獨占春×美花蘭雜交F1代基于SSR標記的雜種鑒定和遺傳多樣性分析

韓豫　陳 彧 　饒丹丹　陳顯臻　陳國德

關鍵詞：獨占春；美花蘭；雜交F1 代；SSR；雜種鑒定；遺傳多樣性

中圖分類號：S682.31 文獻標識碼：A

海南野生蘭花種類豐富，擁有蘭科植物96 屬302 種[1]， 其中獨占春（ Cymbidium eburneumLindl.）、美花蘭（Cymbidium insigne Rolfe.）等是海南特有種，也是國際上育種常用的起主要遺傳作用的品種。因蘭花的觀賞價值高，市場需求量大，海南野生蘭花資源被肆意采挖，野生蘭生境遭到嚴重破壞，物種多樣性降低[2]，部分蘭花種源已屬瀕危稀缺狀態[3]，美花蘭已被列為國家重點一級保護野生植物，獨占春被列為國家重點二級保護野生植物、瀕危（IUCN 標準）。目前，海南從事野生蘭花研究工作主要集中在資源調查[4-6]、品種收集、遺傳多樣性分析[7-8]、雜交育種及組培繁育[9]等方面，而針對野生蘭保護性開發應用的研究卻很少。此外，美花蘭對生長環境要求較高，不易人工栽培，對其開發應用效率較低。通過獨占春和美花蘭雜交育種，已獲得了一批適應性強又具有較高觀賞價值的雜交群體。對雜交后代進行雜種真實性鑒定，可降低育種成本，縮短育種時間，同時也為海南野生蘭種質資源保存、種質創新、野生蘭資源推廣應用提供理論和技術支持。

目前，蘭花育種研究普遍采用種間及種內雜交，導致種源繁多、遺傳背景復雜，易造成“同物異名”和“同名異物”的現象，這就需要對雜交后代進行鑒定分類。目前雜種鑒定方法主要有形態特征鑒定、細胞遺傳學、分子細胞遺傳學和分子標記等[10]。形態特征鑒定方法雖然簡單直接，但是雜交后代性狀相近時鑒定難度加大，且受環境和人為觀測的影響。細胞遺傳學鑒定方法是通過雙親和雜交后代染色體數目、形態和分裂時配對情況進行鑒定[11-12]，但此鑒定方法僅適用于染色體倍數相同的后代。分子細胞遺傳學的FISH（fluorescence in situ hybridization）技術和GISH（genomic in situ hybridization）技術在遠緣雜種鑒定方面應用廣泛，其鑒定準確、直觀，但在親本較近的親緣關系卻難以進行鑒定[12]。隨著分子生物技術的迅速發展，具有較高的準確性和有效性的分子標記技術，包括ISSR、SRAP、SSR、RAPD 等技術已廣泛應用于蘭科植物、農作物等遺傳多態性[13]、品種鑒定[14]、遺傳指紋圖譜等研究方面。李玉萍等[15]采用SRAP 分子標記技術對春蘭紫萼×大花蕙蘭日本綠的10 個F1 代進行雜種真實性鑒定，結果表明10 個F1 代均為真實雜種，且與母本相似性較高。阮稀[16]采用ISSR 分子標記法對春劍皇梅和春蘭環球荷鼎雜交的8 個F1 代進行鑒定，證實8 個F1 代為真雜種，并繼承了父本的基因條帶。林榕燕等[17]對文心蘭雜交后代進行了EST-SSR 分子標記鑒定，結果表明46 個雜交后代株系均為真雜種，同時分析發現雜交后代與母本遺傳相似系數大于父本。分子標記法的可靠性、準確性，證明了分子標記法用于海南野生蘭雜交后代的鑒定的可行性。

本研究采用SSR 分子標記鑒定獨占春和美花蘭雜交F1 代23 個單株，分析雜交后代與親本的親緣關系，研究雜交后代的遺傳多樣性，為觀賞性高的蘭花品種選育提供可能，也為種質資源可持續開發、瀕危野生資源保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

