OsIMA1增強水稻對鎘逆境的適應性

彭鳳　路承凱　梁崗

摘 要：? 鐵（Fe）是植物生長發育所必需的營養元素而鎘（Cd）是對植物有害的元素且對植物Fe和Cd的吸收存在拮抗作用。OsIMA是一類正調控水稻Fe吸收的一類小肽，其過表達可以促進Fe的積累。為探究OsIMA是否參與水稻對Cd脅迫的適應性，該研究以水稻為研究材料，利用熒光定量PCR分析了OsIMA基因的表達水平，通過遺傳轉化和CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了OsIMA1過表達植物和ima1突變體植物，評估了OsIMA1過表達和突變體植物在Cd逆境條件下的株高，并利用電聯耦合等離子體質譜法測量了根和地上部的Fe和Cd含量。結果表明：（1）Cd處理后，OsIMA1和OsIMA2的轉錄水平上調。（2）OsIMA1過表達植物比野生型植物對Cd脅迫更耐受。（3）ima1功能缺失突變體比野生型植物對Cd脅迫更敏感。（4）OsIMA1過表達植株根系的Cd含量較高，而ima1突變體植株地上部的Cd含量較高。綜上所述，OsIMA1通過限制Cd從根向地上部的轉運以增強水稻對Cd逆境的適應能力，該研究結果為定向培育耐Cd作物提供了理論參考。

關鍵詞： 水稻， OsIMA， Cd， Fe， 拮抗作用

中圖分類號：? Q945文獻標識碼：? A 文章編號：? 1000-3142（2023）06-1097-08

OsIMA1 enhances tolerance to cadmium stress in rice

PENG Feng1，2 ， LU Chengkai1，2， LIANG Gang1，2*

（ 1. Key Laboratory of Tropical Plant Resources and Sustainable Use，? Xishuangbanna Tropical Botanical Garden，? Chinese Academy of

Sciences，

Kunming， 650223， China; 2. College of Life Sciences，? University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China ）

Abstract：? Iron （Fe） is crucial for the growth and development of plants and cadmium （Cd） is toxic to plants. There is an antagonistical mechanism between Fe and Cd uptake in plants. OsIMAs are a class of small peptides， and their overexpression improves Fe accumulation in rice. To explore the role of? OsIMA genes in response to Cd stress， we analyzed the expression of two? OsIMA genes by qRT-PCR， generated? OsIMA1 overexpression plants and CRISPR/Cas9 edited? ima1 mutants by genetic transformation， assessed the plant heights of? OsIMA1 overexpressing plants and? ima1 mutant plants under Cd stress， and measured the Fe and Cd concentration of root and shoot. The results were as follows： （1） Transcriptional levels both? OsIMA1 and? OsIMA2 were up-regulated by Cd treatment. （2） Overexpression of? OsIMA1 gene improved the tolerance of plants to Cd stress. （3） The loss-of-function of? OsIMA1 led to the higher sensitivity of plants to Cd stress. （4） OsIMA1 overexpressing plants accumulated more Cd in the root and the? ima1 mutants accumulated more Cd in the shoot. To sum up，? OsIMA1 improves Cd tolerance by restricting Cd translocation from root to shoot， which provides the theoretical reference for breeding the Cd-tolerant rice.

Key words： rice， OsIMA， cadmium， iron， antagonism

Cd是對所有生物都有害的重金屬元素，極易在根系從土壤吸收的過程中與其他二價金屬離子（如Fe和Zn）競爭。Cd還可以通過食物鏈在人體內富集，長期積累可導致骨質疏松癥、癌癥和腎功能障礙等多種疾病。隨著工業化的快速發展以及化肥和農藥的過度使用，土壤中不斷增加的Cd污染已經嚴重威脅到糧食安全，增加了對人類健康的潛在風險，并造成了巨大的經濟損失（Kirkham， 2006; Wei & Yang， 2010）。因此，研究植物吸收Cd的分子機理并篩選和培育耐Cd脅迫或低Cd累積的農作物，對人類健康和生態保護具有重要意義。

