缺血性骨壞死動物模型研究進展

占澤銘 黃仁泰 陳云豐

缺血性骨壞死又稱無菌性骨壞死、骨梗塞，其發病與許多因素相關，包括創傷、使用糖皮質激素、酗酒、沉箱病、戈謝病、風濕性疾病等[1]。目前，各類骨壞死疾病的病理生理機制尚待研究，其診斷、治療及預防仍是臨床醫生的難題。合適的動物模型可以反映病理條件下體內微環境的變化，在一定程度上反映人類疾病的進展。然而，由于研究目的和實驗條件的差異，對于不同骨壞死部位仍缺乏標準的動物建模方法。本文回顧相關文獻，對各類缺血性骨壞死動物模型的研究進展進行綜述。

1 創傷性造模方法

1.1 手術造模

創傷性因素是引起骨壞死的最主要原因，因股骨頸骨折等創傷性因素導致骨折處周圍血供破壞并引起血液循環受阻﹐則會發展為股骨頭壞死[2]。有學者為研究肝細胞生長因子（HGF）基因修飾骨髓基質干細胞治療缺血性骨壞死的效果，建立了一種兔早期骨壞死模型[3-4]。他們通過后側切口切斷股骨頭圓韌帶并剝離周圍軟組織，從根部切斷股骨頭后再縫合關節囊，術后行CT、磁共振成像（MRI）檢查發現，3 周后造模動物明顯出現符合國際骨微循環研究協會（ARCO）壞死分期的一期或二期特征。Zhang 等[5]使用類似方法進行動物造模。他們在骨槽刀造成股骨頸骨折的基礎上，將骨折端分離2～3 min 后再用縫線固定，術后2周MRI 圖像即可見股骨頭塌陷征象。此類造模方法的優點是考慮了骨壞死的生物力學因素，能夠模擬骨折導致的創傷性骨壞死發病機制；缺點是操作難度較高，動物死亡率高。

Perthes 病是僅見于兒童的特發性髖關節缺血性壞死綜合征，發病率為0.4/10 萬～29.0/10 萬[6]。兒童因骨骼發育尚未成熟，且股骨頭血供與成人不同，學者們常采用手術方式阻斷骨周圍血供來建立Perthes 病動物模型，其中通過股骨頸結扎法建立的仔豬Perthes 病模型最常用且最成熟。自2001 年起Kim 等[7]采用仔豬建立Perthes 病模型。他們以手術方式切斷仔豬股骨頭韌帶，并用不可吸收縫合繃帶結扎同側股骨頸以阻斷血供，術后行影像學、組織學和大體標本檢查，證實成功誘導仔豬股骨干骺端缺血性壞死，并與Perthes 病的病理生理表現相似。之后此方法成為經典的Perthes病動物造模方法，至今學者們仍主要采用此方法進行Perthes 病診斷和防治的研究[8-9]。不過該方法存在不足之處，如動物體積較大、不適合集中飼養、價格較貴等，其適合經費充足的研究。

2015 年，Kamiya 等[10]選用5 周齡雄性C57 小鼠，通過微血管造影技術確定了供應小鼠股骨遠端骨骺的4 組血管，經顯微鏡輔助，通過后內側入路灼燒腘動脈骨骺分支，通過內側髕骨旁入路切開膝關節以灼燒供應右股骨遠端骨骺的膝外側上動脈、膝內側上動脈和膝下動脈。同時，他們將左股骨遠端骨骺作為對照組進行研究。術后組織學檢查證實，實驗組骨骺出現骨壞死后吸收及新骨形成過程，術后4 周HE 染色顯示，空骨陷窩和核固縮骨細胞數占骨陷窩總數的78%±15%，術后1周原位末端標記法（TUNEL）染色見死亡骨細胞數占骨細胞總數的98%±3%，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色見破骨細胞數顯著下降，隨后逐漸上升，至術后6 周達到與對照組水平相近。經微CT 圖像評估骨體積百分比、骨小梁厚度發現，實驗組均較對照組降低，術后6 周小鼠骨骺可見塌陷畸形，僅1 只小鼠死亡。該方法造模效果明確，骨壞死發生率為100%，許多學者均采用此造模方法進行Perthes 病后續研究。Yamaguchi 等[11]采用上述方法造模，研究年齡對缺血性骨壞死修復過程的影響，他們分別選取5 周、12 周、22 周和52 周齡的雄性C57 小鼠，于造模術后2 d 或4 周處死小鼠。TUNEL 染色顯示，各年齡組均可見廣泛的骨細胞死亡，證實該造模方法適用于不同年齡段小鼠。此方法可模擬臨床上因創傷后骨骺周圍血供破壞導致的缺血性骨壞死，其成模效果可靠，已逐漸成為常用的造模方式。該方法的缺點是顯微操作較復雜，手術切口多，對動物造成損傷較大，且遠端骨骺不能完全模擬其他部位（如股骨頭等）的骨壞死病理生理過程。

1.2 液氮造模

液氮造模的原理是通過液氮低溫造成骨細胞及骨間充質細胞的損傷以及骨周圍血管痙攣，損傷血管內皮細胞，導致血管內凝血，血管通透性增加，繼而發生出血和復溫后缺血再灌注損傷，進一步誘發血栓形成，冷凍區域血供減少，加重骨細胞損傷、骨質壞死，導致缺血性骨壞死[12-13]。

