油莎豆生長素受體TIR1基因家族鑒定及響應鹽脅迫和外源IBA的表達分析

李昕儒　高宇　苗淑楠　李騰　董書言　史先飛　薛金愛　季春麗　李潤植

關鍵詞：油莎豆；運輸抑制劑響應蛋白1（TIR1）；吲哚丁酸（IBA）；鹽脅迫；基因表達

中圖分類號：S565.9 文獻標識碼：A

油莎豆（Cyperus esculentus L.）又稱油莎草、老虎豆等，是莎草科莎草屬多年生草本植物[1]，其塊莖富含油脂、蛋白質、淀粉、糖等營養成分[2]。油莎豆是目前發現的唯一已知地下部分營養器官積累大量油脂的作物[3]，油脂中油酸含量高達68%～75%，品質和營養成分可媲美橄欖油、榛子油等優質食用油，且優于菜籽油及芝麻油等[4]。油莎豆塊莖還可制作其他食品或藥品，地上部分亦可用作優質牧草飼料，是一種集油、糧、草、飼、藥于一體的多用途經濟作物[4-5]。油莎豆種植范圍廣，具有適應性強、高抗逆性等特點[6-7]，也是植物抗逆性研究的理想作物材料。

在農業生產中，作物生長常受到非生物脅迫的危害。干旱、洪澇、高溫、低溫、鹽堿和重金屬等非生物脅迫直接影響植物新陳代謝、生長和發育，不僅會降低作物產量，甚至在極端情況下會導致植物死亡[8]。鹽脅迫是最普遍的非生物脅迫之一，嚴重影響全球農業生產[9]。鹽脅迫破壞植物滲透平衡系統，導致植物膜脂過氧化，抑制營養物質的吸收，影響植物正常生長發育[10]。植物進化出各種機制抵御鹽脅迫的侵害，包括調節離子穩態、激活滲透脅迫途徑、介導植物激素信號傳導以及調節細胞骨架動力學和細胞壁組成等[11]。其中，植物激素在細胞間的信號轉導，不僅調節植物生長和發育，還可以調節植物非生物脅迫響應，在植物抵御非生物脅迫的應答中起著至關重要的作用[12]。生長素作為一類生長促進激素，參與植物對鹽脅迫信號的感知和防御，可以通過調節氣孔閉合來調節水分平衡和滲透性穩態，進而提高植物對鹽脅迫的耐性[10]。

運輸抑制劑響應蛋白1（transport inhibitorresponse protein 1，TIR1）是植物響應生長素信號的一類重要蛋白[13]。TIR1 蛋白N 端有引起蛋白水解的SCF 蛋白復合物成分之一F-box 結構域，C 端有富集多個亮氨酸序列（LRR）的AMN1 超結構域[14]。生長素與受體TIR1 蛋白結合后，TIR1編碼F-box 蛋白可以與S 期激酶相關蛋白1（SKPI）類似物ASK1 和ASK2 及Cullin 形成SCF（SKPI/cullin/F-box）型26S 泛素蛋白酶復合體，該復合體與生長素以及Aux/IAA 轉錄因子相互作用[15]，促使Aux/IAA 蛋白經泛素化修飾后進入26S 蛋白酶體途徑降解，進而激活與生長素反應相關的基因[16]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達MiR393–TIR1（mTIR1）基因，生長素信號傳導增加可能觸發生長素介導的下游途徑，通過滲透調節和增加Na+排出來增強植物鹽脅迫抗性，從而顯著增強轉基因擬南芥抗鹽能力[17]。大白菜（Brassica rapa）BrTIR1 啟動子上存在響應鹽脅迫的順式作用元件，BrTIR1 在大白菜響應鹽脅迫中發揮重要作用[18]。鹽脅迫信號對植物生長素受體基因TIR1 的表達也起著調控作用，如NaCl 脅迫處理能夠調控灰綠藜（Chenopodium glaucum L.）CgTIR1 基因的表達[19]等。油莎豆作為一種抗逆性強、綜合利用價值高的糧油兼用新型經濟作物，關于CeTIR1 基因的生物學特性、響應鹽脅迫和生長素信號的調控等鮮有報道。

