獸用疫苗佐劑的研究進展

錢忠輝 張華弟 葛宇燕 張子悅 朱永軍

摘 ?要：獸用疫苗免疫佐劑可以輔助獸用疫苗進入動物機體，增強疫苗的免疫效力，維持疫苗的穩定性，幫助疫苗更加有效地預防、控制動物傳染病，減少損失，保障安全的生態環境。用作獸用疫苗免疫佐劑的物質越來越多，有水性疫苗佐劑和油性疫苗佐劑等，各種佐劑的有效成分和作用方式各不相同。本文就獸用疫苗佐劑的特點做了概述，以期為疫苗研發過程中佐劑的篩選提供參考。

關鍵詞：獸用疫苗；疫苗佐劑；免疫應答

中圖分類號：S859.79+9.9 文獻標志碼：A ? ? ? 文章編號：1001-0769（2023）03-0074-05

我國動物養殖業正朝著集約化規?；较虬l展，但集約化發展的同時也導致動物傳染病更易發生，在保障生物安全的前提下，需要研制具有安全性、有效性的獸用疫苗，用于防治畜禽疫病的發生流行，提高養殖效益。在疫苗制備過程中，選擇合適的免疫佐劑非常重要。免疫佐劑簡稱佐劑，是一種自身不具備抗原特性的非特異性免疫增強劑，協同抗原預先或一起注入動物機體，可充分發揮抗原的免疫原性，進一步提高機體的免疫應答，或引起免疫反應類型發生改變的一類輔助性物質。因此，選擇正確的佐劑，能有效減少抗原的使用量，降低疫苗的生產成本，提升疫苗的有效性。

佐劑這個詞源自拉丁文。1925年，法國獸醫加斯頓·拉蒙（Gaston Ramon）經過反復試驗發現，當疫苗注射部位出現炎癥時，動物機體會產生更好的免疫反應。隨后他觀察到，在疫苗中添加木薯粉、卵磷脂、瓊脂、淀粉油、皂素等物質，可提高免疫效果，首次用“Adjuvant”來描述這種物質。開發安全有效的疫苗佐劑是一個漫長的過程，佐劑成分也經歷了從天然成分到人工合成化合物的轉變過程。隨著生物技術的發展，新型疫苗的種類越來越多，佐劑發揮的作用機理也各不相同，新近發現的新型獸用疫苗佐劑的作用機制不斷被提出。絕對安全、沒有任何副作用的疫苗佐劑不存在。優勢佐劑的篩選需要考量佐劑自身的優勢與劣勢，結合主體抗原的特點，盡可能地在免疫刺激作用最大化和毒副作用最低化之間取得一個平衡。疫苗佐劑之間沒有明顯的分類界限，無法進行系統而明確的劃分，根據疫苗佐劑的成分性狀不同，佐劑可分為油性佐劑和水性佐劑。

1 ?水性佐劑

1.1 礦物質佐劑

礦物質佐劑屬于疫苗的傳統佐劑之一，其中常見的鋁鹽佐劑是一種乳白色的凍膠狀半固體，主要有氫氧化鋁[Al（OH）3]、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬及鉀明礬等，以Al（OH）3佐劑最為常用，是目前唯一被國際開發協會（International Development Association，IDA）批準的既可應用于人用疫苗又可應用于獸用疫苗的佐劑。氫氧化鋁成本較為低廉，使用操作方便，通針性強，被廣泛應用于獸用疫苗，特別是以菌苗為主的以抗體為保護性免疫的獸用疫苗。Glenny等在1926年首次發現，在獸用白喉外毒素疫苗中以鋁鹽作為佐劑，可有效增強動物機體對抗原的特異性免疫應答。然而，鋁鹽佐劑也存在一些局限性，包括引起局部反應，導致IgE抗體反應增強；對某些抗原無效以及無法增強細胞介導的免疫應答，如小分子蛋白，分子量小、免疫原性低，與氫氧化鋁共同使用時，很難產生足夠的抗體應答。

