基于網絡藥理學研究萘哌地爾衍生物YMⅢ降壓作用及機制初探

李冬梅，邊夢霓，侯毅杰，董永和，馬俊兵，邱敏，楊征

（包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040）

高血壓已成為威脅全球公共衛生安全的重大隱患之一。長期高血壓容易誘發各種心腦血管疾病，造成心、腦、腎等重要靶器官損害，最終導致器官衰竭。目前經典的降壓藥無法滿足難治性高血壓人群的降壓目標值。因此，迫切需要進一步探索高血壓發生發展的新機制和更有效的降壓藥物。

萘哌地爾為國內批準的一類降壓藥，通過特異性α1腎上腺素受體拮抗、鈣離子通道阻斷、5-HT1A激活等作用介導血管擴張，發揮降壓作用[1，2]。鑒于其降壓作用有限，中國科學院貴州省天然藥物化學重點實驗室通過加工修飾萘哌地爾側鏈，人工合成萘哌地爾衍生物YMⅢ，如圖1 所示（R 為保密基團）。本課題組前期研究表明YMⅢ具有拮抗α1-AR及抑制VSMC 增殖的作用[3，4]，對于其降壓機制的系統性研究報道國內外罕見。作為當前熱門的新興學科，網絡藥理學是以網絡生物學、藥理學、生物信息學、系統生物學等相關學科為基礎，通過構建生物網絡來研究疾病發病機制，并全面剖析藥物干預疾病的分子關聯機制，破除了傳統醫學“一靶標一疾病一藥物”治療模式的局限性，為疾病高效治療和新藥開發提供新思路新方法[5，6]。本課題運用網路藥理學方法，闡述YMⅢ在高血壓治療中發揮關鍵作用的靶點、分子途徑和生物過程，分析YMⅢ的降壓機制，并通過實驗加以驗證，為推進新型降壓藥物的發現和應用提供參考。

圖1 YMⅢ結構圖Fig.1 YMⅢstructure diagram

1 材料與方法

1.1 化合物靶點預測

從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫下載萘哌地爾2D 格式化學結構，輸入到Swiss Target Prediction（Gfeller et al.，2013；Daina et al.，2019）（http：//www.swisstargetprediction.ch/），經去支鏈、保主鏈處理（即為YMⅢ主要研究結構），物種選擇“智人”，取預測分數大于0的靶點作為YMⅢ藥理靶點。SwissADME（swissadme.ch）為檢索化合物物理化學性質、藥代動力學、藥物相似性和藥物化學友好性的網絡工具，為新藥的開發和臨床應用提供重要信息[7]。通常藥代動力學分析，胃腸道吸收高和藥物相似性分析中超過3 個“是”，“0”違規，證明該化合物具有活性[8]。將藥物靶點導入UniProt（https：//www.UniProt.org/）數據庫，規范基因名稱。

1.2 疾病相關靶點識別

以Gene Cards（http：//www.genecards.org/）人類基因數據庫作為搜索疾病靶點工具，以“高血壓”為關鍵詞，篩選高血壓靶點，再以前述同樣方式經UniProt規范基因名稱。

1.3 PPI網絡構建

將篩選的疾病和藥物靶點導入Draw Venn Diagram（http：// bioinformmatics.psb.ugent. be/webtools/venn/）獲取交集靶點。STRING 數據庫（https：//STRINGdb.org/）用來檢索已知和預測的蛋白質與蛋白質之間關聯，將交集基因導入該數據庫，物種選擇“智人”，最高置信度蛋白互交參數評分值＞0.4，默認其他參數設置，去掉網絡中的游離節點后，將蛋白互作數據傳入Cytoscape 3.8.2 進行拓撲分析并構建PPI網絡，預測YMⅢ抗高血壓的重要靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析

通過DAVID（https：//DAVID.ncifc rf.gov/）進行基因本體（GO）功能富集分析、京都基因和基因組百科全書（KEGG）途徑富集分析，探索YMⅢ抗高血壓涉及的生物過程和相關信號通路，P＜0.05 視為參考范圍。通過微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在線作圖工具直觀展示基因功能與通路富集結果。