本研究基于實驗室的油莎豆轉錄組數據鑒定獲得油莎豆CeTIR1 基因家族的編碼序列并對其進行克??；通過生物信息學分析其編碼蛋白的序列特征、理化性質、高級結構和生物進化關系；測定鹽脅迫及添加生長素處理后油莎豆幼苗POD、SOD 酶活性和MDA 含量；通過qRT-PCR分析油莎豆CeTIR1 基因組織表達特性及其在鹽脅迫和添加生長素處理后的表達譜。本文旨在為后續深入研究CeTIR1 功能和CeTIR1 參與外源生長素介導植物鹽脅迫抗逆性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

油莎豆種質材料為山西農業大學分子農業與生物能源研究所保存的晉農1 號，2021 年4 月22日種植于山西農業大學農學院農作站。取晉農1號萌發時期（80 d）的油莎豆根、葉及塊莖樣品，液氮速凍后保存于?80 ℃備用。另選取大小均勻、飽滿、無蟲眼的油莎豆塊莖，發芽預處理后，置于人工氣候培養箱中培養，設置培養條件為溫度（252）℃、光暗比16/8。選取生長25 d，長勢良好且基本均勻一致的油莎豆幼苗分別用Hoagland營養液添加250 mmol/L NaCl ， 250 mmol/LNaCl+1 mg/L IBA 處理，并以不添加NaCl 和IBA的幼苗為對照（CK），取處理0、3、12、24、48、72 h 時的油莎豆幼苗，經液氮冷凍后，存于?80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 油莎豆CeTIR1 基因克隆 基于本實驗室油莎豆轉錄組數據庫篩選鑒定出4 個油莎豆TIR1基因（ CeTIR1-1 、CeTIR1-2 、CeTIR1-3 和CeTIR1-4）。根據4 個基因的CDS 序列，設計PCR 引物（表1）用于基因編碼序列的克隆。以油莎豆萌發時期塊莖的cDNA 作為模板， 用TOBOYO 的KOD-Plus-Neo 高保真酶擴增目的基因CDS 序列。取PCR 產物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。用EasyPure? Quick Gel ExtractionKit（TRANs）試劑盒對正確的目的片段進行回收純化。使用核酸儀測量產物濃度，將PCR 產物連接到pMD18-T 載體上，轉入到大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，轉化產物涂板后挑取單克隆菌落，菌檢為陽性后送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 生物信息學分析 利用NCBI 數據庫在線工具CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對從本實驗室油莎豆轉錄組數據鑒定獲得的CeTIR1 基因編碼的氨基酸序列的保守結構域進行分析。使用MEME（https：//memesuite.org/meme/tools/meme）在線軟件預測CeTIR1基因家族編碼蛋白的Motif；利用Expasy 網站提供的Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具分析CeTIR1 基因家族編碼蛋白的氨基酸組成、理論等電點、相對分子質量和原子組成等理化性質；使用在線分析網站TMHMM Server 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）對CeTIR1 蛋白跨膜區進行預測分析；運用Expasy 網站提供的Protscale 工具（https：//web.expasy.org/protscale/）對蛋白疏水區域進行預測分析；使用在線分析網站PSORT II（https：//psort.hgc.jp/form2.html）預測CeTIR1 基因家族編碼蛋白的亞細胞定位；使用SOPMA 網站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行蛋白二級結構的預測分析；通過在線軟件Phyre2（http：//www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）進行蛋白三級結構建模分析。使用Genedoc 軟件對CeTIR1 基因家族編碼蛋白和其他物種TIR1 蛋白的氨基酸序列進行多序列比對； 利用鄰接法（neighbor-joining，NJ）通過MEGA 7.0 軟件構建所測物種TIR1 蛋白（表2）的系統發育樹，參數設置bootstrap 1000，其余參數默認。

1.2.3 抗氧化相關酶活性測定 超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.2.4 油莎豆CeTIR1 基因表達實時熒光定量PCR 分析 利用Primer 6.0 設計檢測CeTIR1 基因表達的qRT-PCR 引物，以Ce18S RNA 為內參基因（表1）。采用北京全式金公司的TransZol Plant試劑盒提取總RNA 。使用Genstar 公司的StarScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉錄。使用TaKaRa 公司的TB Green? Premix ExTaqTM Ⅱ試劑盒，進行實時熒光定量PCR 分析。反應程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 1 min，39 個循環，設置3 次生物學重復和3 次技術重復。采用2?ΔΔCT 法[21]計算基因相對表達量。