磷酸鈣也是一種常見的礦物質佐劑，是構成機體的天然組成成分。最初由巴斯德研究所以輕基磷灰石[Ca10（PO4）6（OH）2]的形式開發，具有良好的組織相容性、生物降解性和可吸收性，無毒且廉價易得，目前已運用在對抗各種類毒素和病毒的疫苗生產中。有研究表明，與鋁佐劑相比，磷酸鈣對動物局部組織的刺激較小，lgE抗體產生減少。

1.2 蜂膠佐劑

蜂膠是一種天然的免疫增強劑，富含多種生物活性成分，主要含有各種維生素、酸類化合物、醇類化合物等，同時還含有鈣、磷、鎂、鐵、錳等微量元素。蜂膠具有抑菌、消炎、促進動物局部組織再生等作用。蜂膠主要含有蜜蜂從植物中采集的花粉、樹脂以及蜂蠟等，具有廣譜抗病毒、抗細菌和抗霉菌等多種藥理學活性作用，并具有免疫調節和提高機體免疫力的功能。給動物接種含有蜂膠佐劑的疫苗，可激活免疫活性細胞，如巨噬細胞的吞噬能力和自然殺傷細胞的殺傷作用，調整細胞免疫的發生。作為免疫輔助劑，蜂膠能顯著刺激免疫球蛋白的產生，使血清總蛋白的含量增高，更好地發揮體液免疫。使用水性蜂膠作為佐劑的疫苗，可使動物機體以更快的速度產生抗體，且保護率高，安全性好，無毒副作用。

1.3 中藥佐劑

有研究發現，迄今為止有200余種具有免疫增強作用的動植物中藥佐劑。多糖是從中草藥中提取的一種大分子物質，是植物細胞壁的重要組分，具有天然、無毒、無副作用的突出特點，對動物的體液免疫系統和細胞免疫系統可進行全方位的調節，因而可以用作低毒疫苗的免疫增強劑。在一定條件下，天然成分的多糖與抗原物質混合后會形成一種復合劑，通過刺激動物免疫器官自身細胞的生長發育和分裂增殖，激活巨噬細胞、淋巴細胞和自然殺傷細胞等，達到增強動物機體特異性免疫反應的效果，導致免疫器官重量成指數級增加，從而達到增強免疫反應的作用，穩定地發揮免疫增強劑的功能。多糖雖然安全、穩定，但因產地不同，采收時間差異較大，有效成分含量不確定；制作工藝尚不成熟，質量控制不確定，導致效果不穩定；生產過程煩瑣，價格較高。這些因素制約了中藥多糖佐劑的應用。

存在于多種植物中的皂苷類皂素及其三萜衍生物是另一種應用較為廣泛的中藥佐劑。作為天然產物，它們具有廣泛的生物活性，進入動物機體后，可激活Ｔ細胞和抗原遞呈細胞，免疫誘導各種免疫相關細胞的分化成熟，如促炎性1型輔助性T細胞（Helper T cells 1，Th1）/Th2免疫或抗炎性Th2，中性粒細胞的富集，以及巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的分化成熟。皂苷作為疫苗佐劑，通過免疫調節和免疫刺激作用，能顯著增強動物機體的免疫應答，延長疫苗的免疫保護周期，減少疫苗接種次數。皂苷還能刺激動物機體提高干擾素、腫瘤壞死因子等細胞因子的分泌水平，進一步發揮疫苗的有效性。但是，此類佐劑也存在明顯的細胞毒性、神經毒性、溶血性，會改變腸道通透性，損害肝臟和腎臟。未來可以通過結構修飾，使皂苷達到減毒增效的目的，通過開發新的劑型，解決其溶血性和細胞毒性等問題，使其在疫苗應用中更加廣泛。

1.4 細胞因子佐劑

細胞因子是由免疫原或其他誘導劑刺激動物機體的多種細胞而產生的，是一種低分子量的高活性多功能可溶性蛋白，通過與細胞表面受體相互作用，發揮調節細胞生長、修復損傷組織等多種功能，并可誘導免疫細胞發揮功能，明顯增強固有免疫和適應性免疫。細胞因子作為疫苗佐劑可分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等。

