血漿Septin9基因甲基化檢測對結直腸癌診斷的價值研究

陸飛燕,陸相磊,岑小寧,黃春程,黃林達,龍喜帶,3,4,朱曉瑩,3,4

(1.右江民族醫學院附屬醫院臨床病理診斷與研究中心,廣西 百色 533000;2.右江民族醫學院附屬醫院胃腸外科,廣西 百色 533000;3.廣西肝膽疾病分子病理學重點實驗室,廣西 百色 533000;4.廣西高校腫瘤分子病理學重點實驗室,廣西 百色 533000)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是我國常見的惡性腫瘤之一,據統計報告顯示[1]:CRC發病率位居所有惡性腫瘤中的第2位,死亡率位居第4位,對人類健康具有很大威脅。醫療技術的發展為患者帶來福音,早期CRC患者生存質量和生存期得到明顯改善。但由于CRC早期癥狀不典型,絕大多數患者就診時疾病已經進展至中晚期而錯過最佳治療時期。據報道[2-3],早期CRC患者5年生存率可達90%,而進展期僅為10%。因此,早期篩查診斷是CRC患者早期治療、獲得較好治療效果的關鍵。

以往的CRC篩查主要有結直腸鏡檢查、大便隱血試驗(FOBT)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)檢測等,腸鏡是一種侵入性檢查,結直腸鏡篩查依從率較低[4],而后幾種檢測對CRC診斷的敏感度和特異性相對較低,不能很好地滿足臨床需求。研究發現Septin9-v2 啟動子區的CpG 島高度甲基化是CRC發生的關鍵,即Septin9基因甲基化(methylated Septin 9,mSEPT9)的異常表達導致基因轉錄活性降低,進而影響基因正常的生理功能,最終誘導癌癥的發生。mSEPT9隨著癌細胞壞死破裂進入到血液循環中可被檢測到,為CRC檢測提供了基礎。我國一項CRC篩查分析報道,拒絕接受結腸鏡檢查對象中有82.6%愿意接受血漿mSEPT9檢查[5]。相對于以往的CRC篩查方法,血漿Septin9基因甲基化檢測具有簡單易行、無創的優勢,本研究通過檢測血漿mSEPT9結果對CRC的診斷價值,輔助臨床開展CRC相關診療工作。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2020年5月至2022年4月在右江民族醫學院附屬醫院收治并進行病理學診斷為非CRC患者42例和CRC患者129例,分別作為非CRC組和CRC組。納入標準:參照《中國臨床腫瘤學會(ESCO)CRC診療指南 (2019版)》綜合診斷為CRC的患者。排除標準:既往其他腫瘤病史,已接受放化療、手術治療或全身治療,合并嚴重心血管疾病者,妊娠期、哺乳期婦女,臨床資料不完整等。本次研究入選患者171例,男性105例,女性66例,年齡28～82歲,平均年齡(57.46±12.50)歲。171例患者均接受血漿mSEPT9檢測、FOBT、CEA和CA199檢測。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑 血漿Septin9基因甲基化檢測試劑盒(北京博爾誠醫學檢驗所有限公司),大便隱血(FOBT)檢測試劑盒(膠體金法)(四川沃文特生物技術有限公司)、癌胚抗原(CEA)檢測試劑盒[羅氏診斷產品(上海)有限公司]、CA199檢測試劑盒[羅氏診斷產品(上海)有限公司]。

1.2.2儀器 實時熒光定量PCR儀(7500fast),輪狀旋轉混勻器,加熱型恒溫金屬浴,試管架和磁力架,離心機,自動糞便處理分析儀,全自動電化學發光分析儀[羅氏診斷產品(上海)有限公司]等。

