氟西汀對Aβ25-35誘導小膠質細胞NLRP3炎性小體活化及細胞焦亡的影響

馬曉涵 韓濱 高凡 遲松

［摘要］ 目的 探討氟西汀對β－淀粉樣蛋白25－35（Aβ25－35）誘導的BV2小膠質細胞炎性反應的作用及機制。

方法 應用Aβ25－35刺激BV2細胞模擬阿爾茨海默?。ˋD）的炎性環境。實驗分為空白對照組、Aβ25－35組、Aβ25－35+不同濃度氟西汀組和Aβ25－35+雙硫侖組。采用CCK8法檢測細胞活力，通過乳酸脫氫酶（LDH）實驗、Annexin V－FITC/PI雙染色及透射電子顯微鏡評估細胞焦亡水平。采用Western blot法檢測核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1）、活化半胱氨酸蛋白酶－1（cleaved－caspase－1）、膜穿孔蛋白D（GSDMD）等炎性小體及焦亡相關蛋白的表達，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定促炎因子白細胞介素1β（IL－1β）和白細胞介素18（IL－18）的表達，DCFH－DA熒光染色法檢測活性氧（ROS）的水平。

結果

與空白對照組相比，Aβ25－35組的細胞活力降低，NLRP3炎性小體和焦亡相關因子（NLRP3、ASC、caspase－1、cleaved－caspase－1、GSDMD、IL－1β、IL－18）的表達明顯增加，LDH釋放量及細胞焦亡比例升高，細胞內ROS的生成增多，差異均有顯著性（F=2.787～30.457，P＜0.05）；與Aβ25－35組相比，經不同濃度氟西汀預處理的細胞存活率明顯增高，促炎因子IL－1β、IL－18表達明顯減少，炎性小體及焦亡相關蛋白的表達下調，LDH的釋放量和細胞焦亡比例降低，ROS的生成明顯減少，其中以高劑量（20 μmol/L）氟西汀的作用最為顯著。

結論 氟西汀可抑制Aβ25－35誘導的BV2細胞ROS生成、NLRP3炎性小體活化和細胞焦亡，這為延緩AD進展提供了新的治療思路。

［關鍵詞］ 氟西??；小神經膠質細胞；細胞焦亡；NLR家族，熱蛋白結構域包含蛋白3；淀粉樣β肽類；阿爾茨海默病

［中圖分類號］ R338.2；R976

［文獻標志碼］ A

［KEY WORDS］ fluoxetine; microglia; pyroptosis; NLR family， pyrin domain－containing 3 protein; amyloid beta－peptides; Alzheimer disease

阿爾茨海默?。ˋD）是一種以進行性認知障礙、記憶減退和精神行為癥狀為主要臨床特征的神經退行性疾病，其致殘率高，病程較長，目前尚無有效的防治策略。AD的發病機制存在多種假說，其中β－淀粉樣蛋白（Aβ）激活小膠質細胞的炎癥反應被認為在AD的發病過程中起著關鍵作用。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體是由NLRP3受體、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1）組成的多蛋白復合體，在中樞神經系統中主要表達于小膠質細胞。研究表明，NLRP3 炎性小體可被Aβ激活，進而促進Aβ的沉積和微管蛋白tau 的過度磷酸化。此外，NLRP3 炎性小體的激活能夠觸發小膠質細胞的焦亡，這是一種新的程序性的細胞死亡形式，表現為細胞不斷腫脹直至細胞膜破裂，釋放大量炎性遞質，加劇神經炎癥反應。

氟西汀是一種選擇性的5－羥色胺再攝取抑制劑，在臨床上廣泛應用于抑郁癥的治療。最近的研究發現，氟西汀能夠通過抗炎、抗氧化應激發揮神經保護作用。在抑郁動物模型中，氟西汀能通過下調 NLRP3 信號通路抑制小膠質細胞的活化和炎性因子的分泌。盡管研究發現抗抑郁藥的長期應用能夠降低AD 罹患風險并改善認知能力，但是氟西汀能否抑制AD環境下小膠質細胞焦亡和神經炎癥目前尚無報道。本研究使用Aβ25－35刺激 BV2 小膠質細胞模擬AD炎性環境，以NLRP3炎性小體與細胞焦亡為切入點，探討氟西汀對AD的保護作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