1.3 數據處理

使用SPSS Statistics 26.0 軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 油莎豆CeTIR1 基因的ORF克隆

用晉農1 號塊莖cDNA 作為模板進行PCR 擴增，擴增產物電泳分離鑒定結果如圖1 所示，PCR反應擴增得到的目的基因條帶與預期相符。經測序驗證，油莎豆CeTIR1 基因家族成員CeTIR1-1、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4 基因的ORFs 分別為1770、1875、1836、1800 bp。經測序鑒定，擴增到各CeTIR1 基因的ORF 序列與前期測得的轉錄組數據一致。

2.2 油莎豆CeTIR1 蛋白的理化性質分析

對CeTIR1 基因家族編碼蛋白保守結構域進行分析，結果顯示（圖2），CeTIR1 家族蛋白與擬南芥AtTIR1 都含有典型的3 個結構域：富集多個亮氨酸序列（LRR）的AMN1 超結構域、F-box_5結構域（為SCF 型泛素E3 連接酶復合體中的一個組分引起蛋白水解）和Transp_inhibit 結構域（是LRR 區域的特定單位）。Motif 預測結果顯示（圖3），CeTIR1 家族蛋白有6 個Motif，與AtTIR1 結構相似。CeTIR1 家族蛋白與擬南芥AtTIR1 類似，有典型的TIR1 蛋白保守結構域和保守Motif，預示著油莎豆CeTIR1 可能與擬南芥AtTIR1 有相似的生物學功能。

4 個CeTIR1 蛋白之間理化性質差異不明顯（表3）。蛋白序列最長為CeTIR1-2（624 aa），最短為CeTIR1-1（589 aa）。CeTIR1 理論等電點在5.13～6.72 之間，不穩定系數在42.64～46.33 之間，均為酸性不穩定蛋白。除CeTIR1-3 蛋白為疏水性蛋白，其余CeTIR1 蛋白均為親水性蛋白。CeTIR1 蛋白均無跨膜區域。亞細胞定位分析顯示CeTIR1 蛋白均位于細胞核內。CeTIR1 蛋白理化性質相似，預示著它們可能發揮類似的功能。

2.3 油莎豆CeTIR1 蛋白的高級結構預測分析

CeTIR1 蛋白二級結構預測結果顯示（表4），4 個CeTIR1 蛋白主要是由α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲組成，其中α-螺旋和無規則卷曲占比較高。CeTIR1 蛋白預測三級結構結果顯示（圖4），以膜蛋白c2p1nE 為模版，CeTIR1 家族蛋白和AtTIR1 蛋白都為螺旋環狀結構。AtTIR1蛋白與模版的相似性為96%。CeTIR1 家族蛋白中，CeTIR1-1、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4蛋白與模版的相似性分別為96%、91%、93%和95%。通過以上分析預測4 個CeTIR1 家族蛋白可能發揮與AtTIR1 蛋白相似的生物學功能。

2.4 油莎豆CeTIR1 蛋白多序列比對和系統進化樹

多序列比對結果顯示（圖5），4 個CeTIR1蛋白和擬南芥AtTIR1 蛋白具有較高的相似度，都含有典型的F-box 蛋白結構域、AMN1 超結構域和Transp_inhibit 結構域。通過MEGA 7.0 軟件構建油莎豆CeTIR1 蛋白與其他物種TIR1 蛋白的系統發育樹，結果顯示（圖6），4 個油莎豆CeTIR1的進化關系有明顯的差異。從多序列比對和進化關系上來看，油莎豆CeTIR1-1 和CeTIR1-2 在同一分支與禾本目莎草科的康藏嵩草ClTIR1 關系較近，序列一致性值分別為78.68%和69.12%；CeTIR1-3 與木犀科油橄欖OeTIR1 關系較近，序列一致性值為39.02%；油莎豆CeTIR1-4 與十字花科油菜BnTIR1 關系較近，序列一致性值為51.31%。進化關系上的差異，預示著它們可能差異化行使功能。

