枸杞葉HPLC特征圖譜的研究

鄭倩倩 周雪菲 路麗娟 王小芳 趙艷普

【摘 要】 ??目的： 采用HPLC法研究枸杞葉的特征圖譜。 方法： 采用HPLC法，以槲皮素為參照物，色譜柱為Agilent 5TC-C18（2）5 μm，250 mm×4.6 mm，以甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為360 nm，柱溫為 35 ℃。流速為1.0 mL/min。利用《中藥指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）》對數據進行整理分析。 結果： 建立了枸杞葉的HPLC特征圖譜，共確定7個特征峰，以槲皮素峰為參照（S），10批枸杞葉樣品的相似度均＞0.900。 結論： 該方法操作簡便，專屬性好，可為枸杞葉的質量標準研究和質量評價提供參考依據。

【關鍵詞】 ?枸杞葉；HPLC；特征圖譜；槲皮素

【中圖分類號】R284.1 ??【文獻標志碼】A ???【文章編號】1007-8517（2023）13-0034-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202313008

Study on HPLC Characteristic Spectra of Lycium Barbarum Leaves

ZHENG Qianqian ZHOU Xuefei LU Lijuan WANG Xiaofang ZHAO Yanpu

Shijiazhuang Food and Drug Inspection Center，Shijiazhuang 050000，China

Abstract： ?Objective ?To study the characteristic spectra of Lycium barbarum leaves by HPLC. ?Methods ?the HPLC method was used， with quercetin as the reference substance， and the chromatographic column was Agilent 5TC-C18 （2） 5 μm， 250 mm×4.6 mm， methanol-0.4%phosphoric acid solution as mobile phase， gradient elution， detection wavelength of 360 nm， column temperature of 35 ℃. The flow rate was 1.0 mL/min. The data were collated and analyzed using the similarity evaluation system of traditional Chinese medicine fingerprints （2012 Edition）. Results ?The HPLC characteristic chromatogram of Lycium barbarum leaves was established， and seven characteristic peaks were determined. With quercetin peak as reference （S）， the similarity of 10 batches of Lycium barbarum leaves samples was>0.900. ?Conclusion ?the method is simple and specific， and can provide reference for quality standard research and quality evaluation of Lycium barbarum leaves.

Key words： Lycium Barbarum Leaves； HPLC； Characteristic Map； Quercetin

枸杞葉又名天精草、地仙苗、甜菜等，為茄科植物枸杞（ Lycium chinese ?Mill）或寧夏枸杞（ Lycium barbarum ?L.）的干燥嫩莖葉，《本草綱目》中謂其味苦甘而氣涼，具除煩益志，補五勞七傷，壯心氣之功效，亦可“去皮骨節間風，消熱毒，散瘡腫，除風明目”［1］。常炒食或用作茶葉。

枸杞葉主要含有多酚類、多糖類、黃酮類、維生素、甜菜堿，還含有多種微量元素， 現代研究［2-8］表明，枸杞葉有抗炎抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化，抗疲勞等藥理作用，還可以用于降血脂，預防動脈粥樣硬化。

中藥材化學成分復雜，而中藥特征圖譜具有整體性和模糊性的特點，作為一種鑒別的手段，可用于鑒別藥材真偽、評價藥材道地性以及制劑的一致性與穩定性，是一種綜合的可量化的鑒別手段 ［9-12］。

枸杞葉作為一種傳統的中藥材，日漸受到關注，孟協中等［13］進行了枸杞葉的化學成分研究，劉賽等［14］對不同產地枸杞葉片中多糖、總黃酮和總酚含量進行了差異比較分析，有學者［15-16］進行了枸杞葉的藥理活性研究，亦有學者［17-19］對枸杞葉中的黃酮提取物進行了純化、提取工藝優化及組成結構分析。枸杞葉專屬性的鑒別項目研究未見報道，枸杞葉 特征圖譜的相關質量標準亦未建立，為鑒別市面上的枸杞葉產品真偽，很有必要建立其特征圖譜。本研究采用HPLC法，研究并建立枸杞葉的特征圖譜，以期更全面控制枸杞葉的質量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）； Satouris電子天平（德國賽多利斯公司）；Milli-Q超純水機（美國默克公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；色譜柱Agilent 5TC-C18（2）5 μm，250 mm×4.6 mm。

