耐鹽解磷菌篩選鑒定及生理特性研究

王宏燕，韓凱鑫，馮麗榮，于志鵬，王 露，范金霞，章圣龍，孫 巖

（1.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江國宏節能環保有限公司，哈爾濱 150000；3.東北農業大學工程學院，農業農村部生豬養殖設施工程重點實驗室，哈爾濱 150030）

我國農耕土壤鹽堿化面積逐步升高[1]。隨著人口增長和土壤退化，人均耕地面積減少，鹽堿地改良至關重要?？屯粮牧?、灌溉排水和添加改良劑等傳統的改良鹽堿地方式成本較高，實效性低，易造成土壤二次污染，破壞生態環境。微生物改良鹽堿地節約能源、改良效果佳、持久性較強，保護土壤環境。在鹽堿土壤中，高濃度鹽基離子通過吸附作用降低土壤有效磷活性，導致磷元素脅迫性，作物對磷肥利用率僅為5%~25%[2]。解磷菌代謝產物通常包含較多有機酸，其分泌降低植物根際土壤pH，將難溶性磷酸鹽轉化為可溶性磷供植物吸收利用，促進植物生長，改善土壤環境。

國內外關于微生物菌劑改良鹽堿土，促進植物生長已有大量研究。目前，篩選耐鹽堿解磷菌主要有單胞菌屬、假單胞菌屬及芽孢桿菌屬等。逄煥成等研究表明，施加微生物菌劑降低鹽堿土含鹽量和pH，增加土壤速效氮、速效磷、速效鉀含量，表明微生物改良鹽堿土具有可行性[3]。Wang等研究表明，在NaCl 脅迫下，接種芽孢桿菌（Ba?cillussp.）明顯增加作物產量[4]。Sahay 等在鹽堿土中，使用3株耐鹽堿解磷菌接種萬壽菊，均不同程度促進萬壽菊生長，促進萬壽菊對磷的吸收，增加土壤酶活性，改善鹽堿土土壤性質[5]。Tripathi等研究表明，土壤鹽堿度在較大程度上影響微生物群落及其活性[6]。Naz 等從巴基斯坦凱沃拉鹽場分離3 株具有解磷能力的假單胞菌（Pseudomonas），3株菌均具有分泌生長素（IAA）、赤霉素（GA）、反式玉米蛋白核苷（t-zr）和脫落酸（ABA）能力[7]。Nautiyal 等從鹽堿土中分離出10% NaCl 濃度，pH 12 條件下可生長的解磷細菌，表明產酸促進磷酸鹽增溶[8]。我國鹽堿土壤中分離得到多種解磷菌。張巍等從松嫩平原地區鹽堿土中分離出2株耐鹽堿解磷菌[9]。胡山等從河西走廊鹽堿土中篩選得到一株高效解磷菌，研究發現菌株容磷量和pH呈顯著負相關[10]。李學平等從黃河三角洲鹽堿土中分離篩選出一株解磷菌[11]。趙飛等從濱海鹽堿土中篩選到具有溶磷能力的鱗質霉菌（Apophysomycessp.）[12]。劉長霞等從濱海鹽堿土壤中分離得到一株在10%NaCl鹽分濃度條件下仍有較好解磷能力的真菌[13]。Zhu等從中國黃海岸大橋鹽場分離得到嗜鹽解磷細菌（Kushneriasp.），在20% NaCl 鹽分濃度，pH 4~10條件下仍正常生長[14]。鹽堿環境中可存活微生物可提高鹽堿土壤中難溶性磷利用率，促進植物生長。目前，東北地區蘇打鹽堿土主要通過物理灌溉、石膏和生物炭改良，對耐鹽堿解磷菌研究和應用較少。