1.3方法

1.3.1血漿Septin9基因甲基化檢測(PCR熒光探針法) 檢測流程按照試劑盒說明書進行。①樣本采集和保存:使用EDTA-K2抗凝真空采血管采靜脈血10 mL,24 h內室溫(1350±150) r/min離心12 min,分離血漿至少3.5 mL,血漿于-20 ℃保存,1周內完成檢測;②DNA樣本提取和轉化:按試劑盒說明書提取血漿DNA并進行亞硫酸鹽轉化;③配制PCR反應體系:按試劑說明書配制PCR反應體系并加入亞硫酸鹽轉化后的DNA樣本;④PCR反應:利用實時熒光定量PCR儀(7500fast)按試劑盒說明書設置PCR反應程序,進行PCR反應;⑤結果判讀:按照試劑盒說明書對結果進行判讀。

1.3.2大便隱血試驗(FOBT) 糞便標本24 h內檢測。使用自動糞便處理分析儀上機檢測,結果由本院檢驗科提供。

1.3.3CEA和CA199檢測 及時離心分離血清,24 h內檢測。采用化學發光法檢測,結果由本院檢驗科提供。

1.4統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析,計量資料比較采用t檢驗,計數資料比較采用χ2檢驗,診斷效能采用ROC曲線評價。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1兩組患者年齡和性別分布情況 在171例入選患者中,CRC組129例,其中男性85例,女性44例,男性多于女性(約1.93∶1),年齡28～82歲,平均年齡(56.83±12.94)歲;非CRC組42例,其中男性20例,女性22例,年齡32～78歲,平均年齡(59.38±10.95)歲。

2.2CRC組和非CRC組血漿mSEPT9檢測結果 CRC組患者血漿mSEPT9陽性率為58.14%(75/129)。非CRC組mSEPT9陽性率為19.05%(8/42),其中結直腸腺瘤/息肉組mSEPT9陽性率為29.17%(7/24),結直腸無異常組mSEPT9陽性率為5.56%(1/18)。CRC組和非CRC組患者mSEPT9檢測結果相比,差異具有統計學意義(P<0.001),結直腸腺瘤/息肉組與結直腸無異常組mSEPT9檢測結果相比,差異無統計學意義(P=0.126)。mSEPT9檢測結果在年齡、性別上差異無統計學意義,見表1。

2.3mSEPT9、FOBT、CEA、CA199及mSEPT9聯合檢測在CRC診斷中的應用價值比較 單項檢測中,mSEPT9檢測在CRC診斷中的敏感度和陰性預測值高于CEA和CA199;特異度和陽性預測值高于FOBT。血漿mSEPT9檢測聯合FOBT檢測敏感度高達96.12%,明顯高于兩者單項檢測,但特異度較兩者單項檢測有所降低。mSEPT9檢測聯合CEA敏感度明顯高于兩者單項檢測,但特異度與單項mSEPT9檢測特異度相當,較CEA檢測特異度(100%)有所降低。mSEPT9檢測聯合CA199敏感為63.57%,高于兩者單項檢測,但特異度低于單項檢測。mSEPT9、FOBT、CEA和CA199四項聯合檢測敏感度達96.90%。從ROC曲線來看,mSEPT9檢測、FOBT、CEA檢測AUC值分別為0.695、0.688、0.698,顯示對CRC的診斷準確性較好(P<0.001),而CA199的AUC為0.573(P=0.155)?；趍SEPT9的聯合檢測中,mSEPT9聯合CEA使得AUC(0.746)高于兩者單項檢測(0.695,0.698),其他聯合檢測并不比單項mSEPT9有更好地提升。見表2、圖1。

