骨關節炎患者滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA表達水平及其與預后的關聯性分析

付道通, 劉長杰, 張益民

骨關節炎是臨床最常見的退行性疾病,也是老年人殘疾的主要原因,為患者及其家庭帶來巨大的健康和經濟負擔[1-2]。目前,臨床尚無標準的關節炎治療方法,其治療目的主要是延緩疾病進展、緩解疼痛,部分患者最終可能會發展為終末期[3]。因此,目前亟需尋找骨關節炎預后相關生物標志物,以促進高?；颊叩脑缙诤Y查和干預,改善患者預后。既往研究顯示,sestrin2過表達可增加磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)激活蛋白激酶信號的活性,恢復線粒體生物發生并抑制神經炎癥,進而減輕骨關節炎疼痛[4]。哺乳動物雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)可協調骨關節炎顳下頜關節軟骨細胞的自噬和凋亡信號,與骨關節炎的發生、發展密切相關[5]。鑒此,本研究旨在分析骨關節炎患者滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA的表達水平及其與患者預后的關聯性,以期為臨床治療方案的制定提供理論依據。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2019年10月至2022年10月濰坊市人民醫院收治的骨關節炎患者120例,均接受膝關節置換術,根據患者術后6個月的Lysholm評分情況將其分為預后不良組(<70分,31例)和預后良好組(≥70分,89例)[6]。兩組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準(19Z0235),患者知情同意參與。

表1 兩組基線資料比較

1.2納入與排除標準 納入標準:(1)經CT或彩色多普勒超聲檢查,符合《骨關節炎診療指南(2018年版)》[7]中關于骨關節炎的診斷標準;(2)單側病變;(3)患者臨床資料及隨訪資料完整。排除標準:(1)合并骨結核、骨腫瘤或其他骨代謝異常疾病者;(2)合并其他急慢性炎癥性疾病、免疫系統疾病、感染性疾病者;(3)有類風濕性關節炎者;(4)認知障礙或精神異常疾病者。

1.3治療方法 參考《骨關節炎診療指南(2018年版)》[7]對研究對象進行膝關節置換術治療?；颊呷∑脚P位,行持續硬膜外聯合蛛網膜下腔阻滯麻醉?；贾惭b止血帶,于膝前正中取切口,采集滑膜組織(0.2 cm×0.2 cm),切除后方所有骨贅,于股骨遠端截骨,髓內定位。于股骨遠端切入開口,長桿置入深度需達股骨峽部,短桿置入深度約為20 cm。行脛骨平臺截骨,骨水泥固定。

1.4滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平檢測 采用超聲波粉碎滑膜組織后于無菌環境中加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)進行研磨,制成勻漿后以3 000 r/min離心15 min,取上清液轉移至干燥潔凈EP管中,-80 ℃保存備檢。應用RNA提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)提取滑膜組織的總RNA,后采用反轉錄試劑盒(上海聯碩生物科技有限公司)將其反轉錄得cDNA,并以cDNA為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。qRT-PCR反應參數:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環。所用引物序列見表2。以GAPDH為內參,通過2-△△CT法計算sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA的相對表達量。

表2 引物序列

1.5關節液炎性標志物檢測 于患者入院后24 h內無菌抽取關節液1 ml,3 000 r/min離心10 min后取上清液。采用酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測關節液白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表達水平,檢測試劑盒購自武漢華爾納生物科技有限公司,實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1兩組滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA及關節液炎性標志物表達水平比較 預后不良組mTORC1 mRNA、IL-8、IL-6、TNF-α水平顯著高于預后良好組(P<0.05),sestrin2 mRNA水平顯著低于預后良好組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA及關節液炎性標志物表達水平比較

2.2骨關節炎預后不良患者滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA與關節液炎性標志物的相關性分析結果 Pearson相關分析結果顯示,骨關節炎預后不良患者滑膜組織sestrin2 mRNA水平與關節液IL-8、IL-6、TNF-α水平均呈負相關(P<0.05),mTORC1 mRNA水平與IL-8、IL-6、TNF-α水平均呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 骨關節炎預后不良患者滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA與關節液炎性標志物的Pearson相關分析結果

2.3影響骨關節炎患者預后不良的多因素logistic回歸分析結果 以骨關節炎患者預后情況為因變量(預后不良=1,預后良好=0),以滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA,以及關節液IL-8、IL-6、TNF-α為自變量進行多因素logistic回歸分析。結果顯示,滑膜組織mTORC1 mRNA表達水平上升是促進骨關節炎患者預后不良發生的獨立危險因素(P<0.05),而較高水平的sestrin2 mRNA是抑制骨關節炎患者預后不良發生的保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響骨關節炎患者預后不良的多因素logistic回歸分析結果