本試驗從鹽堿土中篩選高效解磷菌株，觀察篩選菌株菌落形態，研究菌株生理特性并對菌種作分子生物學鑒定，測定菌株溶磷能力、培養液pH 及菌株生長量變化，分析菌株解磷能力與溶液pH 和菌株生長量之間相關性，測定菌株分泌IAA、胞外多糖和產酸能力及菌株對種子萌發的促生效果，測定菌株耐鹽堿能力，以期為耐鹽堿解磷微生物菌肥研發提供菌種資源，克服外源菌劑在鹽堿土壤中存活率低的現狀，為鹽堿土地改良作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品取自黑龍江省齊齊哈爾市甘南縣雙河農場鹽堿土壤（含鹽量：1.54 g·kg-1；pH：9.23），采樣深度15~20 cm，將采集土壤樣品立即放入無菌塑料袋中，封口，放于實驗室內4 ℃冰箱保存，用于篩選解無機磷細菌。

1.1.2 培養基

①蒙金娜無機磷培養基（Pikovskaya's medi?um，以下簡稱“PVK 培養基”）：葡萄糖10.00 g，（NH4）2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25.00 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH至7.0。

②LB 培養基：溶菌肉湯培養基（Luria-Ber?tani；以下簡稱“LB培養基”）：胰蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，NaCl 10.00 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH至7.0。

培養基配方為液體培養基，在以上配方內加入20 g瓊脂即為固體培養基。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌初篩

稱取10 g采集土壤，放入含有90 mL無菌水滅菌三角瓶中，于恒溫振蕩培養箱中30 ℃，180 r·min-1培養20 min后靜置30 min，其上清液即為10-1g·mL-1土壤稀釋液，采用10 倍系列稀釋，分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8g·mL-1土壤懸液，吸取0.1 mL 懸液涂布至PVK 固體平板培養基上，30 ℃培養5 d。用已滅菌接種環挑取固態平板中有明顯透明圈的單菌落，在PVK 固體平板培養基上劃線作純化培養，依次重復此操作5 次以上，直至固體平板上生長為單菌落，結束純化。將已純化菌株接種于LB 斜面培養基中，放于4 ℃冰箱保存。

將已分離純化單株解磷菌接種于PVK液體培養基中，置于30 ℃恒溫培養箱培養24 h，無菌水調節所有菌株菌懸液一致（均為1×108CFU·mL-1），吸取20 μL 菌懸液，接種于PVK 固體平板培養基中央，倒置于30 ℃恒溫培養箱中培養5 d，每個菌株進行3次重復處理。5 d后，測定菌株菌落直徑（D）及其形成的溶磷圈直徑（d），計算溶磷指數（Phosphate solubilizing index，PSI）[15]。

式中，PSI-溶磷指數；D-菌落直徑（cm）；d-溶磷菌圈直徑（cm）。

1.2.2 解磷菌株復篩

挑取初篩得到菌株，將其接種于已滅菌有LB液體培養基的250 mL 三角瓶中，于恒溫振蕩培養箱中30 ℃、180 r·min-1培養24 h獲得接種液，稀釋菌株OD600為1.0；按照1%接種量接種至PVK 液體培養基（調節pH 為7.0）中，于恒溫振蕩培養箱中30 ℃、180 r·min-1條件下培養5 d，采用鉬銻抗比色法測定菌株溶磷量[16]，最終確定高效穩定的解磷菌株。

1.2.3 解磷菌株鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》中試驗方法對菌株進行葡萄糖、蔗糖利用、氧化酶試驗、VP 試驗、MR 試驗、硫化氫產生試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、精氨酸雙水解酶試驗和賴氨酸脫羧酶試驗[17]。通過透視電鏡和16S rRNA 序列分析法進行菌株形態學觀察和分子生物學鑒定。

1.2.4 解磷菌解磷能力、pH、菌體生長量測定

將分離菌株接入LB 培養基中進行活化，無菌水稀釋菌株OD600為1.0，按1%接種量接入PVK 液體培養基中，對照組接入等量無菌水，于恒溫振蕩培養箱中30 ℃、180 r·min-1培養168 h。從培養開始每間隔24 h 取樣一次，分別測定菌株生長量（OD600）和溶磷量及培養液pH。采用鉬銻抗比色法測定菌株溶磷量。

