低溫處理對斑馬魚CNSS系統應激相關基因的影響

鄒華鋒+馮宇紅+蘭兆輝+呂為群

摘要：選取斑馬魚在28、18 ℃條件下處理2周，對尾部神經系統CNSS組織的U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]、CRH、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]α、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]β、[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]基因表達以及斑馬魚的游泳運動行為進行了研究。經過寒冷應激后，試驗組應激相關基因CRH、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]α、U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]β、[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]表達與對照組相比均明顯上升，但對U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因表達沒有影響。對斑馬魚的運動軌跡進行分析表明，2個組的斑馬魚在快速游泳距離、慢速游泳距離、平均游泳速度方面均存在明顯差異，低溫處理組斑馬魚的慢速游泳時間明顯高于對照組，平均游泳速度明顯低于對照組。行為學數據和基因表達分析均表明，寒冷處理對斑馬魚造成了應激反應，低溫條件下斑馬魚活動行為的減少可能是降低機體能量消耗的一種生存策略。

關鍵詞：斑馬魚；尾部神經系統；尾加壓素；基因表達；低溫

中圖分類號： Q344+.1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0043-04

水體溫度是影響魚類生長發育的重要環境因子，對魚類生長、繁殖、遷移等生命過程具有重要影響[1]。與陸地哺乳動物不同，魚類屬于變溫動物，魚類生活的環境溫度波動范圍更為劇烈，經常遭遇多種不可避免的劇烈溫差變化，如晝夜氣溫驟降、季節交替等引起的溫度驟變，從而對魚類產生各種短期或長期的應激反應[2]。如果魚類不能適應這種劇烈溫度變化引起的應激反應，通常會導致死亡，對漁業生產造成嚴重經濟損失[3]。

應激是生物生存和進化必不可少的生理反應，魚類尾部神經系統（CNSS）作為應激系統的一部分，與下丘腦-神經-垂體系統共同參與維持魚類應激狀態下內環境的穩態，在環[JP3]境適應、應激過程中起到至關重要的作用[4-5]。CNSS在魚類中是CRH、UⅠ、UⅡ等激素表達和分泌的主要場所[6]，開展對斑馬魚CNSS的研究有利于了解其在低溫變化過程中適應環境變化的生理機制，為其他經濟魚類抗寒冷應激的研究提供依據。

斑馬魚（Danio rerio）是近幾十年來被廣泛應用于生物學、遺傳學、醫學等生命科學領域的重要模式生物，可在5～38 ℃下生存[7-8]，是研究魚類對不同環境溫度適應性的良好模型。根據已有研究，本試驗對正常環境溫度28 ℃與寒冷溫度18 ℃下飼養的斑馬魚進行比較[9-10]，以揭示斑馬魚在低溫環境溫度下CNSS參與應激反應的相關基因變化，并結合行為學分析初步研究斑馬魚在寒冷應激條件下的適應機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1斑馬魚養殖

試驗所用斑馬魚由筆者所在實驗室斑馬魚房自行繁育，屬野生型Tuebingen純系后代。斑馬魚養殖系統購自上海海圣水族設備有限公司，每10～15尾養殖于3 L水循環系統魚缸中。養殖房水溫和室溫均控制在26～28 ℃，光照度約為200 lx，光—暗周期為14 h—10 h。

1.1.2樣品處理

選取健康、性成熟的6月齡雄性斑馬魚為研究對象，隨機選取同批次體長為（3.05±0.30） cm、體質量為（0.36±0.10） g的雄魚。將斑馬魚移至恒溫培養箱進行試驗處理，分為常溫對照組、冷應激組，處理溫度分別為28、18 ℃。光照周期與養殖系統內養殖環境相同，2個組的斑馬魚分別在各自溫度下處理14 d。試驗結束后迅速斷頭、斷尾，在冰上對斑馬魚尾部完成CNSS取樣。

1.2方法

1.2.1行為學試驗和分析

每組取6尾魚進行行為學分析，于20：00將待觀察的斑馬魚從恒濕培養箱內取出，轉移至 Zebrafish 行為學觀察裝置中，待斑馬魚適應后（約10 min）對其游泳行為進行連續記錄并分析。采用Viewpoint系統（法國眾為公司產品）對斑馬魚的游泳行為進行攝像分析，每尾斑馬魚連續觀察5 min并記錄。根據預試驗結果，將斑馬魚游泳速度在2 cm/s以下定義為慢速游泳，將2 cm/s以上定義為快速游泳。采用Zebrafish行為學分析軟件對5 min內快速游泳時間和距離、慢速游泳時間和距離、平均游泳速度進行分析。

1.2.2反轉錄與熒光定量PCR

按照說明書采用Trizol（TaKaRa）提取斑馬魚CNSS樣品RNA，提取的RNA在Nanodrop儀器上進行濃度測定。采用反轉錄試劑盒（TaKaRa，A047）按照說明書取1 μg RNA進行反轉錄，將得到的cDNA稀釋10倍后進行實時熒光定量PCR分析。采用2× SRBR熒光分析酶（Roche公司）進行實時熒光定量分析，PCR反應體系共20 μL，其中上下游引物各1 μL、cDNA模版2 μL、SYBR酶10 μL，剩余體積用水補足。采用abi7500型儀器行熱循環反應，PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃變性和延伸40 s，共設置40個循環。反應結束后設置溶解曲線檢驗反應產物的特異性。以β-actin為內進標，采用2-ΔΔCT方法對目的基因進行相對定量分析，所用引物序列見表1。

