結腸癌患者癌組織中CDCA5的表達變化及機制

牛學敏 趙樹巧 郭爭榮 韓聰 郝津 王娜 范紅偉 張曉博 張新元

近年來,隨著生活水平的提升,我國居民飲食習慣和飲食結構發生了根本性改變,導致我國結腸癌的發病率不斷上升。2017《中國大腸癌流行病學及預防和篩查白皮書》顯示,結直腸癌居惡性腫瘤發病率第3位,死亡率居第5位[1,2]。研究表明,細胞分裂發生故障可導致癌癥,而細胞周期的異常改變可導致癌細胞不受控制地增殖;另一方面許多細胞周期相關基因在癌癥中被調控,而這些基因很可能是藥物治療的靶點[3]。細胞分裂周期相關(cell division cycle-associated,CDCA)蛋白家族由8個成員組成,其中CDCA5基因位于人類11號染色體,11q13.1,在間期細胞的細胞核中表達,也會參與細胞的分裂。近年來有研究表明,CDCA5mRNA在多種腫瘤細胞中具有較高的轉錄水平,如膀胱癌、肝癌、胃癌、肺癌等,提示CDCA5可能與腫瘤細胞較高的惡性增殖活性有關[4]。目前研究表明腫瘤細胞中CDCA5的普遍性高水平表達與細胞增殖、轉移、侵襲有關,甚至與腫瘤患者預后有關[5]。CDCA5高表達可能是腫瘤細胞區別與正常組織細胞的特征,有可能成為腫瘤治療的潛在治療靶標分子。本研究旨在探討CDCA5在結腸癌及結腸癌旁組織中的表達水平及其可能的作用機制,為結腸癌靶向治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2021年12月在我院住院治療的 30例經病理學檢查確診的結腸癌患者癌組織、癌旁正常組織,部分組織以10%中性甲醛固定后,用于病理學檢測,其余組織以液氮快速冷凍后置于-80℃冰箱保存,備提取蛋白及RNA。同時收集結腸癌患者血標本,同期隨機選取門診30例經結腸鏡檢查正常的血液標本;病例均無術前放化療、激素治療病史,且已排除合并其他惡性腫瘤。收集患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、人體測量學指標,包括身高(m)、體重(kg)、腰圍(cm)及體重指數(body mass index,BMI),BMI=體重(kg)/身高2(m2)。本研究經醫學倫理委員會批準,研究對象均簽署知情同意書。結腸癌患者與健康人群的一般資料比較,結腸癌患者發病平均年齡(66.17±13.02)歲,明顯高于健康對照組(P<0.01),性別、BMI、飲酒、吸煙方面兩者無明顯差異(P>0.05),三酰甘油高的人群更容易患結腸癌(P<0.05)。見表1。

表1 年齡、性別比、BMI、飲酒、吸煙、三酰甘油與結腸癌的相關性 n=30

1.2 材料 小鼠抗人β-actin單克隆抗體,小鼠抗人CDCA5單克隆抗體、兔抗人pERK多克隆抗體、兔抗人cyclinB1多克隆抗體、兔抗人P21多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司;小鼠抗人caspase3多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司;山羊抗鼠/兔二抗購自美國ProteinTech公司。

1.3 方法

1.3.1 血清生化學檢測:留取空腹靜脈血,4℃離心,留取血清,采用日本奧林巴斯 AU 5400全自動生化分析儀檢測三酰甘油(triglyceride,TG)水平,嚴格按照操作規程進行。

1.3.2 結腸組織病理學觀察

1.3.2.1 蘇木素-伊紅(HE)染色:石蠟切片4 μm,脫蠟至水,蘇木素染色5 min,蒸餾水洗,1%鹽酸-乙醇分化5～10 s,1%氨水返藍10 s,蒸餾水洗,伊紅染色1 min,常規水清洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.3.2.2 結腸癌及癌旁組織CDCA5免疫組織化學染色:石蠟切片脫蠟至水,枸櫞酸緩沖修復液(pH值=6.0)抗原修復10 min,3%H2O2孵育20 min,封閉后,滴加一抗鼠抗CDCA5單克隆抗體(1∶100),陰性對照用PBS代替一抗,4℃過夜,滴加羊抗鼠二抗試劑,37℃孵育30 min,DAB顯色,復染,封片,棕黃色為陽性染色。

1.3.3 結腸癌及癌旁組織CDCA5、cyclinB1、ERK、P21、caspase3mRNA表達:以Trizol法提取RNA,應用Rever Aid First cDNA Synthesis Kit逆轉錄合成cDNA,以適量cDNA為模板,以GAPDH為內參照,進行實時定量擴增。每個基因重復操作3次,運用2-ΔΔCT法分析結果。依據Genbank設計引物序列,由上海生物工程公司合成。見表2。