永生系小鼠BV2小膠質細胞購于武漢普諾賽公司。氟西汀購于美國Sigma公司。Aβ25－35、雙硫侖和CCK8檢測試劑盒購于美國MCE公司；胎牛血清、青鏈霉素混合液以及MEM培養液購自武漢普諾賽公司；BCA蛋白檢測試劑盒、Annexin V－FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、白細胞介素1β（IL－1β）及白細胞介素18（IL－18）的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自武漢伊萊瑞特公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；PBS緩沖液、RIPA裂解液和DCFH－DA活性氧（ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天公司；ECL試劑盒購于武漢博士德公司；caspase－1抗體購于美國Santa cruz公司；NLRP3、ASC和活化半胱氨酸蛋白酶－1（cleaved－caspase－1）抗體購于美國CST公司；GAPDH和膜穿孔蛋白D（GSDMD）抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 BV2細胞生長于含有體積分數0.10胎牛血清和10 g/L青鏈霉素的MEM培養液中，置于含體積分數0.05 CO2的37 ℃恒溫培養箱內培養24 h后傳代。本研究使用第3～5代的細胞。首先將BV2細胞以每孔大約5×103個細胞的密度種植于96孔板中，用不同濃度的Aβ25－35處理12、24、36、48 h，利用CCK8檢測細胞活力，獲得Aβ25－35最佳處理濃度（20 μmol/L）和時間（24 h）。實驗分為以下6組：空白對照組（A組），Aβ25－35組（B組），Aβ25－35+小劑量（5 μmol/L）氟西汀組（C組），Aβ25－35+中劑量（濃度10 μmol/L）氟西汀組（D組），Aβ25－35+高劑量（濃度20 μmol/L）氟西汀組（E組），Aβ25－35+雙硫侖（10 μmol/L）組（F組）。除空白對照組外，其他各組用不同濃度的氟西汀或雙硫侖預處理BV2細胞2 h，再加入20 μmol/L的Aβ25－35培養24 h用于后續實驗。

1.2.2 CCK8法檢測細胞活力 將BV2細胞以大約每孔5×103個細胞的密度接種到96孔板中，待其均勻貼壁生長后，用不同濃度的Aβ25－35、氟西汀、雙硫侖進行處理。然后在規定的不同時間點每孔加入10 μL CCK8試劑，在37 ℃下孵育2.5 h。最后用酶標儀測量各組細胞在450 nm波長下的吸光度（A）值，細胞存活率=（實驗孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.2.3 ELISA法檢測細胞上清液中IL－1β和IL－18含量 收集處理好的各組細胞上清液，根據ELISA試劑盒說明書的步驟測定IL－1β和IL－18水平。

1.2.4 LDH釋放量檢測 LDH的釋放反映了細胞質膜完整性的喪失，可間接反映細胞焦亡的程度。收集各組細胞上清液，根據LDH試劑盒說明步驟測定LDH的釋放量。

1.2.5 Annexin V－FITC/PI染色 早期凋亡細胞被Annexin V標記，而焦亡和中晚期凋亡細胞可被Annexin V和PI同時標記，所以Annexin V/PI雙陽性率可作為細胞焦亡比例的間接指標。收集各組細胞后按Annexin V－FITC/PI雙染色凋亡檢測試劑盒說明步驟處理，上流式細胞儀檢測各組細胞Annexin V/PI雙陽性率，使用Flowjo分析數據。

1.2.6 ROS生成的檢測 按照DCFH－DA試劑盒說明步驟處理各組細胞，使用Image J 6.0分析各組熒光強度（細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，ROS含量與熒光顯微鏡下測量的DCF熒光強度呈正比）。

1.2.7 Western blot法檢測炎性小體及焦亡相關蛋白表達 處理好的各組細胞以冷PBS洗滌3次后用細胞刮刀刮下置于離心管中，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min。細胞裂解物于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，取上清（即蛋白樣品）。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。各組蛋白樣品加入5×上樣緩沖液，金屬浴100 ℃煮5 min使蛋白變性。煮好的蛋白按照每孔20 μg上樣，進行SDS－PAGE電泳并濕轉到PVDF膜上，再用體積分數0.05的脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，分別加入NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、caspase－1（1∶500）、cleaved－caspase－1（1∶1 000）、GSDMD（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）抗體，4 ℃過夜。以TBST溶液洗膜3次，分別加入稀釋好的山羊抗兔IgG（1∶5 000）或山羊抗鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1.5 h。以TBST溶液洗膜3次，ECL發光液顯影，掃描后用Image J 6.0分析相應條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算各目標蛋白的相對表達量。

1.2.8 電鏡檢測 各組處理好的細胞以冷PBS洗滌2次后用細胞刮刀刮下置于離心管中進行離心（1 000 r/min，5 min），棄去上清液，將離心管中的細胞團塊置于體積分數0.025的戊二醛固定液（pH 7.3～7.4）中，4 ℃保存，最后用透射電子顯微鏡觀察細胞形態變化。

1.3 統計學分析

所有實驗均獨立重復至少3次，使用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量數據均以±s表示，Aβ25－35對BV2小膠質細胞活力的影響采用析因設計方差分析和Bonferroni法校正，其他的多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 氟西汀對Aβ25－35誘導的BV2細胞活力的影響

