基于GEO數據庫篩選舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥的關鍵基因及生物信息學分析

蘇萌,張釗銀,姚金光

(右江民族醫學院口腔醫學院,廣西 百色 533000)

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是一種舌體鱗狀上皮組織來源的口腔惡性腫瘤,也是常見的頭頸部惡性腫瘤[1]。舌頭的前2/3被認為是舌鱗狀細胞癌發生的主要區域,而舌頭的后1/3為舌根癌的范疇[2]。流行病學資料顯示,舌鱗狀細胞癌約占口腔癌的30%～50%和全身惡性腫瘤的0.8%～1.5%[3-4]。舌體組織的淋巴管、血管豐富且機械運動頻繁,出現區域淋巴結轉移的可能性很高,即使在早期階段也是如此,導致臨床上治療困難。

順鉑的聯合化療是包括舌鱗狀細胞癌在內的多種癌癥的標準治療方法,在舌鱗狀細胞癌的治療中扮演極其重要的角色。然而,順鉑通常受到機體天然和獲得性耐藥的限制,許多舌鱗狀細胞癌患者對順鉑固有抗性或經多次用藥后對順鉑產生抗性,甚至對未使用過的化療藥物也產生抗性,從而嚴重限制了化療效果,術后5年生存率僅為50%[5-7]。目前,臨床上仍缺乏針對舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥的關鍵靶點,導致無法從根本上逆轉其耐藥性。

隨著芯片技術的發展,學者們從專注于少數經典耐藥基因的研究轉向全基因組測序來挖掘特異的耐藥基因,以更準確地評估機體基因調控耐藥變化的過程。本研究基于GEO數據庫中舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥細胞的芯片數據,利用生物信息學分析方法篩選舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥過程中的關鍵基因,探討其與順鉑耐藥性的聯系,為揭示順鉑耐藥的分子機制及逆轉順鉑耐藥性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1數據來源 登錄Gene Expression Omnibus數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,GEO),以“Tongue Squamous Cell Carcinoma”和“Ciplatin Resistance”作為關鍵詞,下載數據集GSE111585和GSE115119的表達數據及GPL平臺文件。GSE111585數據集基于GPL14715平臺測序,共包括3例正常SCC9細胞樣本和3例SCC9順鉑耐藥細胞樣本。GSE115119數據集基于GPL16955平臺測序,共包括2例正常CAL27細胞樣本和2例CAL27順鉑耐藥細胞樣本。SCC9與CAL27均為人舌鱗狀細胞癌細胞系。根據GPL平臺文件對探針ID進行注釋轉換,以獲取對應的基因名稱。從鉑耐藥基因數據庫(http://ptrc-ddr.cptac-data-view.org)中下載909個與鉑耐藥密切相關的基因(platinum resistent genes,PRGs),該數據庫包含近30年來800篇出版物關于鉑耐藥的研究,并對涉及鉑耐藥的909個基因進行高度整理和注釋[8]。

1.2差異基因的篩選 用R語言limma包分別對GSE111585和GSE115119數據集進行差異分析[9],以P<0.05且|log2FC|≥2作為標準篩選差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),并繪制火山圖。將兩組數據集的DEGs與PRGs取交集,以降低篩選的假陽性,并繪制韋恩圖。

1.3GO和KEGG富集分析 運用R語言對DEGs進行功能注釋,以明確其參與的生物學功能及信號通路,并進行可視化,設置Count>5,P<0.05及FDR<0.1。其中基因本體論(gene ontology,GO)主要包括生物學過程(biological processes,BP)、細胞組分(cellular components,CC)及分子功能(molecular functions,MF)。京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)主要包括信號通路。

1.4PPI網絡的構建及網絡分析 String數據庫(https://stringdb.org/)可用于預測DEGs編碼蛋白的相互作用關系[10]。將DEGs上傳至String數據庫,以互作分數Score>0.400(中等置信度)為閾值構建蛋白互作網絡(protein-protein interaction,PPI),去除游離的靶點,簡化PPI網絡。下載PPI網絡的TSV文件,將其導入Cytoscape_v3.8.0軟件進行可視化,其中節點(Node)代表節點基因,邊(Edge)代表基因之間的相互作用情況?；贑ytoHubba插件中Degree拓撲分析算法對PPI網絡進行分析,篩選出評分前3的基因作為Hub基因。