最早用作疫苗佐劑的細胞因子是白介素-1（interleukin 1，IL-1）。IL-1是淋巴細胞活化因子，由刺激物誘導巨噬細胞、單核細胞和其他多種組織細胞活化后分泌產生的一類激素樣多肽，介導固有炎性反應，在抗感染免疫、免疫腫瘤細胞生長及維持機體內環境的平衡上起著重要作用，可增強動物機體的二次抗體應答。IL-1的佐劑活性與其注射的時間和劑量密切相關，表現為時間和劑量的依賴性，通常在免疫后注射IL-1可獲得較好的活性。毒副作用最強的劑量，也是疫苗效果最好的劑量。有研究表明，由B細胞產生的IL-12是效果最好的細胞因子佐劑，是Th1分化和增殖、產生γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）以及與Thl型相關的免疫球蛋白所必不可少的。除此之外，IL-12可提高黏膜和體液免疫應答中IgG2a和IgA的水平，減少病原體的侵入。IL-12通過Th1型應答反應對細菌、腫瘤細胞和寄生蟲抗原具有有效殺傷作用。目前，運用基因工程的方法，可生產各種細胞因子，大大降低了生產成本。但高劑量細胞因子會激活過多的效應因子，造成多余的中間物質泄漏，過量使用將破壞應答平衡，并導致非特異細胞活化的細胞因子，引起自身免疫病的發生。

1.5 脂質體

脂質體主要是脂質小囊，由磷脂和固醇類組成，既是免疫佐劑，同時也具備抗原載體的功能。脂質體表面的疏水結構和內部的親水結構，使其具有廣泛的適用性，既可包被親水性抗原，又可包被親脂性抗原，通過將抗原輸送和遞呈給合適的免疫細胞發揮佐劑作用。脂質體具有多種優點：天然靶向性佐劑，易定位于單核細胞豐富的器官；類細胞膜材料，無毒性，可被生物降解，沒有殘留，安全性高；對細胞膜有較好的親和性，可將包被的抗原（或編碼抗原的DNA）輸送到細胞內，激活細胞和體液免疫應答反應；作為載體，攜帶半抗原，誘發動物機體對半抗原的免疫反應。脂質體能夠降低被包被抗原的毒性，有效提高動物機體對免疫原的耐受，良好地鞏固了抗原的穩定性；同時還能延長疫苗使用期，改善疫苗貯存條件。但是，脂質體分子含有不飽和脂肪酸鏈，在貯存時不穩定；脂質體的實驗室制備技術雖已趨于成熟，但工業生產的制備工藝仍有待改進，大規模合成難，費用也較高。此外，脂質體對動物體內某些酶敏感，進入機體后不穩定；小脂質體傾向于相互融合成大脂質體，在融合過程中會丟失抗原。脂質體對抗原的包封率不均一，很難發揮疫苗的免疫作用。

2 ?油乳佐劑

油乳佐劑是指將一定比例的油相和水相通過乳化制備而成的混合物，其作用機理大致如下。首先，油乳佐劑對抗原進行包被，在抗原進入動物體內后，保護其不被體液中的各種酶迅速分解，通過緩慢釋放抗原，延長刺激機體的時間；同時貯庫效應可使特異性抗原持續刺激動物機體，從而產生特異性免疫應答，提高抗原的免疫原性。其次，油佐劑疫苗可引起注射部位細胞浸潤，誘發動物機體局部產生炎癥反應，誘使巨噬細胞、淋巴細胞等抗原呈遞細胞聚集和增殖，從而增強細胞免疫應答和體液免疫應答。最后，在油乳佐劑的作用下，抗原可經淋巴管被運送至整個淋巴結和脾臟處，從而進一步產生新的刺激，誘導抗體生成。油乳佐劑還可通過刺激各種細胞因子如IL-2、IL-6等的分泌，在免疫反應中發揮作用。油乳佐劑最主要的成分是油料，根據油料的不同，分為礦物油佐劑和非礦物油佐劑兩種。

