eIF4E3與肝細胞癌患者預后的關聯性及其作用機制分析

祖 玲, 李萬里, 劉天奇

原發性肝癌是全球常見的腫瘤之一,在所有癌癥中其發病率和病死率分別排在第6位和第3位[1]。原發性肝癌主要包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝內膽管癌兩種類型,其中HCC占75%～85%[2],是肝癌患者的主要死亡原因[3]。由于HCC的瘤內異質性和耐藥性[4],患者可用的治療方法有限,預后往往不理想,5年生存率約為18.4%[5-6]。因此,迫切需要探索更有效的治療靶點來改善HCC患者的生存預后。有研究表明,用真核翻譯起始因子4E家族成員3(eukaryotic translation initiation factor 4E family member 3,eIF4E3)、GEMIN5和NCBP2基因構建的N7-甲基腺苷風險評分(m7G Risk Score,MRS)可用于評估大腸癌患者的預后情況,低MRS組表現出更好的免疫活性,對免疫治療的反應更好[7]。eIF4E3是真核翻譯起始因子,位于細胞核和細胞質中,支持mRNA的輸出和翻譯。既往研究表明,eIF4E3在急性髓系白血病、頭頸部鱗狀細胞癌中起抑癌作用[8]。也有研究發現eIF4E3可以阻礙致癌轉化,并在某些癌癥中表達缺失,這一機制可能具有重要的生物學和臨床意義[9]。但是,目前關于eIF4E3與HCC發生、發展關聯性的研究較少。鑒此,本研究旨在探討eIF4E3在HCC中的表達水平,分析其與預后、腫瘤免疫微環境的關聯性,并通過不同數據庫進行交叉驗證,為eIF4E3作為HCC的治療靶點和生物標志物提供理論依據。

1 資料與方法

1.1數據采集 以公共數據庫數據和生信分析的網頁工具為基礎開展研究。以“HCC”“transcriptome profiling”“gene expression quantification”為關鍵詞進行檢索,得到TCGA-HCC數據集,其中包含正常肝臟組織和HCC組織的基因表達數據,以及標本來源患者的臨床資料。生存數據缺失的樣本不納入生存分析。

1.2eIF4E3的表達及其與預后的關聯分析 應用腫瘤免疫評估資源(Tumor Immune Estimate Resource,TIMER)數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)探索eIF4E3在不同腫瘤與正常組織的表達差異[10]。應用癌癥基因集分析(Gene Set Cancer Analysis,GSCA)數據庫[11](http://bioinfo.life.hust.edu.cn/GSCA)、肝細胞癌整合分子數據庫(Hepatocellular Carcinoma Database,HCCDB)[12](http://lifeome.net/database/hccdb/search.html)和UALCAN數據庫[13](http://ualcan.path.uab.edu)分析eIF4E3在HCC組織和正常肝組織中轉錄水平和蛋白質表達水平的差異。應用UALCAN數據庫分析eIF4E3表達情況與HCC臨床病理特征的關聯性。應用GSCA的生存分析模塊和Kaplan-Meier Plotter數據庫[14](http://kmplot.com/analysis/)進行生存分析。

1.3共表達網絡構建及功能富集分析 應用Linked Omics數據庫[15](http://www.linkedomics.org/login.php)鑒定eIF4E3共表達基因。以P<0.01、R>|0.4|作為篩選標準,將所得到的共表達基因通過Linked Omics數據庫的基因富集分析模塊和Sanger Box生物信息分析平臺(http://sangerbox.com/Tool)進行基因本體論(Gene Ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,探索eIF4E3共表達基因的主要功能。

1.4免疫滲透分析 通過腫瘤免疫相互作用數據庫(Tumor-Immune System Interactions Database,TISIDB)(http://cis.hku.hk/TISIDB/index.php)探討eIF4E3表達與HCC免疫亞型及免疫細胞浸潤豐度的關聯性[16]。應用Sanger Box生物信息分析平臺的CIBERSORT算法探索HCC中eIF4E3表達情況與22種免疫細胞浸潤的相關性[17-18]。通過Estimate算法進一步預測腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)中的腫瘤純度,包括間質評分(捕獲腫瘤組織中間質的存在)、免疫評分(代表免疫細胞在腫瘤組織中的滲透程度)和估計評分(推斷腫瘤純度)[19]。通過免疫表觀評分(immune phenotype score,IPS)模塊探索HCC中eIF4E3表達與IPS的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1eIF4E3在HCC組織中的表達情況 基于TIMER數據庫資料的分析結果顯示,eIF4E3 mRNA在HCC、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、結腸癌、頭頸鱗狀細胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、前列腺腺癌、直腸腺癌、胃癌、子宮內膜癌中的表達下調,在膽管癌中呈高表達,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1?。進一步通過GSCA、UALCAN和HCCDB數據庫資料進行驗證,結果證實eIF4E3在HCC中呈低表達,與正常肝組織比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1?～?。

