氣相色譜法測定蒙藥肉豆蔻五味中4 種藥效物質的含量

安佳斯，閆婷婷，賈 鑫，朱小玲，劉天龍，董 玉*

（1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010059；2.內蒙古自治區蒙藥藥效物質與質量控制工程技術研究中心，內蒙古 呼和浩特 010110；3.內蒙古自治區藥品檢查中心，內蒙古 呼和浩特 010010；4.內蒙古醫科大學附屬醫院藥劑部，內蒙古 呼和浩特 010050；5.內蒙古自治區國際蒙醫醫院藥學部，內蒙古 呼和浩特 010065）

肉豆蔻五味是蒙醫臨床治療心臟病的經典方劑。該方源于《蒙醫藥方匯編》，現收錄于《中華人民共和國衛生部藥品標準：蒙藥》[1，2]。該方由肉豆蔻、木香、土木香、廣棗和蓽茇五味藥材組成，用于治療心煩失眠、心神不安、心腦供血不足、缺血性心臟病等[2]。

肉豆蔻屬心臟良藥，又稱“匝迪”。其具有抗心律失常、促紅細胞生成、促進缺血再灌注損傷心肌的恢復、保護心臟的作用[2，3]，主要成分包括揮發油和脂肪油等[2]。木香用于胸脘脹痛、瀉痢后重、食積不消、不思飲食等，主要成分包括萜、內酯類等[3]。土木香又稱“瑪奴”，主治感冒頭痛、惡寒等。對心肌細胞缺氧損傷有保護作用，主要成分包括菊糖、萜、內酯類等[4]。廣棗具有抗心律失常、抗氧化等藥理作用，主要成分包括有機酸類和黃酮類等[5，6]。蓽茇又稱“必必靈”，其主要成分揮發油可調理胃火、滋補強壯、平喘、祛痰、止痛等[7]。

課題組前期建立了高效液相色譜測定Santamarine、木香烴內酯、去氫木香內酯、異土木香內酯、土木香內酯等內酯類成分的方法[8，9]。蒙藥肉豆蔻五味中含有揮發性成分，課題組前期未建立對肉豆蔻五味的氣相色譜檢測方法以及相關質量標準，而氣相色譜法操作簡便、靈敏度高、選擇性強。因此，本文通過建立氣相色譜法測定肉豆蔻五味中4種藥效物質的含量，旨在完善蒙藥肉豆蔻五味的質量評價體系，為肉豆蔻五味的進一步研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

氣相色譜儀（美國Agilent 7890B，安捷倫化學工作站）；DZKW-D-2電熱恒溫不銹鋼水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）；RE-52A 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

蒙藥肉豆蔻五味各味藥材：肉豆蔻（批號：18112702）、木香（批號：18090403）、土木香（批號：170801）、廣棗（批號：190112）、蓽茇（批號：180901）。以上藥材購于內蒙古天力藥業有限公司。甲基丁香酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，111642-200301）；土木香內酯（99.4%）（中國食品藥品檢定研究院，110760-201811）、異土木香內酯（98.8%）（中國食品藥品檢定研究院，110761-201806）；去氫木香內酯（99.8%）（上海麥克林生化科技有限公司，C11222536）；乙醇（95%）（天津市津東天正精細化學試劑廠，20190901）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，1 μm）；高純氮氣（20 mL/min）；助燃氣為空氣（40 mL/min）；氫火焰離子化檢測器溫度280 ℃，進樣口溫度230 ℃，分流比9∶1，進樣量1 μL；柱溫箱梯度升溫，升溫條件見表1。

表1 柱溫箱程序升溫條件

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制精密稱定甲基丁香酚對照品、土木香內酯對照品、異土木香內酯對照品、去氫木香內酯對照品，用甲醇配制成質量濃度分別為0.21 mg/mL、0.606 mg/mL、0.72 mg/mL、0.435 mg/mL的對照品溶液。分析結果見圖1。

圖1 對照品溶液氣相色譜圖（A:甲基丁香酚；B:土木香內酯；C:異土木香內酯；D:去氫木香內酯）

2.2.2 供試品溶液的制備 按照比例稱取肉豆蔻五味10 g，置500 mL 圓底燒瓶中，10 倍量95%乙醇回流提取每次2 h，合并濾液，回收溶劑，定容至5 mL容量瓶。微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。按照“2.1”項下色譜條件進行分析。結果見圖2。

圖2 供試品溶液氣相色譜圖（峰1：甲基丁香酚；峰2：土木香內酯；峰3：異土木香內酯；峰4：去氫木香內酯）

2.3 線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下的對照品溶液1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL，按照“2.1”項下色譜條件進行分析。以X-Y繪制標準曲線，縱坐標為色譜峰面積（Y），橫坐標為進樣量（X）（μg），計算各個化合物的相關系數（r）、回歸方程和線性范圍。結果見表2。

表2 蒙藥肉豆蔻五味中4種化學成分的保留時間、回歸方程、相關系數和線性范圍

2.4 精密度試驗

按照“2.2.2”項下制備方法，制備供試品溶液，采用1 份溶液連續進樣6 次的方法測定精密度。測得甲基丁香酚、土木香內酯、異土木香內酯、去氫木香內酯峰面積的RSD%（n=6）分別為2.22%、1.93%、1.72%、2.70%。結果表明該方法精密度良好。