1.3.4 結腸癌及癌旁組織CDCA5、cyclinB1、pERK、P21、caspase3蛋白表達:采用Western Blot法,應用組織裂解液提取組織總蛋白,以紫外分光光度計測定蛋白濃度。取80 μg蛋白,經SDS-PAGE電泳,轉移至PVDF膜,封閉, 分別加入鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶4 000),小鼠抗人CDCA5單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗cyclinB1多克隆抗體(1∶8 00)、兔抗pERK多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗P21多克隆抗體(1∶800)、鼠抗caspase3單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,PBS洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠/兔二抗(1∶5 000),常溫搖床孵育1 h,PBS洗膜3次,ECL試劑發光,顯影及定影。凝膠定量軟件Quantity One分析各條帶灰度值,以β-actin為內參照計算各組蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 CDCA5在結腸癌及癌旁組織中的蛋白表達 免疫組織化學證實CDCA5在結腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織。見圖1。

圖1 CDCA5在結腸癌及癌旁組織的表達(免疫組織化學×100)

2.2 采用qRT-PCR及WB檢測CDCA5的mRNA及蛋白表達 結腸癌組織CDCA5 mRNA的表達水平(0.96±0.13)明顯高于癌旁正常組織(0.30±0.46)(P<0.001);結腸癌組織CDCA5蛋白水平(1.46±0.36)較癌旁正常組織明顯升高(0.86±0.20)(P<0.001)。見圖2,表3。

圖2 結腸癌及結腸癌旁組織中CDCA5的mRNA及蛋白水平

圖3 結腸癌及結腸癌旁組織中cyclinB1的mRNA及蛋白水平

表3 結腸癌及結腸癌旁組織中CDCA5的表達水平 n=30,

2.4 增殖cyclinB1和P21mRNA及蛋白結腸癌組織中的表達 結腸癌組織中cyclinB1 mRNA的表達水平(1.45±0.22)明顯高于癌旁正常組織(0.93±0.22)(P<0.001);其蛋白表達水平結腸癌組織(0.52±0.13)高于癌旁正常組織(0.18±0.06)(P<0.001),結腸癌組織中P21mRNA的水平(1.31±0.19)明顯高于癌旁正常組織(0.96±0.09)(P<0.01);其蛋白水平結腸癌組織(0.72±0.11)高于癌旁正常組織(0.31±0.09)(P<0.01)。見表4、5,圖4。

圖4 結腸癌及結腸癌旁組織中P21的mRNA及蛋白水平

表4 結腸癌及結腸癌旁組織中cyclinB1的表達水平 n=30,

表5 結腸癌及結腸癌旁組織中P21的表達水平 n=30,

2.5 ERK及凋亡因子caspase3的表達 發現具有高水平 CDCA5 的結腸癌患者也具有高ERK磷酸化水平,結腸癌組織中ERK mRNA的表達水平(1.83±0.53)高于癌旁正常組織(0.92±0.12)(P<0.01),其pERK的蛋白在結腸癌中表達水平(0.79±0.14)明顯高于癌旁正常組織(0.16±0.07)。 CDCA5高表達的結腸癌患者中caspase3的mRNA及蛋白表達水平較癌旁正常組織較低(P<0.001)。 這表明高表達的CDCA5可以促進結腸癌細胞的增殖并抑制其凋亡。見表6、7,圖5、6。

圖5 結腸癌及結腸癌旁組織中ERK的mRNA及蛋白水平

圖6 結腸癌及結腸癌旁組織中caspase3的mRNA及蛋白水平

表6 結腸癌及結腸癌旁組織中ERK的表達水平 n=30,

表7 結腸癌及結腸癌旁組織中caspase3的表達水平 n=30,

3 討論

細胞周期調控紊亂是惡性腫瘤的重要生物學特征,可導致惡性細胞凋亡減少、無限增殖和轉移。細胞周期中斷是惡性腫瘤最重要的原因之一[6]。 許多細胞周期相關基因在癌癥中失調,這些基因可能是藥物治療的潛在靶點[7,8]。CDCA5 屬于細胞分裂周期相關蛋白家族,其主要作用是促進姐妹染色單體結合并確保準確的姐妹染色單體分離以維持基因組完整性[9]。 CDCA5調節細胞周期相關蛋白和轉錄因子的活性,促進癌細胞增殖,參與癌細胞凋亡。研究表明腫瘤細胞中CDCA5的普遍性高水平表達與細胞增殖、轉移、侵襲有關,甚至與腫瘤患者預后有關[10]。有結果表明,前列腺癌組織中CDCA5的mRNA和蛋白表達水平顯著高于癌旁正常組織,CDCA5 的高表達與前列腺癌患者的預后相關。 在體外和體內研究發現CDCA5 表達敲低顯著減少了有絲分裂中前列腺癌細胞的數量并抑制了它們的增殖[11]。