1.5 分子對接

分子對接用于預測小分子化合物與目標蛋白的結合能力。YMⅢ骨架結構（去掉R 集團）作為小分子化合物獲取SDF 格式，其3D 結構在RCSB PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）中獲取。分子對接所涉及的配體和蛋白質由Auto Dock 軟件（http：//vina.scripps.edu/）實現，對目標蛋白進行去除水分子、加氫、修飾氨基酸、優化能量和調整力場參數，之后利用PyRx 軟件內部的Vina 進行虛擬篩選，配體和受體間的結合能力通過Binding Affinity（kcal/mol）值表示，數值越低表示結合越穩定，最后使用DS2019軟件作圖。

1.6 實驗藥品與試劑

YMⅢ：由中國科學院貴州省天然藥物化學重點實驗室提供，純度為99%，用無水乙醇超聲溶解，使用前用三蒸水稀釋配制成所需濃度;重酒石酸去甲腎上腺素（NA）、咖啡因（Caffeine）：美國Sigma 公司產品，純度均為99%，使用時用三蒸水配制；正常Krebs保養液的組成（mmol·L-1）：NaCl 120.0 mmol·L-1、KCl5.4mmol·L-1、CaCl22.2mmol·L-1、MgSO47.0mmol·L-1、H2O 1.0 mmol·L-1、NaHCO325.0 mmol·L-1、葡萄糖（C6H12O6）5.6 mmol·L-1、溶液pH 7.4；無鈣Krebs保養液的組成（mmol·L-1）：不含CaCl2，并加入EGTA 0.5 mmol·L-1，其他同正常Krebs保養液。

1.7 動脈血管條制備

家兔體質量（2.3±0.4）kg，雌雄兼用。木棒擊頭致昏后即刻取出胸主動脈，用棉簽擦拭并去除內膜，剪成約長20 mm、直徑2.5 mm 的螺旋條，投放于含有Krebs 營養液20 mL 的恒溫（37 ℃）水浴槽中，持續通入95 %O2＋5 %CO2混合氣體，pH 7.3～7.4，靜息負荷2 g，每隔15 min 更換營養液1 次，反復沖洗，平衡90 min 后給藥觀察。血管的收縮經張力換能器連接于XWTD-204 臺式自動平衡記錄儀記錄之。實驗中所用藥物濃度均按最終浴槽濃度計算。

1.8 YMⅢ對NA 所致動脈血管收縮效應的影響

在浴槽內加入NA 10-6mol·L-1，待動脈條收縮至坪值后沖洗，平衡1 h 后，以同法加入同量的NA，重復數次至收縮高度前后兩次基本不變，視為動脈條的收縮已達穩定。平衡1 h 后，用無Ca2+Krebs 沖洗，穩定3 min，再加入NA 10-6mol·L-1，可見動脈條產生迅速而短暫的收縮。待其舒張平穩后，累計加入CaCl21.1 mmol·L-1，2.2 mmol·L-1，可見隨Ca2+濃度增加，動脈條再次收縮并達峰值，此為藥前對照。然后用正常Krebs反復沖洗，平衡1 h，加入無Ca2+Krebs液，同時加入不同濃度YMⅢ（10-8、5×10-8、10-7mol·L-1），穩定3 min，重復上述實驗。實驗結束前再做一次無Ca2+NA 收縮對照，將血管條收縮高度與給YMⅢ前基本一致的收入統計資料。

1.9 YMⅢ對咖啡因所致動脈血管收縮效應的影響

在正常Krebs 液浴槽內加入KCl 50 mmol·L-1，使動脈條平滑肌細胞內Ca2+負載，并產生一定的收縮，再用無Ca2+Krebs 液置換正常Krebs 液，3 min 后加入咖啡因60 mmol·L-1，見動脈條產生迅速而短暫的收縮，以此為藥前對照。用正常Krebs液反復沖洗并平衡1 h，重復上述實驗，但在加入無Ca2+Krebs液的同時加入YMⅢ，然后再加入等量咖啡因。實驗結束前再做一次無Ca2+咖啡因收縮對照，將血管條收縮高度與給YMⅢ前基本一致的收入統計資料。

1.10 統計學方法

全部資料的整理、分析均用SPSS 24.0統計學軟件。實驗數據以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。檢驗水準為α=0.05，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 化合物靶點獲取