2.5 重復性試驗

按照“2.2.2”項下制備方法，同時制備供試品溶液6份，按照“2.1”項下色譜條件，將6份制備的供試品溶液注入氣相色譜中分析。結果甲基丁香酚、土木香內酯、異土木香內酯、去氫木香內酯的平均含量分別為0.0263%、0.158%、0.163%、0.058%；RSD%（n=6）分別為1.97%、2.42%、2.81%、2.63%。結果表明該方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗

按照“2.2.2”項下制備方法，制備供試品溶液1份，按照“2.1”項下色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h檢測，測得甲基丁香酚、土木香內酯、異土木香內酯、去氫木香內酯峰面積的RSD%（n=6）分別為2.85%、1.90%、2.12%、1.43%。實驗結果表明供試品溶液于24 h 內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱定6 份肉豆蔻五味藥材各5 g，分別加入甲基丁香酚1.350 mg、土木香內酯8.020 mg、異土木香內酯8.200 mg、去氫木香內酯3.010 mg，共同定容于5 mL 容量瓶中，得供試品溶液。按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率及其RSD 值。實驗結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果[n（%）]

2.8 樣品含量測定

取12批不同批次的蒙藥肉豆蔻五味藥材，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，記錄峰面積，按標準曲線法計算各個批次藥材中4 種成分的含量（見表4）。

表4 12批次樣品的4個成分含量測定結果[n（%），n=3]

3 討論

與前期實驗室制定的高效液相色譜測定Santamarine、木香烴內酯、去氫木香內酯、異土木香內酯、土木香內酯等內酯類成分的方法相比，本文采用的氣相色譜法測定土木香內酯、異木香內酯、去氫木香內酯等成分可免去樣品前處理的過程，省時省力；同時采用高純氮氣作為載氣，經濟便捷。且氣相色譜法具有樣品用量少、高分離效能、高度選擇性、高度靈敏性、分析速度快、操作簡便等優點，適合肉豆蔻五味中揮發性成分的測定。

課題組優化多種實驗方式，以期完善測定方法。當測定時間超過120 min 后，再無其他色譜峰出現。因此，確定測定總時間為120 min。當柱溫箱采用等度升溫時，色譜峰分離度較差；采用梯度程序升溫法時，可選出化合物最佳出峰溫度。當進樣口溫度為180 ℃時，所得色譜峰易出現肩峰，分析原因為復雜基質會對待測成分的峰形產生影響；進樣口溫度升至230 ℃時，上述情況消失，因此確定進樣口溫度為230 ℃。當分流比為9∶1 時，可在保證待測成分被準確檢測的同時，排除大多數基質成分對儀器本身及色譜柱的影響。

課題組測定了12 批次肉豆蔻五味藥材中甲基丁香酚、土木香內酯、異土木香內酯、去氫木香內酯的含量，含量相對穩定，且4 種成分峰型尖銳、對稱性高，與其他峰的分離度較好，可以作為肉豆蔻五味的質量控制方法之一。

肉豆蔻五味中肉豆蔻為君藥，研究表明肉豆蔻可消減動脈粥樣硬化斑塊，使全血黏度含量減少[10]。同時諸多研究表明甲基丁香酚、土木香內酯、異土木香內酯、去氫木香內酯可在抗炎、抗腫瘤、抗心律失常等多個方面發揮藥理作用。其中甲基丁香酚是肉豆蔻的主要成分，具有抗菌、鎮痛抗炎、抗氧化損傷等藥理活性。王宏偉等[11]的網絡藥理學研究中，活性化合物中甲基丁香酚的OB 值大，活性成分-靶點預測圖中甲基丁香酚的度值排名較前，對缺血性心臟病有一定的作用。實驗證明甲基丁香酚可以增強細胞活性，保護器官組織，為研究急性器官缺血提供了參考價值[12]。土木香內酯和異土木香內酯是從土木香的根中分離出的半萜內酯類化合物，具有較好的抗炎、驅蟲、抗菌、抗腫瘤等作用[13～17]。土木香內酯通過誘導活性氧（ROS）的產生和DNA損傷的方式達到抗腫瘤作用，還可以選擇性地抑制信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）的活性，發揮抗腫瘤活性。王紫潔等[18]研究得出土木香內酯通過阻斷Wnt/β-catenin 信號通路對食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲產生抑制作用的同時促進其凋亡，為治療食管癌提供新思路。異土木香內酯的抗腫瘤作用近些年備受關注。相關研究顯示其具有良好的抗腫瘤效果[19]。胡艷玲等[20]通過體外培養宮頸癌細胞株，研究得出異土木香內酯可有效抑制宮頸癌細胞遷移、侵襲及上皮間質轉化。張秀娟等[21]選取MCF-7細胞株，通過MTT 法與SRB法研究得出，異土木香內酯對MCF-7 細胞具有較強增殖抑制活性，可以通過PI3K/Akt 途徑和線粒體途徑共同誘導MCF-7 細胞凋亡，從而抑制乳腺癌的發生。去氫木香內酯是木香的主要活性成分，其具有抗腫瘤、抗菌、抗潰瘍等作用[22]。研究表明，去氫木香內酯可以促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增生，還可以抑制ADP誘導的血小板聚集，達到抗心血管病的藥效作用[23，24]。

綜上所述，甲基丁香酚、土木香內酯、異木香內酯、去氫木香內酯可作為蒙藥肉豆蔻五味的藥效成分。本研究有利于進一步研究肉豆蔻五味的藥效關系，為肉豆蔻五味的質量控制提供理論依據。