1.2 試藥 對照品：槲皮素（批號100081-201509），購于中國食品藥品檢定研究院。試劑：甲醇（色譜純，Merck）；水（去離子水，電阻率≥18.2 MΩ·cm）；乙醇 （分析純，天津科密歐）；36%鹽酸（分析純，天津科密歐）；磷酸（分析純，天津科密歐）。藥材：共收集到枸杞葉藥材10批，分別來自河北（6批）、寧夏（4批）等地，經石家莊市食品藥品檢驗中心業務辦公室畢飛霞副主任藥師鑒定為茄科植物枸杞（ Lycium chinese ?Mill）或寧夏枸杞（ Lycium barbarum ?L.）的嫩莖葉。藥材信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 流動相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序為0～10 min，10%A；11～30 min，10%→35%A；31～50 min，35%→80%A；50～55 min，80%A。流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為360 nm；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 將枸杞葉樣品粉碎，過三號篩，取粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷至室溫，再用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL至蒸發皿中，水浴蒸干，加入甲醇-25%鹽酸（4∶ 1）的混合溶液25 mL，加熱回流40 min，取出，放冷至室溫，分次轉移至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇制備成50 μg/mL的對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密稱取枸杞葉樣品粉末（GQY-6）1.0 g共1份，按照“2.2.1”項供試品的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件連續進樣6次，各次進樣量均為10 μL，記錄6次進樣的HPLC圖，以5號峰（槲皮素 峰）為參照峰，分別計算7個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果為相對保留時間RSD均＜0.4%，相對峰面積的RSD均＜0.5%，表明此方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 精密稱取枸杞葉樣品粉末（GQY-6）1.0 g共6份，按照“2.2.1”項供試品的制備方法，平行操作，制備6份供試品溶液，按“2.1”色譜條件分別進樣，各次進樣量均為 10 μL，記錄各個HPLC圖，以5號峰（槲皮素峰）為參照峰，分別計算7個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果為相對保留時間的RSD均＜0.9%，相對峰面積的RSD均＜0.6%，表明此方法的重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密稱取枸杞葉樣品粉末（GQY-6）1.0 g共1份，按照“2.2.1”項供試品的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，各次進樣量均為10 μL，記錄各個HPLC圖，以5號峰（槲皮素峰）為參照峰，分別計算7個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果為相對保留時間的RSD均＜1.1%，相對峰面積的RSD均＜1.3%，表明此樣品的供試品溶液放置 24 h 穩定性良好。

2.4 特征圖譜的建立及評價 分別精密稱取10批枸杞葉的樣品粉末各1.0 g，按照“2.2.1”項供試品的制備方法制備供試品溶液10份，按“2.1”色譜條件依次進樣，進樣 量均為10 μL，記錄色譜圖，將10個樣品的HPLC圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，將S1圖譜設置為參照圖譜，時間窗口選擇為0.1 min，用中位數法生成對照圖譜（R），通過多點校正，進行色譜峰匹配，共確定了7個特征峰，通過對照品比對，DAD全波長掃描圖的對比，指認了其中1個成分，為槲皮素峰（5號峰）。槲皮素作為枸杞葉中黃酮類主要成分，含量較大，出峰時間居中，分離度好，且較穩定，故將槲皮素峰（5號峰）設為設為參照峰（S峰），計算10批枸杞葉樣品圖譜的相似度，特征圖譜疊加圖譜及相似度計算結果如圖1所示、見表2。

10批枸杞葉樣品的相似度均＞0.900，說明各批樣品成分相似度高，所建立的特征圖譜有較高的代表性，可行性好。10樣品的特征圖譜均呈現7個特征色譜峰，以槲皮素峰為參照峰（S），7個特征峰的平均相對保留時間分別為：0.143（峰1）、0.220（峰2）、0.443（峰3）、0.765（峰4）、1.000（S峰）、1.652（峰6）、1.886（峰7）。10批枸杞葉樣品的相對保留時間＜2.0%，說明所建立的特征圖譜重復性好，穩定可行。7個特征峰的平均相對峰面積分別為：0.233（峰1）、0.136（峰2）、0.091（峰3）、0.079（峰4）、1.000（S峰）、0.058（峰6）、0.082（峰7）。10批樣品的相對峰面積的RSD值較大，尤其是峰6，RSD值達到77.97%，說明河北產和寧夏產的枸杞葉樣品存在一定差異，而同產地的不同批次枸杞葉樣品差異不大，可能和地域、氣候，栽培方式不同有關。7個特征峰的相對保留時間及相對峰面積見表3、表4。

3 討論

3.1 提取溶劑、提取方式及色譜條件的優化 提取溶劑分別考察了70%甲醇，70%乙醇，85%乙醇等，結果顯示發現70%乙醇為溶劑時，出峰最多，且各峰的峰面積最大，故選擇了70%乙醇為提取溶劑。提取方式考察了加熱回流和超聲兩種提取方式，結果顯示加熱回流方式提取較完全，各峰峰面積較大，提取效果較好，料液比考察了1∶ 50，1∶ 75，1∶ 100，結果顯示料液比為1∶ 50時，提取最完全，各峰響應值最高。通過考察不同加熱時間，最終確定了2.2.1項下的制備方法。