圖1 不同檢測方法診斷CRC的ROC曲線

表2 不同檢測方法在CRC診斷中的應用價值

3 討論

CRC是常見的消化系統惡性腫瘤之一,全球范圍內,CRC發病率呈現不同程度的增加趨勢,在腫瘤致死原因中位居第二[6]。隨著飲食方式西方化、運動量減少等原因,我國CRC新發病例依然上升,2018年我國CRC的新發病例超過37.6萬例,死亡數達19.1萬例[7],而早期對CRC患者進行篩查并及時治療對于提高患者5年生存率具有重要意義。CRC的發生發展與其他惡性腫瘤一樣是一個復雜的過程,其具體機制目前尚未完全清楚。Septin基因組廣泛存在于真核生物中,參與細胞質分裂、細胞極化、囊泡運輸和細胞膜重構等多個生物過程[8]。Septin9蛋白能調控細胞生長,防止細胞分裂過快或不受控制的增殖,是抑癌基因家族成員之一。而Septin9-v2 啟動子區的CpG 島高度甲基化而引起自身表達異常,可誘導癌癥的發生。本研究結果顯示,CRC組血漿mSEPT9檢測陽性率高于非CRC組,兩組患者血漿mSEPT9檢測結果差異具有統計學意義,表明Septin9基因甲基化與CRC的發生密切相關,血漿mSEPT9檢測對CRC的診斷具有重要參考意義。同時發現,血漿mSEPT9檢測結果與患者年齡、性別及腫瘤的位置無關,與SONG L L等[9]和陳培等[10]研究結果相一致,提示該檢測方法可能不與這些臨床特征相關,而適用于更多的患者。

傳統的CRC檢測方法包括FOBT、CEA、CA199等,本研究將血漿mSEPT9檢測與幾種傳統檢測方式結果進行對比,發現血漿mSEPT9檢測敏感性和陰性預測值均高于CEA和CA199,與堵一喬等[11]和宮曉紅等[12]結果相一致;特異度和陽性預測值高于FOBT。雖然FOBT敏感性最高,但由于引起大便隱血陽性的因素很多,導致特異度不夠,而CEA和CA199雖然特異度高,但敏感度較低。綜合來看,單項檢測中血漿mSEPT9檢測敏感性和特異度均較高,且優于單項FOBT、CEA和CA199檢測,對CRC具有較好的檢測效能。另外,研究結果顯示血漿mSEPT9分別與FOBT、CEA和CA199聯合檢測時敏感度均明顯高于兩者單項檢測,血漿mSEPT9、FOBT、CEA和CA199四項聯合檢測敏感度達96.90%,表明基于血漿mSEPT9檢測的聯合檢測對CRC篩查診斷具有更高的參考價值。本研究聯合檢測結果特異度與李娜等[13]結果有一定差異,可能是因為樣本數量、樣本自身、樣本采集和運送條件等原因有關。由于確定 mSEPT9陽性的方法有1/1、1/2、1/3和2/3等不同算法,如1/3算法表示:3次PCR重復實驗應出現至少1次陽性則判斷為陽性。根據臨床實際,臨床樣本很難多次重復檢測,不同的計算方法可能會得出不同的結果,實驗中使用哪種算法目前沒有達成標準,需要進一步研究探索。除了血清腫瘤標志物檢測,目前已有報道mSEPT9、SDC2、TFPI2基因甲基化聯合篩查CRC的研究[14-15],顯示多基因聯合檢測可提高檢測敏感度,同時為癌前病變檢測提供一定應用依據。但聯合哪幾種分子檢測效能最佳,是否可作為診斷金標準等問題尚需要更多研究和數據支持。綜上所述,基于血漿mSEPT9的聯合檢測能夠提高檢測敏感度,可能更好地滿足臨床篩查CRC的需要,同時提示臨床可根據患者情況,采取適合的聯合檢測項目,以提高檢出率。

本研究存在一些不足之處,由于資料局限性,尚未分析mSEPT9檢測結果與CRC患者臨床分期、轉移情況關系,未開展患者治療前后血漿mSEPT9水平變化關系和復發監測等研究。隨著基因甲基化相關治療的研究進展,mSEPT9有望成為CRC治療靶點之一,這些都值得進一步探索。血漿mSEPT9作為一種簡單無創、敏感度和特異度較高的檢測方法,聯合檢測能夠一定程度上提高敏感性,對于CRC的篩查診斷有重要意義。應積極做好CRC防治宣傳,預防為主,同時提高篩查依從性,探究檢測項目提高檢測效能,通過早發現早治療提高患者生存質量。