?針對TIMER數據庫數據分析eIF4E3在不同腫瘤組織和正常組織中的表達差異情況;?GSCA分析顯示eIF4E3在腫瘤組織中低表達(P<0.001);?應用UALCAN數據庫資料分析eIF4E3在HCC組織和正常肝組織中的表達差異(P=0.002);?應用HCCDB數據庫資料分析eIF4E3在HCC組織和正常肝組織中的表達差異(紅色代表腫瘤組織,灰色代表正常組織)。*P<0.05

2.2eIF4E3表達水平與患者性別、腫瘤分期的關聯性分析結果 基于UALCAN數據庫資料分析結果顯示,正常肝組織eIF4E3表達水平顯著高于Stage 1和Stage 2期的HCC組織(P<0.05),且腫瘤分期為Stage 3的HCC組織eIF4E3表達水平顯著高于Stage 1(P=0.047)。見圖2?。女性HCC患者eIF4E3表達水平顯著高于男性(P=0.002)。見圖2?。

圖2 eIF4E3表達水平與患者性別、HCC病理分期的關聯性分析結果圖(*P<0.05)

2.3eIF4E3表達水平與HCC患者生存預后的關聯性分析結果 基于GSCA數據庫資料的分析結果顯示,以eIF4E3表達量的中位數為界值將HCC患者分為eIF4E3低表達組(185例)和eIF4E3高表達組(185例),eIF4E3低表達組的總生存期(overall survival,OS)、無病生存期(disease-free survival,DFS)、無病進展生存期(progression-free survival,PFS)和無疾病間隔(disease-free interval,DFI)均較eIF4E3高表達組顯著縮短(P<0.05)。見圖3?～?。進一步通過Kaplan-Meier Plotter驗證eIF4E3表達與患者生存預后的關聯性,結果顯示eIF4E3低表達HCC患者的OS較eIF4E3高表達者更差,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3?。

?兩組OS比較的生存曲線圖,P=0.029;?兩組PFS比較的生存曲線圖,P=0.024;?兩組DFS比較的生存曲線圖,P=0.018;?兩組DFI比較的生存曲線圖,P=0.032;?基于Kaplan-Meier Plotter數據庫資料的兩組OS比較的生存曲線圖,P=0.014

2.4eIF4E3功能富集分析結果 應用Linked Omics數據庫鑒定eIF4E3的共表達基因(見圖4?),排位前50的eIF4E3正、負相關基因的熱圖見圖4??。按其相關程度排前3位的正相關基因分別是C14orf37、STK17B和TLR2(r=0.601,P<0.001;r=0.596,P<0.001;r=0.575,P<0.001)。GO分析結果顯示,eIF4E3互作基因的生物過程(biological process,BP)主要集中在細胞黏附正向調節、T細胞活化過程、白細胞活化調節、細胞外結構組織、線粒體基因表達、線粒體呼吸鏈復合物組裝和細胞質翻譯等。見圖4?。KEGG分析結果顯示,eIF4E3的共表達基因富集在血小板活化、破骨細胞分化和細胞黏附等途徑。見圖4?。另外,通過Sanger Box網站篩選出529個共表達基因,并對其進行GO分析和KEGG分析,結果顯示eIF4E3的表達可能通過調節TME的免疫反應在HCC發生、發展中發揮作用。見圖5。

2.5eIF4E3與TME中免疫浸潤的關聯性分析結果

TISIDB分析結果顯示,eIF4E3在HCC的不同免疫亞型中的表達差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6?。eIF4E3在創面愈合亞型(C1型)和淋巴細胞耗盡亞型(C4型)中低表達,在干擾素γ優勢亞型(C2型)和炎性亞型(C3型)中高表達。eIF4E3表達水平與自然殺傷(natural killer,NK)細胞(r=0.456,P<0.001)、Th1細胞(r=0.417,P<0.001)和CD8+效應記憶T細胞(r=0.414,P<0.001)的浸潤豐度呈正相關。見圖6?～?。Sanger Box數據庫的CIBERSORT模塊分析結果顯示,在22種免疫細胞中,eIF4E3表達水平與初始CD4 T細胞、靜息NK細胞、單核細胞、靜息肥大細胞及嗜酸性粒細胞的浸潤豐度呈顯著負相關(P<0.05),與靜息CD4記憶T細胞、活化CD4記憶T細胞、M1巨噬細胞、活化樹突狀細胞、靜息樹突狀細胞及中性粒細胞浸潤豐度呈正相關(P<0.05)。見圖7?。Estimate模塊分析結果顯示,HCC中eIF4E3的表達水平與間質評分、免疫評分以及估計評分呈正相關(P<0.05)。見圖7?～?。Sanger Box生物信息分析平臺IPS模塊的分析結果顯示,eIF4E3表達水平與IPS呈正相關(P<0.05),提示eIF4E3表達量越低,患者的免疫治療反應越差。見圖7?。