析因設計的方差分析結果顯示，Aβ25－35的作用濃度與作用時間都對細胞存活率存在顯著影響，Aβ25－35在10～40 μmol/L濃度范圍內處理BV2細胞24 h后，細胞活力均受到明顯的抑制，其中應用20 μmol/L Aβ25－35時細胞的存活率接近50%，表明該濃度可對細胞造成有效傷害，因此選擇24 h和20 μmol/L作為Aβ25－35的干預時間和干預濃度。見表1。不同濃度氟西汀處理2 h后的細胞活力差異具有統計學意義（F=11.202，P＜0.05），組間兩兩比較，與空白對照組相比，1～20 μmol/L氟西汀對細胞活力影響不明顯（P＞0.05），40和60 μmol/L氟西汀則顯著降低了細胞活力（P＜0.05）（圖1a），因此后續實驗中選擇5、10和20 μmol/L作為氟西汀的治療濃度?？瞻讓φ战M、Aβ25－35組和不同濃度氟西汀預處理組的細胞活力差異具有統計學意義（F=19.664，P＜0.05），兩兩比較結果顯示，10和20 μmol/L氟西汀預處理細胞2 h逆轉了Aβ25－35誘導的細胞活力下降（P＜0.05）（圖1b）。

2.2 氟西汀對Aβ25－35誘導的BV2細胞焦亡的影響

Annexin V－FITC/PI染色結果顯示，20 μmol/L Aβ25－35顯著增加了PI陽性的BV2細胞數量，而不同濃度的氟西汀預處理降低了PI陽性的細胞數量，且呈劑量依賴性（圖2a）。PI陽性細胞的定量分析顯示，各處理組間焦亡程度差異具有統計學意義

（F=35.938，P＜0.01），兩兩比較結果顯示，高劑量（20 μmol/L）的氟西汀能夠顯著降低細胞焦亡比例（P＜0.01）， 但中低劑量的氟西汀對Aβ25－35誘導的細胞焦亡抑制不顯著（P＞0.05）（圖2b）。各處理組間LDH釋放量差異也具有統計學意義（F=6.172，P＜0.05），組間兩兩比較結果顯示，10和20 μmol/L氟西汀預處理降低了Aβ25－35誘導的BV2細胞中LDH的釋放（P＜0.05）（圖2c）。在形態學上，利用透射電鏡可觀察到20 μmol/L Aβ25－35刺激后的BV2細胞出現腫脹變形、細胞膜完整性破壞及大量焦亡小體（空泡變性）等典型的細胞焦亡特征；與Aβ25－35組相比，20 μmol/L氟西汀處理組細胞焦亡緩解，細胞形態變化不明顯（圖2d）。以上結果表明，氟西汀的應用，尤其是高劑量（20 μmol/L）氟西汀可以有效抑制Aβ25－35誘導的BV2細胞焦亡。

2.3 氟西汀對BV2細胞中Aβ25－35誘導的GSDMD表達影響

各處理組間GSDMD蛋白的表達差異具有統計學意義（F=4.001，P＜0.05）；與空白對照組相比較，Aβ25－35組細胞中GSDMD的表達顯著增加（P＜0.01），而20 μmol/L氟西汀和10 μmol/L 雙硫侖（GSDMD特異性拮抗劑）處理后GSDMD蛋白表達均較Aβ25－35組明顯降低（P＜0.05）（圖3a）。此外，雙硫侖對BV2細胞活力影響也具有統計學差異（F=44.778，P＜0.01），其中10 μmol/L雙硫侖能夠逆轉Aβ25－35誘導的BV2細胞活力下降（P＜0.05）和細胞焦亡（圖2a、3b～e）。

2.4 氟西汀對BV2細胞中Aβ25－35誘導的NLRP3炎性小體激活的影響

各處理組間的NLRP3（F=2.787，P＜0.05）、ASC（F=5.832，P＜0.05）、caspase－1（F=3.164，P＜0.05）、cleaved－caspase－1（F=3.145，P＜0.05）蛋白表達比較差異均具有統計學意義。兩兩比較結果顯示，與空白對照組相比，Aβ25－35組上述炎性小體相關蛋白的表達均顯著上調（P＜0.05），但該上調作用在高劑量（20 μmol/L）氟西汀預處理后均得到了抑制（P＜0.05）。見圖4、表2。

2.5 氟西汀對炎性小體相關促炎因子表達影響

各組間IL－1β（F=9.189，P＜0.05）、IL－18（F=6.680，P＜0.05）表達比較差異均有顯著性。兩兩比較結果顯示，與空白對照組相比較，Aβ25－35組細胞上清液中IL－1β、IL－18的含量均顯著增加（P＜0.01），而不同濃度的氟西?。?、10、20 μmol/L）和雙硫侖（10 μmol/L）則抑制了IL－1β和IL－18的表達（P＜0.05）。見表2。