1.2.5 解磷菌株分泌生長因子特性

①IAA 含量測定：采用Sackowski 比色法測定菌株分泌IAA 能力[18]。將菌株接種于LB 液體培養基（含L-色氨酸）中，于恒溫振蕩培養箱中30 ℃、180 r·min-1培養3 d，3次重復試驗，無菌水調節菌懸液OD600為1.0。取菌株懸液置于離心管中，之后于高速離心機4 000 r·min-1離心10 min。吸取2 mL上清液于試管中，加入等量Sackowski 顯色劑，搖勻，避光靜置30 min，測定OD530分光光度值計算菌株分泌IAA含量。

②菌株分泌胞外多糖能力測定：采用苯酚-硫酸法[19]。將菌株接種至LB 液體培養基中，于恒溫振蕩培養箱中30 ℃、180 r·min-1培養3 d，之后用無菌水調節菌懸液OD600為1.0，于高速離心機中4 500 r·min-1離心15 min，加入80%三氯乙酸于上清液中使其濃度為4%，4 ℃靜置24 h，于高速離心機中10 000 r·min-1離心20 min，用等量去離子水溶解收集紅色沉淀，透析得到粗多糖。吸取粗多糖溶液1 mL，之后加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸，混合均勻，20 min 后于波長490 nm 處測定吸光度值，計算菌株分泌多糖含量。

③菌株產酸能力測定：采用高效液相色譜法測定菌株產有機酸能力[20]。將菌株接種于LB 液體培養基中，于恒溫振蕩培養箱中30 ℃、180 r·min-1培養3 d，無菌水調節菌懸液OD600為1.0。將其置于高速離心機中10 000 r·min-1離心10 min，之后吸取上清液過0.22 μm 濾膜后上機。液相色譜柱為SVEA AQ 柱；檢測器為DAD；柱溫設置為40 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.5 mL·min-1；波長設置為210 nm；流動相使用10 mmol·L-1K2HPO4（pH=2.55）。測定菌株產甲酸、丙酸、丁酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸含量。

④植株出芽率及芽長測定方法

菌株菌懸液配制：將菌株接種到LB 液體培養液中，30 ℃，180 r·min-1，恒溫搖床培育3 d；菌懸液在4 000 r·min-1下離心15 min。取離心前發酵液（無菌水稀釋活菌密度為1×109CFU·mL-1），離心后上清液及用無菌水稀釋底部菌體（無菌水稀釋活菌密度為1×109CFU·mL-1），備用。

供試白菜型油菜種子處理：篩選大小相同種子若干粒，乙醇浸泡1 min消毒后，繼續將其浸泡于5%次氯酸鈉溶液中2 min作消毒處理，無菌水沖洗3~4次，將沖洗的種子置于滅菌濾紙上作干燥處理（所有操作保持無菌處理）。

發芽試驗：將經消毒處理的白菜型油菜種子分別用上述發酵液、上清液和菌液浸泡6 h，以無菌水處理作為對照（CK）。將浸泡的白菜型油菜種子放在置于底部鋪有雙層滅菌濾紙培養皿中，每皿隨機放入20 粒種子，重復3 次，并在種子上覆蓋一層濾紙，用無菌水潤濕濾紙，置于30 ℃生化培養箱中培養7 d，每天澆適量水（每皿水量保持一致），在4 d 后測定種子發芽勢，7 d 后，測定種子芽長，統計種子發芽率。

1.2.6 解磷菌株耐鹽堿試驗

耐鹽試驗：按照沈萍等方法測定耐鹽性[21]。將菌株接種于LB 液體培養基中培養種子液，無菌水調節菌液OD600值為1.0，然后按1%接種量接種到含有不同NaCl濃度梯度（5%、8%、10%）PVK液體培養基中，在30 ℃、180 r·min-1振蕩培養箱中培養5 d，測定菌株OD600及其溶磷量。