由于Cd和Fe具有相似的水合離子半徑，Cd極易通過與Fe競爭并借助Fe離子通道或轉運蛋白進入植物體內（Nightingale， 1959; Eide et al.， 1996; Schutzendubel & Polle， 2002; Clemens， 2006）。Cd在植物體內的積累導致幼葉明顯褪綠、壞死、生長受阻甚至死亡，這與典型的缺Fe癥狀相似（Das et al.， 1997; Cohen et al.， 1998; Yoshihara et al.， 2006）。相關研究表明，Cd脅迫改變了細胞壁成分，增強了細胞壁對Fe的結合能力，導致Fe滯留在根的質外體中，并抑制Fe從根部到地上部的轉運（Xu et al.， 2015），這些癥狀可以通過給植物補給Fe元素得到改善（Bao et al.， 2010; He et al.， 2017; Huang et al.， 2020）。Fe轉運體（iron-regulated transporter 1，IRT1）參與Cd的吸收過程（Cohen et al.， 1998; Korshunova et al.， 1999; Vert et al.， 2002; Fan et al.， 2014; Mao et al.， 2014; Guan et al.， 2019; Zhu et al.， 2020）。在擬南芥里，IRT1的表達直接受轉錄因子FIT（FER-like Iron deficient-induced transcription factor）和bHLH Ib亞族成員（bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101）的調控（Yuan et al.， 2008）。FIT和bHLH38或bHLH39的共表達通過增加根部對Cd的螯合而減少地上部的Cd積累來提高植物對Cd脅迫的耐受性（Wu et al.， 2012）。轉錄因子bHLH104正調控擬南芥Fe穩態，過表達bHLH104則可提高植物對Cd的耐受性（Zhang et al.， 2015; Li et al.， 2016; Yao et al.， 2018）。BTS（BRUTUS）負調控Fe穩態，敲除BTS顯著增強了擬南芥對Cd脅迫的耐受性，同時增加了Fe和Cd的積累（Kobayashi et al.， 2013; Hindt et al.， 2017; Zhu et al.， 2020）。在水稻中，2個Fe轉運蛋白OsNRAMP1（Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 1）和OsIRT1可以介導根系從土壤中吸收Cd，并且過表達OsNRAMP1和OsIRT1可以增加水稻的Cd含量（Lee & An， 2009; Takahashi et al.， 2019）。由于Fe和Cd之間存在拮抗作用，因此水稻缺Fe會顯著增加根系對Cd的吸收，外源施加Fe則會降低水稻的Cd含量并減緩Cd毒害（Shao et al.， 2007）。綜上表明，改善Fe的積累和分配可以顯著減輕Cd對植物的毒害。因此，全面了解Fe和Cd的拮抗作用有利于指導農業生產和降低Cd對植物的毒性。

小肽泛指小于100個氨基酸的蛋白質，具有短的氨基酸共有基序，參與植物生長發育和非生物等逆境的脅迫響應（Czyzewicz et al.， 2013; Matsubayashi， 2014）。IMA（IRON MAN）多肽家族成員的碳末端包含一個17氨基酸的共有基序，在被子植物中高度保守，并且這17個氨基酸就足以代替其全長蛋白發揮作用（Grillet et al.， 2018; Li et al.， 2021）。近年來，小肽作為激素類信號分子受到廣泛的關注，參與器官內通訊、植物發育和脅迫應答（Tavormina et al.， 2015; Takahashi et al.， 2019）。IMA可能介導了Fe從地上部到根部的長距離信號，參與Fe的吸收、轉運和細胞內穩態（Grillet et al.， 2018; Li et al.， 2021）。Meng等（2022）研究表明，過表達IMA可以提高在擬南芥中對Cd脅迫的適應性。但是，目前關于IMA是否可以提高農作物對Cd脅迫的適應性尚不清楚。本研究探究了水稻OsIMA1調控Cd脅迫方面的作用，以期為未來利用分子育種提高水稻對Cd脅迫的耐受性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為粳稻品種“日本晴”，種植地點為云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣勐侖鎮中國科學院西雙版納熱帶植物園的作物保護與育種基地（101°19′ E、21°52′ N）。將水稻種子用雙蒸水（ddH2O）浸泡24 h后均勻地散布在吸水濾紙中，在28 ℃人工溫室黑暗放置3 d后，轉移到1/2MS培養液中萌發生長7 d，轉移至不含Cd或含25 μmol·L-1 氯化鎘（CdCl2）的1/2MS水培液中培養7 d。每2 d換1次水培液。生長光周期為光16 h、暗8 h的循環。

1.2 轉基因植株的構建

利用CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/）在線設計OsIMA1的編輯靶點。通過Overlapping PCR構建包含該靶點的sgRNA，并融合至OsU6a啟動子的下游，然后將OsU6a-sgRNA克隆至攜帶Cas9的pMH-SA載體（Liang et al.， 2016）。將表達載體轉化至農桿菌EHA105菌株中用于水稻轉化，并對轉基因陽性苗進行PCR測序。對純合植株進行擴繁，并進一步對T3代植物在進行PCR測序，獲得純合突變植株。

用玉米Ubiquitin啟動子驅動OsIMA1全長CDS，獲得OsIMA1過表達載體。將構建的質粒轉化至農桿菌EHA105菌株中用于水稻轉化。選用含潮霉素抗性的轉基因植株進行基因表達水平檢測，T3轉基因植株用來試驗分析。