圖4 基于Linked Omics數據庫資料進行的eIF4E3功能富集分析結果圖

?GO分析結果;?KEGG分析結果

?eIF4E3在HCC的不同免疫亞型中的表達水平比較結果;?～?eIF4E3表達水平與NK細胞、Th1細胞和CD8+效應記憶T細胞浸潤豐度的相關性分析結果

?應用CIBERSORT算法得到eIF4E3表達水平與22種免疫細胞浸潤豐度的關系(*P<0.05)。?～?應用Estimate算法得到eIF4E3表達水平與HCC的間質評分、免疫評分和估計評分的相關性;?LIHC中eIF4E3表達水平與IPS相關性

3 討論

3.1N7-甲基鳥苷(N7-methyladenosine,m7G)修飾與各種癌癥的發生、進展及治療效果的關系已成為目前研究的熱點。eIF4E1在細胞質中以m7G帽結構為基礎發揮作用,運輸一系列與細胞增殖、存活和轉移相關的mRNA,這可能是其致癌的主要機制[9]。eIF4E3是m7G相關基因,是eIF4E蛋白的第3亞家族[20],作為mRNA代謝調節因子,它可與m7G帽結構特異性結合,并在細胞內競爭性抑制eIF4E1,是依賴于m7G非典型帽結合活性的腫瘤抑制因子[9]。研究發現,eIF4E3在結腸癌組織、急性髓系白血病標本以及頭頸部鱗狀細胞癌組織中表達下調[7,21]。也有研究表明,eIF4E3過表達與乳腺癌細胞存活率提高有關[22],miR-501可通過靶向下調eIF4E3表達而促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[23]。

3.2HCC嚴重威脅人類生命健康,其危險因素主要有肝炎病毒感染、飲酒、肥胖和黃曲霉毒素等[24]。雖然近年來HCC的治療已取得顯著進展,但HCC的早期癥狀并不典型,缺乏特異度較高的生物標志物輔助臨床診斷,大多數患者在確診時已至晚期,5年生存率僅為18.4%左右[6,25]。本文通過公共數據庫探討eIF4E3作為診斷HCC及預測患者預后生物標志物的應用潛力。結果表明,eIF4E3在HCC組織中呈低表達,這與Osborne等[8]的研究結果一致,且腫瘤分期為Stage 3的HCC組織eIF4E3表達水平顯著高于Stage 1;女性HCC患者eIF4E3表達水平顯著高于男性。進一步的生存分析結果提示,eIF4E3低表達與患者較差的預后有關,這與Wang等[22]的研究結論相符。GO分析和KEGG分析結果表明,eIF4E3的生物學功能主要與細胞黏附和免疫反應有關,且主要富集于PI3K/Akt信號通路以及癌癥途徑,提示eIF4E3對HCC的作用機制可能與免疫調節有關。

3.3腫瘤浸潤性免疫細胞(tumor infiltrating immune cells,TIICs)可以調節腫瘤的發生、發展[26],TME中的免疫細胞豐度以及腫瘤純度會影響HCC患者的預后及免疫治療效果[27]。本研究通過多個工具網站進行交叉驗證表明,eIF4E3表達水平影響免疫細胞浸潤豐度,與NK細胞、Th1細胞和CD8+效應記憶T細胞的浸潤豐度呈正相關。NK細胞和T細胞是典型的免疫促進細胞,是HCC中主要負責殺傷癌細胞的淋巴細胞亞群[28]。Th1細胞具有抗原提呈的作用,使誘導產生的CD8+T細胞具備更強的效應功能,發揮免疫應答作用[29]。本結果提示,在eIF4E3高表達的HCC中,免疫微環境具有較高的免疫原性,有利于抗腫瘤免疫功能執行,遏制腫瘤的進展。免疫檢查點(immune check point,ICP)基因對免疫細胞功能及免疫治療效果有很大的影響[30],ICP抑制劑作為新興的腫瘤治療方法在癌癥治療方面取得了重大突破[31]。研究表明,HCC的程序性細胞死亡1(programmed cell death 1,PD-1)、程序性死亡受體-1配體(programmed death receptor-1 ligand,PD-L1)等ICP基因表達水平上升會導致免疫抑制,促進肝癌的進展[32]。筆者認為eIF4E3在HCC中具有強大的免疫調節能力,可影響ICP基因的表達水平,有作為免疫治療標志物的應用前景,未來可聯合臨床試驗和基礎實驗對eIF4E3在HCC微環境中的免疫調節作用及分子機制進行更深入的探索。

綜上所述,eIF4E3在HCC中呈低表達,且與疾病的惡性進展具有關聯性,可為HCC患者的免疫治療及分層管理提供參考,其機制可能與免疫細胞浸潤豐度調控有關,但仍需通過臨床和基礎研究進一步驗證。