1.5Hub基因與順鉑耐藥性分析 從Cellminer數據庫(https://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do)中下載藥物敏感性數據[11],根據Hub基因表達量中位數分為高、低表達組,用wilcox.test計算兩組順鉑敏感性IC50的表達差異,繪制箱線圖,P<0.05時差異有統計學意義。

2 結果

2.1差異表達基因的鑒定 根據|log2FC|≥2,P<0.05標準篩選,GSE111585數據集共篩選出458個DEGs,其中上調基因235個,下調基因223個(見圖1A);GSE115119數據集共篩選出677個DEGs,其中上調基因377個,下調基因300個(見圖1B)。韋恩圖交叉分析篩選出32個與順鉑耐藥密切相關的DEGs(見圖1C)。

圖1 差異表達基因的火山圖和韋恩圖

2.2GO及KEGG富集分析 GO功能富集分析顯示,32個DEGs主要富集在刺激反應調節、多細胞生物過程的調節及組織發育等生物學過程(見圖2A);細胞組成變化主要涉及細胞外區域、內膜系統及胞外區部分等(見圖2B);分子功能變化主要包括信號受體結合、酶結合、DNA結合轉錄激活劑活性等(見圖2C)。KEGG通路富集分析顯示,DEGs主要富集在癌癥通路、人T細胞白血病病毒Ⅰ型感染、人乳頭瘤病毒感染及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等(見圖2D)。

圖2 差異表達基因的GO及KEGG富集分析

2.3PPI網絡的構建及Hub基因的識別 將32個顯著性DEGs上傳至STRING數據庫,去除游離節點,構建32個節點,60條邊數的PPI網絡。使用CytoHubba插件Degree算法對PPI網絡進行分析,評分排名前3的基因中纖維連接蛋白基因(fibronectin 1,FN1)、性別決定區Y框蛋白2(sexdetermining region Y-Box2,SOX2)和Ⅰ型膠原α1亞基因(collagen type Ⅰ alpha 1,COL1A1)被鑒定為舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥的關鍵基因即Hub基因,三者均為上調基因,見圖3。

2.4Hub基因與順鉑IC50的表達差異 根據P<0.05為篩選閾值,發現其中COL1A1具有較大的研究意義。研究顯示與COL1A1低表達組相比,高表達組的順鉑敏感性IC50較高,說明基因表達量越高,其對順鉑的抗藥性越強。見圖4。

3 討論

順鉑是舌鱗狀細胞癌化療的首選藥物,但耐藥性嚴重限制了其臨床應用。盡管很多學者已經致力于順鉑抗性機制的研究,但是仍然缺乏逆轉順鉑抗性和改善對基于順鉑的療法響應的有效靶標[12]。因此,確定順鉑耐藥變化過程中起主導作用的關鍵基因,運用新的分子靶向治療方法來克服順鉑耐藥性或針對性開發安全有效的藥物靶標來逆轉耐藥性對舌鱗狀細胞癌的治療至關重要。本研究通過生物信息學方法篩選GSE111585和GSE115119數據集中DEGs,但芯片數據中細胞樣本量較少,為此引入了鉑耐藥基因數據庫中的PRGs,以排除篩選基因時出現的假陽性。經過多數據集及多基因的整合,共篩選出32個顯著表達的DEGs,其在正常人舌鱗癌細胞系和耐藥細胞系中的表達存在顯著差異,說明該基因與鉑耐藥性存密切的聯系。GO功能富集分析顯示,DEGs主要參與刺激反應調節及多細胞生物過程的調節等生物學過程,細胞組成變化主要在細胞外區域、內膜系統及胞外區等區域,與信號受體結合、酶結合及DNA結合轉錄激活劑活性等分子功能相關。KEGG通路富集分析顯示,DEGs主要富集在癌癥通路、人T細胞白血病病毒Ⅰ型感染等信號通路。GO和KEGG富集分析提供了DEGs在順鉑耐藥性中可能參與的功能及發揮作用的相關途經,將眾多基因的表型與基因功能構建起聯系,以明確研究的范圍,為順鉑耐藥性研究提供新的思路。