1.3 qRT-PCR

利用水飽和酚法提取水稻根（root）或地上部（shoot）的總RNA。采用RT Primer Mix （oligo dT）和PrimeScript RT Enzyme Mix for qPCR （寶生物，日本）試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，隨后使用PrimeScriptTM RT試劑（Perfect Real Time） Kit （寶生物，日本）在Light-Cycler 480實時PCR儀（羅氏，瑞士）上進行qRT-PCR檢測。每個基因的定量至少含3次生物學重復。以OsACTIN1和OsOBP作為內參對照，對樣品進行歸一化處理。

1.4 Fe和Cd含量測定

不同基因型的水稻材料于1/2MS營養液體萌發生長7 d后轉移至不含Cd或含25 μmol·L-1 CdCl2的1/2MS水培液培養7 d。分別收取根和葉，并置于65 ℃烘箱干燥7 d。用高通量組織研磨儀打磨樣品成粉末。每個樣品稱取500 mg，加入5 mL硝酸于185 ℃中消解3 h，加入2 mL高氯酸于220 ℃氧化30 min。利用美國Thermo SCIENTIFIC公司的電聯耦合等離子體質譜儀（ICP-MS iCAP6300）測定樣品元素含量。

1.5 統計分析

所有試驗數據均使用平均值±標準差（x±s）表示。每個試驗至少有3次生物學重復。利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（one-way variance， ANOVA） （P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫引起水稻OsIMA基因表達上調

水稻基因組包含兩個OsIMA基因（OsIMA1和OsIMA2）。近來的研究表明OsIMA1和OsIMA2受到缺Fe誘導（Kobayashi et al.， 2021）。Cd脅迫會嚴重限制植物的生長發育，從而導致植物表現出缺Fe癥狀。為研究Cd脅迫是否能影響OsIMA1和OsIMA2的表達，對野生型（wild type，WT）水稻進行Cd處理后，檢測了OsIMA1和OsIMA2的表達情況。將在正常培養液上生長7 d的幼苗轉移至不含Cd（Cd0）或含25 μmol·L-1 CdCl2（Cd25）的培養液中生長7 d。提取根和地上部的RNA并利用熒光定量PCR檢測OsIMA1和OsIMA2的表達水平。結果表明，在Cd脅迫條件下，無論在根還是地上部，OsIMA1和OsIMA2的表達均顯著上調（圖1）。

2.2 OsIMA1過表達植株對Cd耐受性更高

OsIMA1和OsIMA2屬于同源蛋白且二者在Fe穩態方面的功能相近?？紤]到二者的轉錄水平均受到Cd處理誘導，本研究接下來以OsIMA1作為代表進行研究。本研究利用玉米的Ubiquitin啟動子驅動OsIMA1基因，并且轉化了野生型水稻品種“日本晴”（圖2：A）。通過定量PCR篩選獲得了OsIMA1的過表達轉基因水稻植株，評估OsIMA1過表達植株對Cd脅迫的適應能力。在正常水培溶液生長一周的幼苗分別轉移到不含Cd （Cd0）或含25 μmol·L-1? CdCl2 （Cd25）的溶液再生長一周，觀察和分析其表型。結果表明，在Cd0生長條件下，OsIMA1的過表達植株與野生型植株無明顯區別，而在Cd25處理條件下，過表達植株的株高顯著高于野生型植株（圖2：B，C）。綜上表明，OsIMA1過表達增強了植物對Cd脅迫的適應性。

2.3 OsIMA1的功能缺失突變體對Cd脅迫更敏感

為了進一步研究OsIMA1在適應Cd脅迫方面的作用，本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術對OsIMA1基因進行了編輯，并獲得了兩個ima1突變體。本研究在OsIMA1基因的編碼區設計了一個特異性的靶點，用OsUba啟動子驅動整合了該靶點的sgRNA，并構建了相應的表達載體。通過轉化野生型水稻愈傷組織，獲得了轉基因植株。通過PCR鑒定及后代分離純化，得到2個純合的突變體株系ima1-1和ima1-2。2個株系均因基因編碼區插入一個堿基導致移碼突變（圖3：A）。此外，本研究對野生型和2個功能缺失突變體的植株進行了Cd處理試驗。在正常水培液生長條件下，2個突變體株系與野生型植株無明顯差別（圖3：B，C）。在Cd處理條件下，突變體植株表現出幼葉缺綠甚至萎蔫等癥狀（圖3：B）。綜上表明，OsIMA1功能缺失增加了植物對Cd的敏感性。