2.1 礦物油佐劑

礦物油佐劑所用的油料通常稱為柏油，主要成分是液體石蠟，以弗氏佐劑最為經典，分為弗氏不完全佐劑（Freund incomplete adjuvant，FIA）和弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant，FCA）兩種，雖能刺激動物機體產生很強的體液免疫和細胞免疫應答，但毒性大、穩定性差，難以長期保存，常常引起局部肉芽腫和無菌性膿腫，目前這兩種佐劑已不用于疫苗的生產。白油佐劑，是一種液體類烴類的混合物，別名液體石蠟，是目前獸用疫苗佐劑使用最為廣泛的佐劑，由石油經深度脫蠟、化學精制等工藝處理后獲得，例如Specol劑、Montanide ISA50、Montanide ISA206、Montanide ISA15VG、IMS1315VG，由礦物油和乳化劑組成。與抗原乳化后，疫苗呈乳狀液，注入動物機體，可持續緩慢釋放，延緩抗原在體內的存留時間，增強巨噬細胞的殺菌和吞噬能力。

2.2 非礦物油佐劑

非礦物油佐劑的油料成分主要指角鯊烯、角鯊烷以及植物油等。與礦物油的不可代謝相反，非礦物油佐劑在動物體內可被代謝，副作用小。植物油佐劑主要有花生油，如佐劑65是在花生油和表面活性劑Arlacel A中加入硬脂酸鋁制成的油包水型佐劑；角鯊烯和角鯊烷主要來自深海鯊魚魚肝，主要有MF-59、SAF等。

SAF系列佐劑由蘇氨?；邗６模╩uramyl dipeptide，MDP）、Tween-80以及非離子表面活性劑等組成，因此具有表面活性劑和雙親性的作用，能夠有效地靶向呈遞抗原到淋巴細胞，進而誘導動物機體產生各類細胞因子，提高體液免疫和細胞免疫應答，并且對動物和人都沒有明顯的副作用。最初，角鯊烯是分離于鯊魚的肝臟，從植物中獲取角鯊烯雖是一種可持續的替代方法，但產量低。隨著合成生物學的進步，為藥用級角鯊烯提供了創新生物合成方法，使角鯊烯生產更靈活、更便宜。

根據油乳劑疫苗的分散狀態，可以將其分為油包水型（W/O）、水包油型（O/W）、水包油包水型（W/O/W）三種類型。W/O型油乳劑疫苗的乳狀液黏度較高，可注射性差，但能在注射部位長時間貯存，緩釋作用強，佐劑活性高，能長時間地為抗原提供免疫增強作用；O/W型油乳劑疫苗的乳狀液黏度低，通針性強，安全性較高，接種后疫苗擴散快，抗體水平上升迅速，但佐劑活性低，不能產生長效機制；雙相型（W/O/W）乳劑疫苗的黏度、通針性、在體內作用時間和活性的發揮均介于O/W型和W/O型之間。注射后疫苗吸收良好，接種部位的炎癥反應小，同時既可激發體液免疫，也可誘導細胞免疫。

3 ?小結

由于各種復雜的病原微生物常常呈現混合感染，慢性病導致的動物機體出現免疫功能低下或免疫抑制，有效疫苗的研發面臨著越來越嚴峻的挑戰。根據佐劑的作用機制，在佐劑的優點和其產生的不利反應之間選取一個平衡點。正確地選擇和應用佐劑可以充分發揮抗原的自身優勢，有效地激發動物機體免疫系統，增強免疫應答，特別是對免疫力低下的動物意義重大。理想的獸用疫苗佐劑應具備的特征：安全性好，要確保免疫動物后產生的毒副作用??；良好的耐受性，可在動物機體內長時間存在，持久穩定地發揮佐劑作用；與抗原具有相容性，吸附抗原后可增加抗原的表面積，增強抗原的免疫原性，提高抗體產量；易于規?；a，生產成本低；能有效地激發細胞和體液免疫應答；與抗原混合制成的疫苗成品在安全有效的前提下，應具備黏度較低、通針性強、顆粒粒徑小、顆粒均一、穩定性良好等特點，可提高動物機體中的抗體水平，且無明顯不良反應等。隨著研究的深入，佐劑的應用范圍也逐漸擴大，不再局限于增強疫苗的免疫應答，還包括增強動物機體對細菌、病毒、真菌、寄生蟲的抵抗力。相信對佐劑的有效應用會在人類和動物的疾病預防等領域發揮更大的作用。