雜交試驗在海南省林業科學研究院云龍科研基地蘭花圃完成，以獨占春（Cymbidium eburneumLindl.）為母本，美花蘭（Cymbidium insigne Rolfe.）為父本進行雜交，獲得雜交F1 代23 個單株，每個單株隨機采集2～3 片無病蟲害的新鮮葉片，用無水乙醇擦拭干凈葉片表面，晾干后貯藏于有硅膠的自封袋中帶回試驗室。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA 提取 使用基因組DNA 提取試劑盒（武漢納磁生物科技有限公司）按說明書提取樣品葉片DNA，采用微量分光光度計（ThermoFisher Nano Drop ONE）和瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA 的濃度和純度，并將待檢測樣品DNA保存于–20 ℃備用。

1.2.2 SSR 引物篩選 根據陳起馨[18]在構建蘭花圖譜研究中的引物信息，選擇48 對引物組合，在1%濃度瓊脂糖凝膠上120 V 電壓電泳20 min，篩選出多態性好、重復性高的引物組合8 對，用于遺傳多樣性分析。

1.2.3 SSR-PCR 擴增反應 在Veriti 384 well 型PCR 儀上進行SSR-PCR 擴增，擴增體系總體積為10 μL，其中，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，10 pmol/μL F-primer、R-primer 各0.5 μL，模板DNA（20 ng）1 μL，ddH₂O₃μL。擴增反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 個循環；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個循環；72 ℃末端延伸20 min，4 ℃保存。最后，取2 μL PCR產物在1%濃度瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.3 數據處理

利用GeneMarker 3.0 分析軟件對每對引物擴增的多個等位基因位點進行統一標記，樣品中有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，構建SSR 標記的0、1 矩陣。采取UPGMA 聚類方法，利用NTSYS-pc 2.10 計算遺傳距離，并進行聚類分析。利用GenAIex 6.502 軟件獲得遺傳多樣性信息。

2 結果與分析

2.1 雜交后代的性質鑒定

參考陳起馨[18]蘭花圖譜中應用的引物，從48對SSR 引物中篩選出8 對引物（表1），利用這8對引物對獨占春和美花蘭雜交F1 代的23 個單株進行雜種真實性鑒定（表2）。引物Cym45、Hub131和Hub8 檢測到23 個單株均兼具雙親特異位點，引物Cym25 和Hub125 檢測到23 個單株僅具父本特異位點，引物Cym172 檢測到12 個單株兼具雙親特異位點，11 個單株僅具父本特異位點，鑒定率達100%；引物Cym9 檢測到6 個單株兼具雙親特異位點，16 個單株僅具父本特異位點，1 個單株出現新位點，鑒定率為95.65%。綜合以上7個引物的鑒定結果，受測的23 個單株均為真雜種，真雜種率為100%。

2.2 SSR 擴增遺傳多樣性分析

由表3 可知，利用篩選出的8 對引物對23個F1 代單株進行SSR 產物擴增（部分樣品在引物Cym172 的擴增結果見圖1），共檢測出14 條多態性條帶，平均每個引物3.11 條；檢測到25 個等位基因（Na），其中引物Cym172 擴增出的等位基因數最多，擴增出4 個；引物Hub8 擴增出的等位基因數最少，擴增出2 個；平均Na 為3.13 個；有效等位基因數（Ne）變化范圍為1.08～2.85，平均為1.76 個；觀測雜合度（Ho）變化范圍為0.04～0.96，平均值為0.54；期望雜合度（He）變化范圍為0.08～0.65，平均值為0.36；Shannon 信息指數（I）變化差異較大，變化范圍為0.20～1.18，其中最大的引物為Cym172 ， 最小的引物為Hub125，平均值為0.62；遺傳多樣性（Hs）平均值為0.68，多態性信息含量（PIC）變化范圍為0.08～0.59，平均值為0.31，其中只有引物Cym172呈高度多態性（PIC>0.5），引物Cym45、Hub131、Hub8 和Cym9 呈中高度多態性（0.25