共獲得104 個YMⅢ預測靶點，且YMⅢ符合經SwissADME 評估的藥代動力學標準，具備成藥開發潛力。預測靶點在規范基因名后得到104 個YMⅢ藥理靶點，呈現的化合物-靶點網絡（見圖2a）有105 個節點（1 個化合物節點，104 個目標節點）和104 條邊。

圖2 藥物-靶點-疾病網絡圖Fig.2 Drug-target-disease network diagrama 化合物-靶點網絡；b 疾病-靶點網絡；c YMⅢ和高血壓靶標的venn 圖；d 蛋白質-蛋白質相互作用網絡。節點面積由大到小和顏色由深到淺代表度值的降序。a Compound-target network; b Disease-target network; c The Venn diagram of YMⅢand Hypertension targets;d Proteinprotein interaction network. The node area from large to small and color from dark to light represent the descending order of degree values.

2.2 高血壓靶點篩選

共得到8 968 個高血壓靶點，靶點相關性評分≥中位數為標準并連續篩選，最終確定“相關性評分＞1.074131489”為標準篩選疾病靶點，并通過Uniprot進行基因名稱規范，最終獲得2 286 個研究相關的高血壓靶點，見圖2b所示疾病-靶點網絡。

2.3 蛋白互作網絡圖構建和關鍵靶點篩選

2286 個疾病靶點和104 個藥物靶點經Venn 分析得到46 個交叉靶點（見圖2c），視為YMⅢ治療高血壓的潛在作用靶點。將交叉靶點導入STRING，去除游離節點UTS2R 和TACR3 后經Cytoscape 軟件的“Analyze Network”模塊進行拓撲分析，計算網絡節點度值，構建出擁有44 個節點、125 條邊的PPI網絡（見圖2d），節點顏色越深度值越大，表示節點越重要，度值較高的靶點依次是SLC6A4、SRC、SLC6A3、CHRNA7、EGFR、DRD2、PRKCB、HTR2A、JAK2、AR、PRKCD、ADRA2A、ADRA2C、HTR2A、HTR1A，可能在YMⅢ抗高血壓中發揮重要作用。

2.4 GO和KEGG富集分析和靶點-通路網絡搭建

將46 個交集靶點導入DAVID 數據庫，物種選擇“智人”。GO富集結果顯示，共有179 個生物過程（BP）、30 個細胞組分（CC）和50 個分子功能（MF）；共有42 條具有統計學意義的KEGG富集通路。根據P值大小取前10 個條目經微生信在線作圖（見圖3）。結果顯示，YMⅢ的降壓作用主要通過目標靶點對腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、MAPK級聯的正調節、突觸囊泡胞吐作用調控、胞漿鈣離子濃度正調節、細胞鈣離子穩態、對藥物的反應、血管收縮的正調節等生物過程的調節實現。這些生物過程的調節主要由神經活性受體配體相互作用、鈣信號通路、縫隙連接、TRP 通道的炎癥介質調節、多巴胺能突觸等信號通路介導完成，為了直觀展現目標靶點與主要信號通路的相互作用關系，構建圖4所示的靶點-通路圖，我們發現神經活性受體配體相互作用通路與目標靶點關聯最多，可能是YMⅢ治療高血壓的關鍵通路。

圖3 GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysisa GO富集分析（BP：生物過程，cc：細胞組分，MF：分子功能）；b KEGG富集分析。a GO enrichment analysis(BP:Biological Process,cc:Cellular Component,MF:MolecularFunction);bKEGGenrichmentanalysis.

圖4 靶點-通路網絡圖Fig.4 Targets-pathways network diagram黃色節點代表靶點，紫色節點代表作用通路。yellow nodes represent targets,and purple nodes represent pathways of action.