2.6 氟西汀對Aβ25－35誘導的BV2細胞中ROS產生的影響

各處理組間ROS熒光強度比較差異具有顯著性（F=15.159，P＜0.05）。兩兩比較結果顯示，與空白對照組相比，Aβ25－35組ROS熒光強度明顯增強（P＜0.01）；而不同濃度的氟西汀均抑制了Aβ25－35誘導的ROS的生成，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；但10 μmol/L雙硫侖處理組與Aβ25－35組相比，差異無顯著性（P＞0.05）。見圖5、表2。

3 討論

研究發現，氟西汀能夠在多種疾病中通過抑制NLRP3炎性小體活化進而減輕神經炎癥反應并改善神經功能，如抑郁癥、腦損傷和萎縮性黃斑變性。本研究結果證實，Aβ25－35能夠誘導BV2細胞NLRP3炎性小體的激活和細胞焦亡，促進炎性細胞因子IL－1β和IL－18的釋放，而這些都可以被外源性的氟西汀所抑制，提示氟西汀可能通過抑制NLRP3炎性小體激活、小膠質細胞焦亡以及隨后的炎癥級聯反應對AD發揮神經保護作用。越來越多的證據表明，NLRP3信號通路在AD的發生和發展中發揮著關鍵作用。關于Aβ如何介導小膠質細胞NLRP3炎性小體激活目前已有多種假說被提出。有研究認為，Aβ作為NLRP3炎性小體的啟動或活化刺激物，最終導致由caspase－1介導的炎性因子（IL－1β、IL－18）的釋放，而且在特定條件下，活化的caspase－1將裂解下游的成孔蛋白GSDMD，從而促進小膠質細胞發生焦亡。本實驗結果表明，氟西汀的應用，尤其是高劑量（20 μmol/L）的氟西汀可以有效緩解Aβ25－35誘導的BV2細胞焦亡，主要表現為LDH釋放量降低、PI陽性的BV2細胞數量減少以及細胞形態學上的變化；此外，氟西汀也可以逆轉Aβ25－35誘導的細胞活力下降。GSDMD不僅是焦亡的關鍵因子，也是焦亡成孔的候選蛋白之一。為了明確GSDMD是否在Aβ25－35誘導的細胞焦亡中發揮作用，本研究使用10 μmol/L雙硫侖（GSDMD特異性拮抗劑）作為對照，實驗結果顯示，雙硫侖有效抑制了GSDMD的表達和細胞焦亡，初步證實了GSDMD在Aβ25－35誘導的細胞焦亡中發揮關鍵作用。此外，高劑量（20 μmol/L）的氟西汀可以有效降低Aβ25－35誘導的BV2細胞GSDMD的表達進而改善焦亡。

本團隊前期研究顯示，氟西汀能夠通過抑制NLRP3炎性小體和caspase－1的活化改善蛛網膜下隙出血和抑郁。AMBATI等的研究顯示，氟西汀可直接與NLRP3蛋白結合并阻止NLRP3－ASC炎癥小體的組裝和激活，進而緩解萎縮性黃斑變性。本研究探討了氟西汀是否可靶向抑制Aβ25－35介導的NLRP3炎性小體激活，結果顯示，高劑量（20 μmol/L）氟西汀下調NLRP3炎性小體相關蛋白（NLRP3、ASC、caspase－1、cleaved－caspase－1）的表達，提示氟西汀可能通過抑制NLRP3炎性小體激活對AD產生保護作用。已知IL－1β和IL－18在腦內神經炎癥的啟動和維持中發揮關鍵作用。與先前在抑郁模型中的研究結果一致，本研究結果表明，氟西汀的應用能顯著抑制Aβ25－35誘導的IL－1β和IL－18產生。

ROS除了作為NLRP3炎性小體的重要上游活化信號外，還與AD的發生發展密切相關。有研究結果表明，氟西汀能在多種情況下減少ROS的生成。本文研究結果顯示，與Aβ25－35組相比較，不同濃度的氟西汀預處理顯著降低了細胞內ROS含量，且該作用呈劑量依賴性。由此推測，氟西汀可能通過抑制Aβ25－35誘導的ROS生成抑制NLRP3炎性小體的活化。

綜上所述，氟西汀能夠抑制Aβ25－35誘導的BV2小膠質細胞ROS產生、NLRP3炎性小體激活和細胞焦亡，進而改善神經炎癥反應，氟西汀可能通過調節ROS/NLRP3/GSDMD信號通路在AD中發揮神經保護作用，這為延緩AD發展提供了新的治療思路，值得進一步深入研究。

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（本文編輯 馬偉平）