2.3 親本與其F1 代聚類分析

對親本和雜交F₁代計算的遺傳距離分析可知，遺傳距離最小的是X₁₈等14 個F₁ 單株，僅為0.0769，說明在雜交F₁ 代中樣品X₁₈等14 個單株遺傳差異較??；遺傳距離最大的是親本（分別標記為D 和M），為0.9583，說明親本的遺傳表現較大。當遺傳距離為0.1177 時，將親本和23 個雜交F₁代單株分為3 個類群（圖2）。第1、2 類均是親本；第3 類是23 個雜交F₁代單株，即雜交群體。第3 類又可分為3 個分支，X₇為一個分支，X₆和X₂₁聚類在一起，其余20 個F₁代單株聚類為一簇。

3 討論

雜交育種是觀賞性植物新品種培育的重要途徑[20]，而雜交后代數量較多，對雜交后代進行雜種鑒定，從中篩選出所需要的真雜種，從而提高育種效率、縮短育種周期，對蘭花新品種培育具有重要意義。常用的RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子標記已在多種植物雜種鑒定中得到廣泛應用[21]。分子標記是在DNA 水平上直接反映的，具有較高的可靠性和穩定性，不受環境影響，且能在苗期進行早期鑒定[22-25]。SSR 標記具有高多態性、共顯性遺傳、易操作等優點[21]，可更準確地反映雜種與親本遺傳信息的差異。本研究的SSR 分析結果顯示，獨占春和美花蘭雜交后代中既有兼具雙親特異位點，也有僅具有父本和母本一方的特異位點，同時也產生了新的特異位點，說明本研究的雜交后代既有遺傳又有變異。通過SSR 分子標記法，在獨占春和美花蘭雜交后代中表現出較高的多態性，表明SSR 分子標記法可應用在海南野生蘭遺傳多樣性分析，可建立適合海南野生蘭科植物的SSR 分子標記反應體系。

蘭科植物中，基于分子標記研究最多的主要是國蘭、蝴蝶蘭等[18， 26]。而海南野生蘭因其資源的稀缺性和人工培育技術難等原因，利用分子標記方法研究海南野生蘭的報道卻很少。本研究采用SSR 分子標記對獨占春和美花蘭F1代真實性進行鑒定，這是對海南野生蘭雜交后代的首次鑒定分析，對資源稀缺的海南野生蘭種質的應用奠定基礎。本研究從48 對引物中篩選出的8 對引物能較好的區分F1 代的真實性，而引物Cym45、Hub131、Hub8、Cym25、Hub125 和引物Cym9鑒定效率分別為100%和95.65%，說明23 個雜交后代單株均為真雜種。

分子標記法也應用于蘭科植物的遺傳關系、遺傳多樣性分析等多個方面中。王宏利等[27]采用ISSR 方法對39 份建蘭品種進行遺傳多樣性分析，將其分為6 個群集。袁媛等[28]采用SRAP 方法對154 份國蘭種質資源的親緣關系進行分析，分析其遺傳相似系數在0.772～1.000 之間。王曉英等[29]對蘭屬9 個品種進行AFLP 分析，遺傳相似系數為0.416～ 0.606，發現蓮瓣蘭品種與春蘭品種親緣關系較近，而春劍品種與春蘭品種親緣關系較遠。楊光穗[8]利用SRAP 分子標記研究了8 種海南野生蘭屬植物，將其劃分為4 類。顏平[30]對168 份海南鉆喙蘭進行SRAP 分析，其遺傳相似系數為0.486～0.959。本研究僅對雜交后代的真實性進行鑒定分析，而親本間的遺傳多樣性和遺傳關系有待于進一步研究。