根據CytoHubba中Degree拓撲分析算法篩選出前3個候選Hub基因,即FN1、SOX2和COL1A1,這些在舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥細胞樣本中均呈現出顯著高表達,具有成為順鉑耐藥關鍵靶點的潛力,存在極大的研究價值。FN1是一種纖維連接蛋白,為FN蛋白家族的成員,主要位于胞外區的細胞外基質中。研究表明FN1與癌癥的順鉑耐藥過程密切相關,且FN1在順鉑耐藥的卵巢癌中表達顯著上調,但是其分子調控機制尚不明確[13]。目前,有學者在順鉑耐藥的神經母細胞瘤中觀察到上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transitions,EMT)的表型,而KURIMOTO R、CHENG M M等[14-15]也發現EMT標志物在順鉑化療耐藥的NSCLC患者組織中表達顯著上調,說明上皮間質轉化途經可以介導順鉑耐藥。FN1是上皮間質轉化的公認標志物,多項功能研究已將其與EMT的生物學行為聯系起來[16]。因此,推測FN1的高表達可能改變舌鱗狀細胞癌的EMT表型,介導惡性上皮細胞向間質細胞轉化,從而促進耐藥性改變。SOX2位于3號染色體的長臂中,位于3q26.3-27區域,屬于SOX基因家族,主要參與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移、復發等過程[17-18]。作為腫瘤干細胞重要的標志物,SOX2在介導耐藥方面可能與腫瘤干細胞相關的耐藥特征存在密切聯系,被認為有助于耐藥性的早期階段。研究表明增強SOX2啟動子的表達作用,可以促進SOX2表達并導致腫瘤生長和耐藥性,提示其在改變耐藥性方面存在重要作用[19]。COL1A1是膠原蛋白家族的成員,主要參與細胞增殖、遷移及血管生成,而且COL1A1被認為與細胞外基質 (extracellular matrix,ECM) 的變化密切相關,特別是能增強EMC的重塑作用[20-21]。EMC是分布在細胞表面多糖和蛋白,可以保護生物細胞免受外部環境的影響,其屏障作用有助于增加腫瘤細胞對抗微生物劑的耐藥性[22]。推測COL1A1基因表達的改變可以導致異常的基質活化,引起強烈的細胞外基質重塑,出現過度的ECM積累,從而增加順鉑抗性。

本課題根據Hub基因表達量的中位數分為高、低表達組,用wilcox.test計算兩組順鉑敏感性IC50的表達差異,期望從3個Hub基因中篩選出更具有預測價值的目標基因,發現COL1A1基因表達量與順鉑敏感性IC50存在顯著正相關,而且其表達量越高,順鉑的耐藥性也就越強。有報道顯示,馮曉杰等[22]通過干擾COL1A1基因表達成功逆轉A2780-cis/lGROV1-cis細胞的耐藥性,充分證明通過抑制COL1A1表達能增強腫瘤化療的敏感性,可作為個性化逆轉耐藥的重要靶標,從而提高化療效果。本研究與上述文獻報道基本一致,表明該研究具有較大的前瞻性及可信度。本研究利用基因表達譜技術初步證明FN1、SOX2和COL1A1具有作為舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥潛在生物標志物的潛力,其中COL1A1最具研究價值,針對其開發新治療藥物或挖掘現有藥物的有效成分,有望成為逆轉順鉑耐藥的關鍵。

綜上所述,本研究通過生物信息學方法篩選出32個DEGs,其中FN1、SOX2和COL1A1作為Hub基因,且順鉑耐藥密切相關。此外,本課題組首次預測出Hub基因與順鉑敏感性IC50的聯系,其中COL1A1基因具有極大的研究價值,可以作為逆轉舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥的潛在作用靶點。本研究為舌鱗狀細胞癌順鉑耐藥分子機制及開發敏感藥物靶標提供強有力的理論依據,但仍需更多實驗證據進一步證實。