耐堿試驗：按照潘媛媛等方法測定耐堿性[22]。將菌株接種于LB 液體培養基中培養種子液，使用無菌水調節菌液OD600值為1.0，然后按1%接種量接種到含有不同pH（pH=8、9、10）PVK 培養基中，在30 ℃、180 r·min-1振蕩培養箱中培養5 d，測定菌株OD600及其溶磷量。

1.2.7 數據統計處理與分析

利 用SPSS 21.0、Microsoft Office 2016 和ORI?GIN2019對數據進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 解磷菌分離篩選

經初步分離純化，得到53 株可在PVK 固體平板上生長菌株。溶磷指數（PSI）是判斷菌株溶磷能力的指標，PSI值越大，其溶磷能力越強。根據平板法，將分離純化的菌株單菌落培養，篩選出4株溶磷能力較好菌株。根據公式計算初篩4 株菌的PSI，結果見表1。其中PSI最大菌株是P-W13，為2.06，P-K21、P-X24 和P-H10 的PSI 分 別 為1.68、1.62、1.56。測定這4 株菌在發酵上清液中的溶磷量進行復篩，結果如表1所示，解磷能力較強的是P-W13，溶磷量為86.23 mg·L-1；其余處理溶磷量分別為84.87、62.29、81.99 mg·L-1（均小于86.23 mg·L-1）。

表1 解磷菌篩選結果Table 1 Screening results of phosphate solubilizing bacteria

2.2 菌種形態學和分子生物學鑒定

解磷細菌P-W13 菌落形態及透射電鏡圖片如圖1 所示。觀察其形態，發現菌株P-W13 在平板上呈圓形、光滑、半透明、白色、邊緣整齊的菌落（見圖1A）。圖1B為菌株電鏡圖，觀察發現，PW13 菌體細胞多呈桿狀、末端較方；成短鏈；無莢膜、菌落大、扁平。

圖1 解磷菌株P-W13菌落形態及其透射電鏡圖Fig.1 Colony morphology and transmission electron microscopy of strain P-W13

菌株可利用葡萄糖、蔗糖為碳源。甲基紅、明膠液化、硝酸鹽還原及精氨酸雙水解酶試驗均為陽性，氧化酶、V-P、硫化氫產生及賴氨酸脫羧酶試驗均為陰性。

解磷細菌P-W13 分子生物學鑒定結果表明，提取P-W13 基因序列與GenBank 中近緣種序列進行同源性比對，選取相似度最高的幾株菌序列利用MEGA 進行同源性對比并構建系統發育樹，如圖2 所示。菌株P-W13 基因序列與LC415612（En?terobacter asbburiaeM4-VN）、MW429195（Entero?bactersp. strainLAM2022）和MH169128（Enterobac?ter cloacaestrain NP07）親緣關系最近，可確定菌株P-W13為腸桿菌屬（Enterobactersp.）。

圖2 解磷菌株P-W13同源性分析Fig.2 Homological analysis of phosphate-solubilizing strain P-W13

2.3 解磷細菌P-W13解磷能力分析

解磷細菌P-W13 在解磷液體培養基中連續培養168 h，結果如圖3A 所示，對照組溶磷量變化較小，保持在0.67~0.68 mg·L-1，解磷細菌P-W13有較好解磷能力，P-W13 溶磷量隨培養時間增加，溶磷量增加，在72~120 h 溶磷量增加較為明顯，隨時間增加，在第144 h表現出最大溶磷量89.86 mg·L-1，之后，溶磷量開始下降。解磷細菌P-W13結果表明，該菌株在144 h時達到最優解磷能力。

圖3 解磷細菌P-W13在168 h內溶磷量、pH和OD600變化Fig.3 Changes of dissolved phosphorus amount,pH and OD600 of P-W13 in 168 h

如圖3B 所示，培養168 h 內，對照組pH 保持在7.0左右，無明顯變化；解磷細菌P-W13培養液pH 呈逐漸下降趨勢，解磷細菌P-W13 培養24 h后，培養液pH已降至6.15，培養液pH和培養時間呈負相關，培養168 h后，培養液pH降至4.80。隨培養時間增加，解磷細菌P-W13 生長量呈上升趨勢，在144 h時增至最大值（OD600為2.23），之后隨培養時間增加，解磷細菌P-W13 生長量逐步降低。解磷細菌P-W13 解磷能力在第144 h 達到最強，表明解磷細菌P-W13 解磷能力與其生長狀況一致。