2.5 油莎豆CeTIR1 基因家族組織表達特性分析

為進一步探究油莎豆CeTIR1 基因家族在不同組織器官中的表達特性，以晉農1 號的根、葉、塊莖的cDNA 為材料，以Ce18S rRNA 作為內參基因，qRT-PCR 檢測各CeTIR1 基因的表達量。結果如圖7 所示，油莎豆CeTIR1 基因家族的表達特性呈多樣性。油莎豆CeTIR1 基因家族在各組織中均有表達，其中，在根中CeTIR1-2 表達量最高，在葉中CeTIR1-4 表達量最高，在塊莖中CeTIR1-2 表達量最高。相比較而言， 油莎豆CeTIR1 基因家族均在塊莖組織中高表達，在根和葉組織中表達量較低。

2.6 外源IBA 可緩解鹽脅迫對油莎豆幼苗生長的損害

鹽脅迫處理下，油莎豆中SOD 和POD 活性隨處理時間的延長呈先增加后下降的趨勢，在48 h 時均達到最大值后開始下降。對鹽脅迫下的油莎豆幼苗外源添加IBA 處理12、24 h 時，油莎豆幼苗SOD 活性升高趨勢明顯，處理48 h 時幼苗SOD 活性下降。添加IBA 處理的SOD 活性仍高于僅鹽脅迫處理的SOD 活性（圖8）。外源IBA處理下，POD 活性相比僅鹽脅迫處理的POD 活性升高。在IBA 處理48 h 時，幼苗POD 活性達到峰值（圖8）。鹽脅迫處理對油莎豆幼苗產生一定的損傷，對鹽脅迫下的油莎豆幼苗外源添加IBA 處理顯著提升油莎豆幼苗抵御鹽脅迫的抗性。因此，IBA 處理可以緩解鹽脅迫對于油莎豆幼苗的傷害。

鹽脅迫處理下，MDA 的含量緩慢升高且在處理72 h 時達到最高，油莎豆幼苗細胞膜過氧化程度愈加嚴重。對鹽脅迫下的油莎豆幼苗外源添加IBA 處理后，幼苗MDA 含量降低（圖8）。幼苗細胞膜過氧化程度隨鹽脅迫處理時間增加而加劇，外源IBA 減輕了鹽脅迫下油莎豆幼苗細胞膜的損傷。

2.7 油莎豆CeTIR1 基因在鹽脅迫及外源IBA處理后的表達譜分析

油莎豆CeTIR1 基因在鹽脅迫下的表達分析如圖9 所示，隨著鹽脅迫處理時間延長，CeTIR1-1和CeTIR1-3 表達量逐漸升高，在24 h 時達到最高后下降。CeTIR1-4 表達量隨處理時間延長逐漸升高。CeTIR1-2 表達量在3 h 時升高，在12 h 時降低，而后又在72 h 時顯著升高。鹽脅迫下油莎豆幼苗外源添加IBA 處理，CeTIR1-1，CeTIR1-3和CeTIR1-4 表達量在24、48、72 h 時相比鹽脅迫處理條件下這3 個基因表達量顯著降低。然而，CeTIR1-2 表達量在3、12、48、72 h 時相比鹽脅迫處理顯著升高，且在不同時間相對表達量均高于鹽脅迫處理。以上結果表明CeTIR1-1 、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4 可能都參與鹽脅迫抗逆反應。尤其是CeTIR1-2 基因在外源IBA處理時高表達?？梢?，外源IBA 處理顯著上調了CeTIR1-2 基因表達，CeTIR1-2 可能進一步激活相關信號通路及其相關生理生化反應，從而緩解了鹽脅迫對油莎豆幼苗的損傷。由此推測CeTIR1-2基因可能是參與調控油莎豆幼苗鹽脅迫抗性的重要基因。

3 討論

土壤鹽漬化會嚴重阻礙植物生長發育，降低作物產量，給全球農業生產和糧食安全帶來嚴重威脅[22-23]。在植物抵御非生物脅迫過程中，生長素起到了提高植物對非生物脅迫適應性的關鍵作用[24]。生長素信號通路離不開上游的調控因子生長素受體的參與，生長素受體是控制生長素信號通路的開關[25]。TIR1 是一種被廣泛研究的生長素受體，可介導Aux/IAA 蛋白的快速降解，進而導致生長素調控基因表達的變化[26]。因此，研究油莎豆生長素受體CeTIR1 基因是否參與生長素響應和鹽脅迫應答及其作用機制，對于油莎豆抗逆性改良和提高油莎豆在鹽堿地等逆境種植管理有重要科學參考價值。

