L-1及以上濃度Kan抑制愈傷組織不定芽分化，因此選擇25 mg·L-1作為抗生素篩選最適濃度。

預培養與共培養時間對植物遺傳轉化效率具有一定影響。研究表明，預培養有利于外植體在切口處形成微愈傷，改變其生理生化狀態，促進植物組織細胞結合并連接外源基因，提高農桿菌轉化率。有部分研究認為，一些外植體遺傳轉化時無需預培養[22]。共培養為農桿菌提供合適生存環境，增加外植體與農桿菌接觸，促使目的基因與受體基因組整合。共培養時間過短將導致農桿菌活化程度低，不利于外源基因整合；共培養時間過長導致農桿菌迅速繁殖，阻礙植物吸取養分從而抑菌困難或死亡[23]。本試驗探討不同預培養與共培養時間對遺傳轉化效率的影響，預培養時間為1 d、共培養時間為4 d時，遺傳轉化效果優。

農桿菌侵染液濃度和侵染時間也是遺傳轉化體系建立關鍵因素。如侵染液濃度過低，與外植體接觸的菌液量就減少，致使轉化效率降低；侵染液濃度過高，農桿菌細胞內部將產生相互拮抗使其無法生長轉化。侵染時間是外植體含農桿菌數量的關鍵因素，侵染時間過短導致基因整合概率降低而無法獲得轉基因植株；侵染時間過長，外植體由于菌液持續侵害而失去分化能力，抑菌能力弱，降低轉化效率。在選擇農桿菌合適制備與應用方法的前提下，保證農桿菌侵染效率又避免農桿菌污染[24-25]。農桿菌菌液OD600=0.7、侵染時間8 min為最佳轉化條件。

4 結 論

隨著現代生物技術發展，穩定高效的植物再生和遺傳轉化體系的建立將克服在植物中開展基因工程研究的主要障礙，對闡明植物觀賞性狀分子機制和應用基因組編輯技術不可或缺。更為轉基因技術體系應用于遺傳學、基因組學與基因整合探析，將帶來植物遺傳學研究的革命。實現跨物種植物遺傳轉化體系的標準化與精簡化將成為植物分子生物學進程推進的關鍵[26-27]。

本研究利用農桿菌介導法將四季秋海棠BsRbo?hD外源目的基因導入葉片外植體，對四季秋海棠‘超奧’品種進行一系列遺傳轉化過程探索。分別從預培養時間、侵染液濃度、侵染時間和共培養時間4個方面確立最佳轉化條件，通過轉基因植株分子鑒定獲得12 株轉基因陽性植株及8 株空載體植株。其中轉基因陽性植株最高陽性率為58.8%，BsRbohD基因已轉入四季秋海棠并穩定表達；轉空載體植株的成功獲得表明轉染質粒對受體植物細胞無影響，表明該體系可用于四季秋海棠穩定遺傳轉化。未來可通過多種生物學技術確定受體材料最佳處理時期以獲得更加穩定高效的遺傳轉化率[28]，并借由四季秋海棠遺傳轉化體系深入構筑BsRbohD等基因分子調控網絡。