2.4 解磷過程中溶液pH、菌體生長量變化

如圖4A所示，將解磷細菌P-W13溶磷量與培養液pH 進行相關性分析，結果發現兩者存在極顯著負相關（R2=0.776，P<0.01）。如圖4B所示，將解磷細菌P-W13溶磷量與其生長量OD600進行相關性分析，結果表明兩者存在極顯著正相關（R2=0.918，P<0.01）。

圖4 菌株溶磷量和培養液pH、菌株OD600相關性分析Fig.4 Correlation analysis of dissolved phosphorus amount with pH of medium and OD600 of strain

2.5 解磷菌株分泌生長因子

如表2所示，解磷細菌P-W13分泌IAA含量和胞外多糖，含量分別為42.01 和72.55 mg·L-1。同時，細菌P-W13 能產生富馬酸、丁二酸和丙酸，其分泌丙酸含量最高，為1518.2 mg·L-1，分泌富馬酸和丁二酸含量分別為386.2 和94.2 mg·L-1。菌株P-W13 具有分泌胞外多糖的能力，研究發現，具有分泌胞外多糖的菌株分泌的有些多糖類物質具有吸收無機鹽作用，對鹽堿地改良促進作用明顯[23]。不同解磷細菌同時分泌多種有機酸降低土壤pH，提高磷利用率，但不同菌株分泌有機酸的種類和含量之間存在差異。解磷細菌P-W13 具有分泌富馬酸、丁二酸和丙酸能力，其他研究中產生這些有機酸的報道較少。初步判斷菌株P-W13 通過分泌有機酸降低pH從而溶解無機磷，提高溶磷量。

表2 解磷細菌P-W13分泌生長因子含量Table 2 Growth factors content secreted by P-W13

解磷細菌P-W13 不同處理下對白菜型油菜種子促生長能力如表3 所示。與CK 相比，經菌株P-W13 發酵液、上清液和菌體處理后的白菜型油菜種子其發芽率、根長、芽長均比未經處理的白菜型油菜種子高，其中菌株P-W13 上清液可顯著提高種子發芽率、芽長和根長，上清液相比對照發芽率、芽長和根長分別提高6.06%、35.97%和28.52%；P-W13 菌體也可促進種子萌發，菌體處理組與對照相比發芽率、芽長和根長分別提高18.18%、17.99%和28.52%；經菌株P-W13發酵液處理的種子發芽率、芽長、根長相比對照分別提高5.68%、68.35%、94.10%。菌株P-W13 發酵液對番茄種子促生作用顯著。

表3 解磷細菌P-W13對白菜型油菜發芽勢、發芽率、芽長和根長的影響Table 3 Effects of phosphorus solution-bacteria P-W13 on germination potential,germination rate,bud length and root length of Brassica napus L.

2.6 解磷菌株耐鹽堿性能試驗

將解磷細菌P-W13 分別接種于不同含鹽量PVK液體培養基中培養5 d，在5%、8%和10%NaCl鹽分濃度下，解磷細菌P-W13生長正常，菌株生長良好。如圖5所示，隨鹽分濃度升高，菌株生長量逐漸降低。在5%、8%和10%NaCl鹽分濃度下，解磷細菌P-W13溶磷量呈現下降趨勢，其溶磷量分別為74.84、66.32 和57.09 mg·L-1。解磷細菌P-W13在5%NaCl鹽分濃度下生長量和溶磷量均最高。

圖5 解磷菌株P-W13在不同鹽度下溶磷量和光密度變化Fig.5 Changes of dissolved phosphorus amount and OD600 of P-W13 strain at different salinities