本研究結果發現CDCA5在結腸癌組織中的mRNA及蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織,說明CDCA5參與結腸癌的發生發展。本研究發現CDCA5在結腸癌組織中高表達,與子宮內膜癌、肝癌組織中高表達CDCA5的發現[12-14]一致。TCGA(The Cancer Genoma Altlas)數據分析顯示,與鄰近的正常組織相比,CDCA5在胃癌組織中表達顯著上調,進一步通過組織芯片分析證實CDCA5的表達上調與更高級別的臨床病理特征顯著相關,表達水平越高,胃癌進展越快,沉默胃癌細胞內的CDCA5基因將通過下調CyclinE1誘導細胞阻滯在G1期,進而抑制胃癌細胞的增殖[15]。唐軍偉等[16]在結直腸癌細胞中采用非對稱抑制CDCA5基因改變細胞周期,其明顯降低G0/G1期細胞比例,增加G2/M期細胞比例,從而使細胞阻滯在G2/M期,降低腫瘤細胞的增殖能力。顧朝輝等[17]研究結果表明,CDCA5在膀胱癌組織表達上調,且其高表達與臨床分期和病理分級升高相關。綜上,CDCA5在多種腫瘤中表達明顯升高,與腫瘤細胞增殖有關。

真核細胞的增殖主要由細胞周期介導。G2/M的進展是主要的檢查點之一,是由cyclinB1/ CDK1的蛋白質復合物密切調節的。CDCA5是在G2/M期將黏附力與染色單體穩定結合所必需的,并且在細胞周期調控中起著至關重要的作用[10,18]。據報道,抑制CDCA5基因的表達會影響肝癌細胞和結直腸癌細胞的細胞分裂周期,導致生存能力下降[18,19]。很多腫瘤組織cyclinBl表達陽性率明顯高于正常組織,本研究發現在結腸癌組織的表達明顯高于癌旁正常組織,提示cyclinBl可能參與結腸癌的發生、發展。有研究表明細胞質p21促進了乳腺癌細胞的侵襲和轉移,免疫組化結果顯示細胞質p21的高表達伴隨著細胞質cyclinB1的表達上調[20],本研究結果顯示P21在結腸癌組織的基因及蛋白水平明顯高于癌旁正常組織,由此推測細胞質p21可能通過cyclinB1調控細胞周期并抑制細胞凋亡,但是具體機制還有待進一步研究。

ERK信號通路在多種細胞過程中起著重要作用,參與多種細胞過程的調節,包括增殖、分化、炎癥、轉錄調節和發育[21]。ERK途徑的激活與多種腫瘤的發展密切相關,包括結腸癌。由于ERK主要通過磷酸化激活,我們發現高表達CDCA5水平的結腸癌組織中也具有高水平的ERK的磷酸化,這表明ERK通路的激活有助于結腸癌中CDCA5的致癌活性。Ji等[11]研究發現在體內和體外檢查了 CDCA5 敲低后前列腺癌細胞中 ERK 磷酸化的水平。 值得注意的是,一旦CDCA5被抑制,ERK的磷酸化水平就會顯著降低,該信號通路的活性也會減弱。CDCA5敲低可降低結腸癌細胞中ERK1/2的磷酸化水平和c-jun的表達,這表明ERK通路的激活有助于結腸癌中CDCA5的致癌活性。有一項肺癌的研究中,CDCA5高表達促進肺癌細胞的增殖,抑制CDCA5和ERK激酶間的相互作用,顯著降低CDCA5的磷酸化水平,抑制肺癌細胞的生長[22]?，F有研究表明CDCA5表達水平越高患者預后越差,并且CDCA5高表達是肺癌患者預后的獨立危險因素[23]。

線粒體依賴性凋亡是主要的凋亡途徑,使用慢病毒介導的shRNA對CDCA5基因進行敲除后通過ERK信號通路抑制腫瘤細胞增殖,誘導細胞凋亡[15,18]。凋亡發生是一個由caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程,不同蛋白酶分別切割并激活caspase3酶原。在這項研究中,我們發現凋亡因子caspase3在結腸癌組織中處于低水平,說明結腸癌組織中細胞凋亡減低,這些發現表明CDCA5通過破壞癌細胞中增殖、凋亡的平衡而產生致癌活性。

以上研究結果表明, CDCA5高表達可能是腫瘤細胞區別于正常組織細胞的特征,結腸癌組織中的CDCA5高表達,可能通過調控細胞周期蛋白cyclinB1、P21、ERK及caspase3抑制細胞凋亡,參與結腸癌的發生、發展,CDCA5有可能成為腫瘤治療的潛在靶標之一。