2.4 OsIMA1負調控Cd從根向葉的轉運

本研究結果表明OsIMA1過表達植株比野生型更耐Cd脅迫，而ima1突變體則相反。為了進一步分析OsIMA1正調控Cd耐受的分子機制，本研究測定了野生型、OsIMA1過表達株系和ima1突變體的根和葉片中的Cd和Fe含量。先將在正常培養液中生長7 d的幼苗分別轉移到不含Cd或含有25 μmol·L-1 CdCl2的培養液中培養7 d，然后分別取根和葉用來檢測Fe和Cd的含量。與野生型相比，OsIMA1過表達植株的根和地上部都積累了更多的Fe，而ima1突變體則積累了較少的Fe；OsIMA1過表達植物在根中積累了較多的Cd，而ima1突變體在地上部積累了較多的Cd（圖4）。綜上表明，OsIMA1負調控Cd從根向地上部的運輸。

3 討論與結論

Cd對動植物的生長發育有害，近年來水稻受到Cd污染的事件頻頻發生。因此，減少植物的Cd吸收或提高植物對Cd脅迫的適應性，有利于保障糧食安全。Fe是植物生長發育所必需的營養元素，而缺Fe是導致人類貧血癥的一個主要原因。水稻作為主糧作物，是人類Fe元素的一個主要來源。因此，培育富Fe稻米有益于改善人類健康。由于Fe和Cd之間的拮抗作用，額外施加Fe可以減少植物對Cd的吸收（Wu et al.， 2012; Sebastian & Prasad， 2016）。因此，利用Fe和Cd的拮抗機制可以提高植物對Cd脅迫的適應性。水稻中存在兩個OsIMA基因：OsIMA1和OsIMA2，它們的過表達能激活缺Fe誘導基因的表達，從而增加Fe的累積（Kobayashi et al.， 2021）。本研究發現，Cd脅迫時OsIMA1和OsIMA2的表達顯著上調。Cd處理試驗發現OsIMA1的功能缺失突變體提高了水稻對Cd的敏感性，主要表現在植株葉片白化萎蔫。OsIMA1過表達一方面增加了Fe的積累，另一方面卻抑制了Cd從根向地上部的轉運，這可能是OsIMA1過表達植株對Cd耐受性提高的原因。因此，增加OsIMA1的表達水平是緩解植物Cd毒害的一個有效策略。

Meng等（2022）研究表明，IMA過表達可以提高擬南芥對Cd脅迫的適應能力。本研究發現OsIMA1過表達提高了水稻對Cd脅迫的耐受性。水稻根攝入的Fe和Cd經地上部轉運至稻米中。OsIMA1過表達既促進了Fe在根部的累積，又促進了Cd在根部的積累。但是，OsIMA1過表達促進了Fe在地上部積累的同時，也抑制了Cd從根向地上部的轉運。這表明OsIMA1可以通過特異性地抑制Cd從根向地上部的轉運，提高植物對鎘脅迫的適應性。Fe和Cd同屬于二價離子，在體內可能被類似的轉運蛋白識別。OsIMA1過表達植株根部累積的Fe可能競爭抑制了Cd與這些轉運蛋白的結合。OsIMA1這種限制植物從根向地上部轉運Cd的能力可能有助于減少稻米中的Cd累積。未來可以測試OsIMA過表達是否可減少稻米中的Cd含量。無論在擬南芥還是在水稻中，IMA均具有增加Fe吸收、增強Cd耐受的生物學功能，揭示了IMA在不同物種中的功能保守。IMA的高度保守性可能有助于打破基因功能物種特異性的限制（Grillet et al.， 2018）。因此，未來研究可以測試IMA是否可以提高其他作物的耐Cd能力。

IMA小肽碳末端的17個氨基酸就足以發揮其分子功能（Grillet et al.， 2018; Li et al.， 2021）。目前，人工合成小分子多肽的技術已經非常流行。因此，未來有望將IMA開發為一種商用多肽，通過施肥的方式提高植物對Cd耐脅迫的適應性。綜上所述，IMA可作為減輕植物Cd毒害的一個潛在可利用的小分子。進一步研究IMA調控Cd脅迫的機制，將為基因工程技術改造植物或培育耐Cd脅迫的農作物提供理論依據。

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（責任編輯 李 莉 王登惠）

收稿日期：? 2022-05-28

基金項目：? 云南省科技廳科技計劃項目（202003AD150007）。

第一作者： 彭鳳（1996-），碩士研究生，主要從事植物鐵營養代謝研究，（E-mail）1272277231@qq.com。

*通信作者：? 梁崗，博士，研究員，主要從事植物礦質營養研究，（E-mail）lianggang@xtbg.ac.cn。