根據對NaCl 耐受能力，微生物可分為：非嗜鹽微生物（NaCl 濃度<0.2 mol·L-1）、輕度嗜鹽微生物（NaCl 濃度為0.2~0.5 mol·L-1）、中度嗜鹽微生物（NaCl 濃度為0.2~2.5 mol·L-1）和極端嗜鹽微生物（NaCl 濃度為2.5~5.2 mol·L-1）[24]。解磷細菌P-W13在10%（1.7 mol·L-1）NaCl鹽分濃度下正常生長。在濃度為0.5~2.5 mol·L-1NaCl溶液中菌株統稱為耐鹽菌標準，細菌P-W13屬于耐鹽解磷菌。

將解磷細菌P-W13分別接種于不同pH的PVK液體培養基中培養5 d，在pH 為8、9 和10 時，解磷細菌P-W13 正常生長，菌株生長良好。如圖6所示，隨pH 升高，菌株生長量逐漸降低。pH 為8、9和10時，解磷細菌P-W13溶磷量下降，其溶磷量分別為86.47、74.94 和61.42 mg·L-1。pH 為8時，解磷細菌P-W13生長量和溶磷量均最高。

圖6 解磷菌株P-W13在不同pH下溶磷量和光密度OD600變化Fig.6 Changes of dissolved phosphorus amount and OD600 of P-W13 strain at different pH

根據對pH 耐受能力，微生物可分為：耐堿微生物（pH 7~9 生長，pH>9.5 不能生長）和嗜堿微生物（pH 10~12 生長）[24]。解磷細菌P-W13 在pH達到10時生長。根據在pH 7~12條件下生長的菌株統稱為耐堿菌的標準，細菌P-W13 屬于耐堿解磷菌。

3 討 論

研究表明，細菌P-W13在培養第144 h達到最大溶磷量，之后溶磷量開始下降，賀夢醒等研究解磷菌株B25在第96 h解磷能力達到最大值，之后下降并趨于穩定，與本試驗結果一致[25]。這可能因碳源、氮源等營養物質被消耗及菌體本身生長繁殖受抑制等，導致菌株溶磷量降低。

目前研究中解磷菌數量眾多，解磷過程復雜，解磷機理具有多樣性。目前解磷菌通過直接氧化或者氧化呼吸作用分泌代謝產物或者分泌檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等小分子有機酸降低pH 溶解無機磷是比較常見的途徑[26]。研究表明，在東北黑土和暗黑棕土壤中，細菌分泌草酸、蘋果酸和檸檬酸可使土壤中難溶性磷轉化為可供植物吸收利用的有效磷，提高磷利用效率[24]。Lee 等篩選出分泌乳酸、乙酸和檸檬酸的解磷細菌提高磷的利用效率[27]。Yang等研究表明，菌株分泌草酸顯著溶解難溶性磷[28]。研究發現，菌株分泌葡萄糖酸也提高磷利用效率。檸檬酸在鹽堿化土壤上與土壤表面金屬離子絡合，有效降低離子濃度及其活性，緩解土壤鹽害，為作物提供良好土壤環境；葡萄糖酸與鈣、鋅等金屬離子合成可溶性鹽；草酸可結合堿土金屬元素，降低其溶解性[29-31]。本研究中解磷細菌P-W13具有分泌富馬酸、丁二酸和丙酸的能力，富馬酸有強緩沖作用，降低土壤溶液pH；丁二酸促進植物生長，調節養分、增加抗旱、抗病、抗凍能力；丙酸對黃曲霉、某些好氣性芽孢桿菌、沙門氏菌及酵母菌均有較好抑制作用，可合成酯類及其衍生的中間體，丙酸酯可廣泛用于農藥除草劑、樹脂改性劑、滅菌劑等[32-34]，其他研究中解磷菌產生有機酸的報道較少。初步判斷通過產生有機酸降低pH，隨培養時間增加，解磷細菌P-W13溶磷量和pH 呈極顯著負相關，姜煥煥研究耐鹽堿解磷菌改良鹽堿土效果時發現以磷酸三鈣為磷源的培養基中可溶性磷含量與pH 呈極顯著負相關，分析其原因可能是無機磷溶解作用機制主要是因釋放低分子質量有機酸，降低培養液pH[24]。這與本研究解磷細菌P-W13溶磷量與pH呈極顯著負相關一致。培養液介質pH 降低是溶解無機磷的重要條件，但不是必須有酸產生才溶解無機磷。賀夢醒等研究發現具有解磷功能芽孢桿菌的解磷能力與培養液pH 之間存在相關性[25]，但并未達到顯著水平，可能在培養過程中解磷菌除分泌低分子有機酸降低pH 溶解難溶性磷之外，還存在其他解磷機理，有待深入研究。