2.4滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平對骨關節炎患者預后的預測價值 ROC曲線分析結果顯示,滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平能有效預測患者的預后情況(P<0.05),且兩者聯合的預測效能更優[AUC(95%CI)=0.906(0.848～0.963),P<0.001],靈敏度和特異度分別為93.53%、78.76%。見表6,圖1。

表6 滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平預測骨關節炎患者預后的ROC曲線分析結果

圖1 滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平預測骨關節炎患者預后的ROC曲線圖

3 討論

3.1骨關節炎作為一種非炎性滑膜關節退行性疾病,影響全球60歲以上10%的男性和16%的女性,其主要特征是軟骨破壞、軟骨下骨損傷、滑膜炎癥和骨贅形成[8]。骨關節炎的發生與年齡、勞損、創傷等多種因素有關,但確切病因及發病機制尚不清楚[9]。骨關節炎可涉及身體各部位關節,包括身體承重關節膝關節、髖關節和脊柱,嚴重影響關節的正常功能和患者生活質量,嚴重時甚至會導致殘疾[10]。由于目前缺乏骨關節炎早期診斷及預后預測的有效方法,使得許多患者確診時疾病已發展至終末期,需行關節置換手術,給患者帶來較大的負擔[11-12]。

3.2sestrin2是一種高度保守的蛋白分子,位于編碼基因6號染色體,屬于sestrin家族。其不僅參與調控心血管疾病,而且在癌癥、椎間盤退變、神經退行性疾病的發生、發展中也發揮了重要作用[13]。sestrin2是一種應激反應蛋白,可調控AMP激活蛋白激酶-mTORC1通路,對抗氧化應激和抗細胞毒性有細胞保護作用[14]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種高度保守的蛋白激酶,其中mTORC1是雷帕霉素的敏感靶點,與細胞自噬密切相關[15-16]。本研究結果顯示,滑膜組織中sestrin2 mRNA呈低表達,mTORC1 mRNA呈高表達,推測sestrin2、mTORC1參與骨關節炎疾病進展的可能機制為:(1)低表達sestrin2對mTORC1的抑制作用降低,骨關節炎患者體內抗氧化應激和抗炎癥作用降低,炎癥及其誘導的分解代謝作用使軟骨功能改變,導致疾病進展。既往研究表明,炎癥及其誘導的分解代謝作用可導致軟骨細胞數量減少、軟骨功能改變、軟骨細胞外基質進一步分解,進而在骨關節炎的疾病進展中發揮重要作用[17-18]。(2)sestrin2表達降低,使得其抑制細胞凋亡和軟骨細胞外基質降解的功能減弱。Tu等[19]研究發現,sestrin2可通過抑制mTORC1和激活AMP激活蛋白激酶信號活性增強自噬,進而抑制應激誘導的細胞凋亡和細胞外基質降解。另外,本研究結果顯示,滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平與關節液炎性標志物均具有顯著相關性。分析認為這一現象可能是由于骨關節炎患者機體強烈的炎癥級聯反應通過細胞因子網絡系統,啟動了滑膜組織的成骨功能。既往文獻報道顯示,炎性因子IL-8、IL-6、TNF-α水平均與骨關節炎患者關節功能及臨床癥狀嚴重程度相關[20],進一步佐證了sestrin2、mTORC1與骨關節炎發生、發展的關聯性。提示在臨床治療骨關節炎時,臨床醫師不僅需要重視控制炎癥反應,亦應關注軟骨細胞數量以及軟骨功能的改變情況。

3.3本研究結果顯示,滑膜組織sestrin2 mRNA、mTORC1 mRNA水平均可有效預測骨關節炎患者的預后情況,且二者聯合的預測效能更高,靈敏度和特異度分別達93.53%、78.76%。據此,對于滑膜組織sestrin2 mRNA相對表達量低于0.86、mTORC1 mRNA高于1.27的骨關節炎患者,臨床醫師應予以重視,積極調整治療方案以改善患者預后。

綜上所述,滑膜組織sestrin2 mRNA表達水平降低、mTORC1 mRNA表達水平升高與骨關節炎患者預后不良相關,這為臨床早期診治提供了新思路。但對于sestrin2和mTORC1誘發骨關節炎的具體機制尚需進一步研究驗證。