2.5 分子對接

YMⅢ骨架結構作為小分子化合物，交集基因中選取度值≥7 的13 個關鍵靶點作為對接受體（未找到SLC6A3蛋白結構，不納入受體組），對接結果證實化合物能夠與關鍵靶點緊密結合（見表1、圖5），進一步驗證了YMⅢ的抗高血壓作用。

表1 化合物與關鍵靶點的對接結果Tab.1 Docking results of compounds to key targets

圖5 YMⅢ和關鍵靶點分子對接結果Fig.5 Docking results of YMⅢand key target moleculesa 溶質載體家族6 成員4；b 原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC；c 膽堿能受體煙堿α；d 表皮生長因子受體；e 多巴胺受體D2；f 蛋白激酶C，β；g Janus激酶2；h 雄激素受體；i 蛋白激酶C，δ；j 5-羥色胺受體2A；k 腎上腺素受體α2A；l 腎上腺素受體α2c；m 5-羥色胺受體1A。a SLC6A4;b SRC;c CHRNA7;d EGFR；e DRD2;f PRKCβ;g JAK2; h AR；i PRKCδ；j HTR2A; k ADRA2A；l ADRA2C; m HTR1A.

2.6 萘哌地爾衍生物YMⅢ對NA 所致動脈血管收縮效應的影響

結果表明，與無Ca2+液中NA所致血管條短暫收縮對比，YMⅢ10-8、5×10-8、10-7mol·L-1組對血管條的收縮均呈顯著抑制作用，對復Ca2+后NA誘發的血管條持續收縮，同量的YMⅢ組對血管條收縮也有抑制效應（P＜0.05）（見圖6）。

圖6 YMⅢ對NA所致動脈血管收縮效應的影響Fig.6Effect of YMⅢon NA-induced arterialvasoconstriction effecta NA組和YMIII組在無Ca2+和復Ca2+條件下的血管收縮曲線圖；b 無Ca2+條件下YMⅢ對NA引起動脈血管收縮的影響；c 1.1 mmol·L-1 Ca2+條件下YMⅢ對NA引起動脈血管收縮的影響；d 2.2 mmol·L-1 Ca2+條件下YMⅢ對NA引起動脈血管收縮的影響，*P＜0.05；**P＜0.01。a Vasoconstriction curves in the NA and YMⅢgroups under Ca2+-free and Ca2+-loading conditions；b Effect of YMⅢon NAinduced arterial vasoconstriction under Ca2+-free conditions；c Effect of YM Ⅲon NA-induced arterial vasoconstriction under 1.1 mmol·L- 1 Ca2 +conditions；d Effect of YMⅢon NA-induced arterial vasoconstriction under 2.2 mmol·L- 1 Ca2 + conditions，*P＜0.05；**P＜0.01.

2.7 萘哌地爾衍生物YMⅢ對咖啡因所致動脈血管收縮效應的影響

結果顯示，在無Ca2+液中咖啡因可使血管條收縮，加入YMⅢ10-5mol·L-1后對血管條收縮沒有抑制作用（P＞0.05）（見圖7）。

圖7 YMⅢ對咖啡因所致動脈血管收縮效應的影響Fig.7Effect of YMⅢon caffeine-induced arterial vasoconstriction effecta 咖啡因組和YMⅢ組在無Ca2+條件下的血管收縮曲線圖；b 無Ca2+條件下YMⅢ對咖啡因引起動脈血管收縮的影響，ns：差異無統計學意義。a Vasoconstriction curves in the caffeine group and the YMⅢgroup under Ca2+-free；b Effect of YMⅢon caffeine-induced arterial vasoconstriction under Ca2+-free conditions，ns：Not statistically significant.

3 討論

高血壓是一種常見的由神經、體液、免疫炎癥、胰島素抵抗等多因素共同參與形成的慢性疾病。其特點是血管持續收縮、血容量增多、內皮功能障礙和動脈硬化。因此，降低交感活性、抑制RASS 系統和免疫調節等方式成為高血壓治療的關鍵。雖然針對特定發病機制的降壓藥物不斷涌現，但目前全世界僅有不足14%的高血壓群體降壓達標[9]，因此迫切需要開發可調控多種高血壓發生發展機制的具有高效降壓特點的新型降壓藥。而網絡藥理學方法具有挖掘尚未開發物質與疾病之間復雜關系的特性，因此，網絡藥理學成為新藥開發的重要手段。

前期研究表明YMⅢ具有抗α1-AR 及抗VSMC增殖作用，血管平滑肌細胞增殖和血管高收縮性與高血壓發生發展密切相關[10]，由此認為YMⅢ可能具有抗高血壓作用，但目前關于YMⅢ降壓機制的闡述尚未完全明確。因此，本課題組通過網絡藥理學深度挖掘YMⅢ與高血壓之間的復雜關系，分析其降壓機制，并通過實驗來驗證預測。