1.3統計學分析

采用Graphpad prism 5（Graphpad Software. San Diego，CA）軟件對數據進行統計分析并作圖，數據以“平均值±標準誤”表示。采用T-test方法對對照組和試驗組的基因表達、行為學數據進行統計分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結果與分析

2.1斑馬魚的游泳行為

采用Viewpoint行為學觀察儀（法國眾維公司產品）對斑馬魚5 min內的游泳軌跡進行攝像。游泳軌跡見圖1，綠色曲線、紅色曲線分別表示低速、快速游泳運動。[FL）]

采用行為學分析軟件對斑馬魚的運動軌跡進行分析。結果表明：從時間分布來看，2個組的斑馬魚在運動時間分布上具有顯著差異，在觀察記錄的5 min運動行為中，寒冷組斑馬魚慢速運動所占時間明顯多于對照組（圖2-A），而快速游泳運動的時間明顯少于對照組（圖2-B）；從游泳距離來看，寒冷應激組的慢速游泳距離顯著高于對照組（圖2-C），而快速游泳距離顯著低于對照組（圖2-D）；寒冷應激組斑馬魚的平均游泳速度明顯小于對照組（圖2-E）。

應激是生物應對外界環境變化重新調整體內動態平衡過程而進行特異和非特異級聯放大的生理反應，應激的重要神經內分泌反應之一是HPA軸即下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活。魚類不僅具有下丘腦-垂體系統，還具有一套類似的神經分泌系統CNSS，即尾部神經分泌系統[11]。CNSS系統內的Dahlgren細胞分泌物通過軸突運送至尾垂體中貯存，再由尾垂體直接分泌進入尾靜脈，以便分泌物迅速抵達腎臟、腸、性腺、肝臟等靶器官，參與機體對外界環境的適應過程[5，12]。

已有研究表明，魚類在寒冷條件下運動能力顯著下降，機體內參與代謝的各種酶的活性隨著溫度下降而下降，提供給肌肉運動的能量也隨之減少[13]。本試驗中，18 ℃寒冷條件下斑馬魚慢速游泳的時間顯著長于28 ℃條件下的對照組，且其游泳距離顯著小于對照組，表明寒冷處理對斑馬魚的正常游泳機能造成了影響。在試驗前期對斑馬魚1、24 h等長時間的游泳運動行為進行了觀察，發現低溫條件下魚的運動行為均顯著下降，因此本研究只分析具有代表性的5 min內游泳軌跡。

以往關于魚類對溫度應激的研究多集中于魚類腦部[10]，而魚類CNSS是機體除腦部外參與應激的主要部位，CNSS內的Dahlgren細胞通過分泌CRH、UⅠ、UⅡ等激素進入血液參與應激反應[14]。在大鼠和虹鱒魚的研究中，應激導致CRH mRNA表達上升[15-16]，這與本研究中斑馬魚經冷應激處理后CRH基因表達顯著上升相一致，但本研究中U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因表達并未表現出差異。盡管CRH和U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同屬于CRH超家族一類，且CRH和U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]在魚腦和尾部CNSS系統存在共表達的現象[17]，但參與CRH和U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的具體轉錄調控機制可能并不同。在大麻哈魚腦組織內，8—9月時雌性、雄性腦組織CRH mRNA均顯著升高，但U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因卻沒有差異[18]。將虹鱒從淡水環境轉移至海水中，24 h后進行基因表達分析，發現腦前區組織中CRH表達升高，但U[QX（Y15]Ⅰ[QX）]并未發生變化[19]。

對低等脊椎動物硬骨魚UⅡ的研究表明，該激素參與動物體內的滲透壓調節[20]。國外學者研究發現，UⅡ能刺激離體蝦虎魚膀胱，并適應淡水生活的歐洲鰻鱺后腸組織對鈉離子的吸收和重吸收能力[21]。UⅡ能增加魚類在低滲環境中對鈉離子和氯離子的保存能力，從而減少機體內離子的流失。牙鲆血液中Urotensin激素的含量與外部鹽度密切相關，當歐洲川鰈從鹽水環境轉移至淡水中時，血液Urotensin水平顯著上調[14]，表明UⅡ在離子調節方面具有重要作用。已有研究表明，寒冷條件下斑馬魚鰓組織中Na-K-ATP酶的活性下降，伴隨體內鈣離子和鈉離子顯著下降[22]。本研究中，U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]α和U[QX（Y15]Ⅱ[QX）]β基因mRNA升高可能是寒冷刺激引起斑馬魚離子丟失后，體內離子濃度恢復平衡的一種彌補機制。

毒蕈堿樣乙酰膽堿受體（M受體）屬于G蛋白相偶聯的受體超大家族，參與運動、體溫調節、學習記憶等多種重要生理功能[23-24]。M2激動劑可以劑量依賴性地增強老鼠血液內皮質醇的濃度，如果將[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]基因進行敲除，M2激動劑的效果被抑制，表明M2信號通路在應激過程中起到了重要作用[25]。本研究中，寒冷應激處理后斑馬魚CNSS組織中的M2受體表達明顯上調，進一步證明寒冷處理對斑馬魚產生了明顯的應激反應，同時體現了[WTBX][STBX]M2[WTBZ][STBZ]基因在應激中的重要性。

18 ℃的寒冷處理對斑馬魚造成了應激反應，并嚴重影響斑馬魚的運動機能。寒冷造成斑馬魚的應激反應以及運動機能下降，可能是機體為了生存而減少運動、保存能量的一種策略，具體機理有待進一步研究。

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