本研究通過生物信息學分析在油莎豆轉錄組數據庫中鑒定出油莎豆4 條TIR1 序列。通過功能結構域分析，4 條CeTIR1 基因和擬南芥AtTIR1基因高度相似，編碼蛋白都含有F-box 結構域。預測其有TIR1 蛋白功能，可響應生長素信號且在非生物脅迫應答中起作用。通過蛋白高級結構分析和多序列比對顯示，油莎豆CeTIR1 蛋白與擬南芥AtTIR1 結構類似。預示其亦可與生長素、Aux/IAA 轉錄因子相互作用，這與百子蓮ApTIR1蛋白的功能類似[27]。通過系統進化樹分析，油莎豆CeTIR1 蛋白與來自禾本目莎草科的康藏嵩草、木犀科的油橄欖和十字花科的油菜的TIR1 蛋白等同源性較高。

在不同物種中TIR1 發揮的功能亦有不同，可能與物種本身特性有關。有報道表明，TIR1 可能調控龍眼體胚發生[28]，與茶樹越冬芽休眠密切相關[29]，可能與紅麻花藥敗育有關[30]。亦有研究表明TIR1 基因可以增強植物對鹽脅迫的抗逆性。例如，鹽穗木HcTIR1 響應高鹽脅迫且其表達量與鹽脅迫濃度呈現負相關性[19]。擬南芥過表達MiR393–TIR1（mTIR1）基因的植株抗鹽能力顯著增強[17] 。本研究發現， 油莎豆CeTIR1-1 、CeTIR1-2、CeTIR1-3 和CeTIR1-4 均響應鹽脅迫信號，在NaCl 處理時表達量顯著增加。鹽脅迫處理下油莎豆幼苗抗氧化酶活性升高，在48 h 時達到峰值后下降，MDA 的含量也有所升高，說明鹽脅迫對油莎豆幼苗生長造成了一定程度的損害。外源IBA 處理鹽脅迫下油莎豆幼苗的SOD、POD酶活性提高，MDA 含量降低，說明外源添加IBA使鹽脅迫下油莎豆幼苗的鹽毒害有所緩解。特別是，油莎豆CeTIR1-2 在外源添加IBA 處理后表達量顯著增加， 預示著外源IBA 顯著上調CeTIR1-2 基因表達。有研究表明，外源添加一定濃度的IBA 處理沙冬青幼苗能夠促進鹽脅迫下幼苗的生長，提高幼苗的耐鹽性[31]。外源生長素能夠緩解鹽脅迫對小麥幼苗傷害，強化小麥幼苗的抗鹽能力[32]等。但關于TIR1 響應鹽脅迫和生長素信號的詳盡分子機制的研究還未見報道。外源添加IBA 對鹽脅迫下的油莎豆幼苗起到一定程度的緩解作用，可提高鹽脅迫下油莎豆幼苗的抗氧化性，還可能調控油莎豆生長素信號的轉導途徑。這對于提高植物耐鹽性和改善鹽堿地有重要意義。綜合分析顯示，CeTIR1-2 是通過生長素調控來響應鹽脅迫的一個重要靶標基因。后期將對CeTIR1-2 基因生物學功能等進行進一步深入研究，以闡明CeTIR1-2 介導的抗逆性調控作用機制。

4 結論

本研究基于油莎豆轉錄組數據鑒定到4 條油莎豆CeTIR1 基因并對其進行克隆，4 個CeTIR1s都含有典型的F-box 蛋白結構域、AMN1 超結構域和Transp_inhibit 結構域，均為定位于細胞核的無跨膜區域的不穩定蛋白。油莎豆CeTIR 基因均在塊莖組織中高表達，在根和葉組織中表達量較低。油莎豆幼苗在鹽脅迫下抗氧化酶活性和MDA含量升高，添加外源IBA 可緩解鹽脅迫對油莎豆幼苗生長的不利影響。鹽脅迫可誘導CeTIR1 基因的表達，尤其是外源IBA 可顯著上調CeTIR1-2基因表達，進而激活相關信號通路和脅迫應答體系，提高油莎豆幼苗抗逆性。CeTIR1-2 可能是介導生長素信號通路和油莎豆脅迫應答反應的一個重要調節因子。