經數據庫篩選共獲得104 個YMⅢ靶點和2 286個高血壓靶點，確定了46 個潛在的治療靶點。圖2d 所示，SRC、SLC6A4、SLC6A3、CHRNA7、EGFR、PRKCB、JAK2、DRD2、HTR2A、AR、PRKCD、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、HTR2A 節點度值較大，是YMⅢ抗高血壓的重要治療靶點。分子對接進一步證實YMⅢ與重要靶點緊密對接以發揮其藥理作用。為進一步闡明46 個潛在治療靶點的功能及分子途徑，進行了GO和KEGG富集分析。結果顯示，YMⅢ通過調節多條信號通路介導的多種生物過程干預高血壓，其中神經活性配體受體相互作用通路可能是YMⅢ控制血壓的最關鍵通路。綜上所述，YMⅢ能夠通過多靶點、多途徑作用于高血壓的多個病理生理機制，表現出YMⅢ降壓的全面性。

如圖4 所示，主要信號通路密切相關的靶點有PRKCB、PRKCD、SRC、ADRB1、ADRA1D、ADRA1A、ADRA1B、DRD1、DRD2、DRD5、HTR2A、EGFR、MAPK14、PTGER2、CHRNA7。其中ADRA1D、ADRA1A、ADRA1B 是α1-AR 的三種亞基因型，對維持血壓穩定至關重要，α1a-AR 在阻力動脈中顯著表達，發揮明顯升壓作用[11]。ADRA1D、ADRA1A、ADRA1B 是神經活性配體受體相互作用通路中的關鍵基因，廣泛存在于血管平滑肌細胞。其作為G 蛋白偶聯受體超家族成員，激活PLC-IP3 信號通路，使細胞內Ca2+含量增加，收縮血管[12～14]。在高血壓疾病中，各種因素導致交感神經系統過度激活，通過α-AR 介導血管收縮，增加血壓[15]。因此，預測YMⅢ通過調節α 腎上腺能受體-配體間的相互作用發揮降壓功能。

血管平滑肌細胞內Ca2+濃度上調主要通過肌質網鈣釋放和細胞外Ca2+內流兩種方式，PLC 激活相關IP3受體和Ca2+，誘導Ca2+釋放（CICR）相關的蘭尼堿受體（RyR）是肌質網重要的兩種Ca2+釋放通道[16，17]。本實驗中，YMⅢ抑制無鈣液中NA 誘導的血管收縮，對咖啡因誘導蘭尼堿受體（RyR）激活介導的血管收縮無抑制作用，說明YMⅢ可能對響應于腎上腺素能受體的PLC-IP3 介導的Ca2+釋放有抑制作用；復Ca2+后NA 介導血管持續收縮，該過程中激動劑誘導GPCR-PLCβ 信號通路激活并形成IP3、DAG，IP3、DAG參與調控受體操作Ca2+通道（ROCC）和存儲操作Ca2+通道（SOCC）并介導細胞外鈣內流，維持血管平滑肌持續活化[18～20]，YMⅢ抑制復Ca2+后的血管收縮，說明YMⅢ對腎上腺素受體激活依賴的維持細胞內Ca2+穩態所必需的Ca2+內流通路也有抑制作用。因此，考慮YMⅢ可能通過對腎上腺素受體-配體結合的抑制，調節細胞內的Ca2+穩態，從而調節血管收縮和血壓，同時也驗證了網絡藥理學的預測。

該實驗僅對YMⅢ抗高血壓的單一途徑進行驗證，鈣信號通路、縫隙連接、TRP 通道的炎癥介質調節、多巴胺能突觸等信號通路與高血壓的治療密切相關，還需要進一步的實驗驗證。

4 結論

我們通過網絡藥理學研究和分子對接驗證，YMⅢ通過多靶點、多途徑干預高血壓的發生發展，體外實驗進一步證實YMⅢ主要通過調節α 腎上腺素受體參與的神經活性受體配體相互作用信號通路發揮降壓作用，為YMⅢ抗高血壓作用提供了理論依據，并為高血壓的治療提供新思路。