流動相考察了甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液等不同溶劑系統，通過DAD檢測器在200～400 nm波長范圍進行掃描。又考察了不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）和流速，通過對比出峰數量、各峰響應值大小，最終確定了2.1項下的色譜條件。

3.2 結果分析 本研究建立了枸杞葉的HPLC特征圖譜，并通過對照品比對確認了其中槲皮素成分。以槲皮素峰為參照峰（S），取特征圖譜相對保留時間的±5%的范圍，建議7個特征峰的相對保留時間分別規定為：0.14～0.15（峰1）、0.21～0.23（峰2）、0.42～0.47（峰3）、0.73～0.80（峰4）、1.000（S峰）、1.57～1.73（峰5）、1.79～1.98（峰7）。其余峰還需進一步確證。7個特征峰的相對保留時間RSD均≤2.0%，說明所建立的特征圖譜具有較好的重復性和穩定性。產地分別為河北、寧夏的10批枸杞葉樣品的相似度均＞0.900，說明各產地枸杞葉成分相似度高，本研究所建立的特征圖譜有較好的代表性和特征性，可為枸杞葉質量控制提供參考。

參考文獻

［1］明·李時珍.本草綱目（校點本下冊）［M］.2版.北京：人民衛生出版社，2013：2113.

［2］陳雅林，譚芳，彭勇，等. ?枸杞葉的研究進展［J］.中國藥學雜志，2017，52（5）：358-361.

［3］張玉璽，馬紅軍，何薇. 寧夏枸杞菜中總黃酮和蘆丁含量的動態變化研究［J］.當代化工，2014，43（12）： 2509-2510.

［4］ 姚遙，水棟，田建英，等. 寧夏枸杞葉中的化學成分［J］.北京中醫藥大學學報，2016，39（6）：498-501.

［5］李紅英，吳東. 寧夏枸杞葉茶中微量元素含量與其他茶葉的比較［J］.微量元素與健康研究，2008，（4）： 34-35，50.

［6］何微，朱捷. 枸杞葉中總黃酮及蘆丁提取工藝的研究［J］.當代化工，2015，44（11）：2723-2725.

［7］楊玉新，方珍. 枸杞葉有效成分及其提取方法簡析［J］.黑龍江農業科學，2014，（12）：150-152.

［8］文懷秀，蔣福全，趙曉輝，等. 不同采收期寧夏枸杞葉中總黃酮含量的比較［J］.植物資源與環境學報，2006（3）：75-76.

［9］ 段吉平，姚寶林，楊建玲，等. 當藥HPLC特征圖譜的探索［J］.中國實驗方劑學雜志，2017，23（21）：75-78.

［10］ 江俊.中藥質量評價新方法—中藥指紋圖譜［J］. 湖北中醫學院學報，2001（4）： 11.

［11］胡漢昆，劉薇芝，劉萍，等. 中藥特征圖譜技術在中藥鑒定中的應用［J］.中國醫院藥學志，2009，29（11）：936-938.

［12］ 秦紅霖，李永申.特征圖譜技術在中藥質量分析中的應用［J］.中國實用醫藥，2014， 9（7）：253-255.

［13］孟協中，胡向群，張桂蘭，等. 枸杞子和枸杞葉化學成分的研究-第2報枸杞子和枸杞葉中的氨基酸［J］. 中藥通報，1987（5）：42-44.

［14］劉賽，楊孟可，李葉林，等. 不同產地枸杞葉片多糖、總黃酮和總酚含量差異比較分析［J］.中國中藥雜志，2019，44（9）：1774-1780.

［15］孫偉，苗珍花，王亞玲，等. 寧夏枸杞葉對自然衰老小鼠的抗疲勞作用［J］.寧夏醫科大學學報，2011，33（3）：204-205，236.

［16］馬琪，張建龍，冉新健，等. 復方枸杞葉茶抗疲勞、耐缺氧、耐低溫和對血脂的影響［J］. 新疆醫科大學學報，2000（2）：153-154.

［17］陳瑾，陳晶華，劉利平，等. 枸杞葉黃酮提取物的純化及組成結構分析［J］.食品工業科技， 2019， 40（18）：28-34，40.

［18］鄒耀洪. 枸杞葉的黃酮類化學成分［J］.分析測試學報，2002（1）：76-78.

［19］繆文玉，李冠文，殷孝瑩，等. 新鮮枸杞葉中黃酮提取工藝的優化及抗氧化性分析［J］.山西農業科學，2022，50（5）：762-770.

（收稿日期：2023-10-20 編輯：陶希睿）