胞外多糖屬于微生物次級代謝產物，對作物根際具有保護作用。李文謙等研究菌株分泌胞外多糖含量是54.2 mg·L-1[35]。本文研究解磷菌株P-W13 分泌胞外多糖含量為72.55 mg·L-1，其分泌胞外多糖能力較優。Rojas-Tapias 等研究發現，在鹽堿土壤中，接種菌劑后玉米與對照相比，接種菌劑的玉米生長效果更優，與菌株能分泌胞外多糖相關[36]。研究表明，分泌胞外多糖的微生物與金屬離子復合，抑制難溶性磷酸鹽形成，提高磷利用率[37]。因此，具有分泌胞外多糖特性的解磷菌株增加可利用磷含量，提高磷酸三鈣溶解率。

IAA 屬于植物生長調節劑，對植物細胞分裂、伸長、分化和種子萌發等方面具有重要作用。姜煥煥研究解磷菌TPM26分泌IAA含量為11.6 mg·L-1[24]。本研究表明，土壤中解磷細菌P-W13 分泌IAA 含量為41.67 mg·L-1。菌株發酵液、上清液及菌體在白菜型油菜發芽試驗中，經菌株處理的白菜型油菜種子發芽勢、根長、芽長及發芽率均提高，其中菌株P-W13發酵液處理對白菜型油菜種子促生顯著，其種子發芽率、芽長、根長相比對照分別提高5.68%、68.35%、94.10%。姜煥煥研究中發現分泌IAA 菌 株TPM26 促 進 花 生 種 子 萌 發[24]。Bahadur 等研究解磷菌株分泌IAA并促進根長增加，提高營養元素利用率，促進植物在鹽堿土中生長[38]。王向英等研究解磷菌株對玉米生長具有顯著促進效果，表明分泌IAA的解磷菌株能夠促進植物生長[39]。

后續將探究溫度對篩選菌株溶磷能力的影響。將本文篩選得到的菌株，接種至鹽堿土后測定土壤細菌群落結構和理化性質變化，分析接種菌劑對細菌群落結構的影響，探究菌株對改良鹽堿土壤的效果，以期為高效耐鹽堿解磷微生物菌肥研發提供優良微生物菌種資源。

4 結 論

a.從鹽堿土壤中篩選得到一株解磷細菌P-W13，觀察菌落形態和經16S rRNA 序列對比，該菌株屬于腸桿菌（Enterobactersp.）。

b. 細菌P-W13 在第6 天達到最大溶磷量89.86 mg·L-1，其溶磷量與溶液pH、OD 之間均存在顯著相關性。

c.細菌P-W13 在5% NaCl 鹽分濃度和pH 為8時解磷能力最強，在10%NaCl鹽分濃度和pH為10時仍表現出較好的解磷能力，細菌P-W13 具有較強耐鹽堿性，屬于耐鹽堿解磷菌。

d.菌株P-W13具有分泌IAA的能力，產生IAA含量為42.10 mg·L-1；其分泌胞外多糖含量為72.55 mg·L-1；同時產生富馬酸、丁二酸和丙酸，其產生丙酸含量最高，為1 518.2 mg·L-1；產生富馬酸和丁二酸含量分別為386.2 和94.2 mg·L-1；經菌株P-W13 處理后的白菜型油菜種子其發芽率、根長、芽長均有提高，且菌種發酵液促生效果優于上清液。