Wang 等[14]采用新西蘭大白兔進行造模。他們橫切兔股骨頭圓韌帶，然后立即用浸泡液氮的克氏針接觸股骨頭表面，造成血管內皮細胞損傷，進而影響血管的正常功能。術后1 個月大體觀察、微CT 及MRI 檢查均證實發生股骨頭壞死。Li 等[15]使用成年雌性小尾寒羊進行造模。他們在股骨頭-頸交界處的股骨頭負重區域鉆孔，將冷凍探針插入隧道，誘導股骨頭血管發生低溫損傷，1 個月后行組織學檢查見大量空骨陷窩出現，成功建立了股骨頭壞死的羊模型。

液氮造模的主要優點是造模周期短、動物死亡率低，具有良好的可重復性，能夠快速穩定地制備大量動物模型。缺點在于，該方法不是導致骨壞死的正常病因，不能用于骨壞死發病機制的研究，只能用于治療和預后的研究。

1.3 化學方法造模

化學方法造模是通過化學物質（通常為乙醇）直接作用于骨骼局部，對骨內部結構進行化學滅活而形成病變，國內外學者大多將該方法應用于股骨頭壞死的造模研究。

顧江江等[16]采用青腳麻雞為模型動物﹐對其股骨頭中心鉆孔﹐并在孔內注射乙醇灼燒骨質，破壞骨內血供后再植入原骨，1 個月后通過微CT圖像觀察﹐發現骨體積分數、平均小梁間距、平均骨小梁數量與對照組及未處理組相比均有顯著性不同﹐表明成功建立了股骨頭壞死模型。Yuan等[17]采用羊為模型動物﹐將無水乙醇注入羊距骨中，分別于術后2 周、4 周、12 周、24 周取材觀察股骨頭缺血性壞死情況，通過X 線、CT 檢查及組織學觀察確定距骨骨壞死模型成功建立﹐證實該方法可應用于股骨頭以外部位的骨壞死造模，為距骨壞死干預研究創造了模型基礎。

化學方法造模的優點是可重復性高，操作簡易。它的缺點是缺乏統一的化學物質用量標準，骨內可能殘留化學物質，從而破壞骨組織結構。此外，該方法也不是導致骨壞死的正常病因，不適用于骨壞死發病機制的研究。

1.4 介入栓塞造模

近年來，血管介入栓塞造模方法逐漸興起﹐該方法可以減少手術創傷法導致實驗動物損傷過大、死亡率高的問題。其方法主要分為兩類：①骨內注射栓塞材料導致骨內壓升高，靜脈回流障礙，引起局部骨組織缺血壞死；②將栓塞材料直接注入動脈，使動脈栓塞導致相應的骨組織壞死。

張開放等[18]以介入栓塞法制作兔動物模型。他們以骨穿刺針穿入股骨頸中央，注射醫用-氰基烯酸酯類膠導致骺板缺血，然后將動物置于定制的高籠中飼養，迫使動物飲食時以后肢負重。術后造模動物出現跛行，關節周圍腫脹，關節間隙增寬，骨密度下降，骨小梁內壞死細胞增多。廖勇[19]使用聚乙烯醇(PVA)、明膠海綿顆粒、栓塞彈簧圈等不同栓塞材料，采用山羊為造模動物﹐對比不同栓塞材料對造模的影響，術后6 周行病理學檢查發現，實驗組空骨陷窩百分比、骨小梁面積百分比均明顯低于對照組﹐并發現單獨應用栓塞材料時，PVA 的造模效果最佳，而聯合應用3 種栓塞材料較單獨應用1 種材料的造模效果更好。

血管栓塞造模法效果明確，對實驗動物損傷小，但手術精細，操作難度較大，通常需選用大型動物建模，且目前對栓塞劑的選擇并未取得共識。

1.5 物理加熱造模

物理加熱法也是新的造模方法。該方法通過物理方法（如微波、高強度聚焦超聲）對股骨頭加熱造成骨壞死，可形成與人類股骨頭壞死相似的病理表現，具有造模方法簡單、周期較短、造模穩定的優點，但需要特定設備，有一定局限性。

彭吾訓等[20]對微波加熱制作兔股骨頭壞死模型的設定溫度及時間開展研究。他們分別以50℃10 min、50℃20 min、55℃10 min、60℃10 min的條件造模，然后行組織學檢查及MRI 檢查。研究結果顯示，以55℃10 min 進行造模，4 周后即出現骨壞死及修復現象，12 周時可出現股骨頭壞死塌陷表現，塌陷率為75%。他們認為，55℃10 min為最適宜造模的微波溫度和時長。徐燕等[21]對高強度聚焦超聲建立骨壞死模型的可行性進行探索，他們以80 W/cm2強度超聲照射兔股骨頭，并于照射后1 d、7 d、14 d、21 d 分別行大體形態觀察及組織學檢查。研究結果顯示，此方法形成的骨壞死具有清晰的病理演變特征，顯示出高強度聚焦超聲應用于骨壞死造模的可行性。

2 非創傷性造模方法

2.1 激素誘導

激素是導致股骨頭壞死的第二大病因[22]，許多學者通過激素誘導的方法來建立動物模型，以模擬人激素性股骨頭壞死[23]。該造模方法操作方便，對動物創傷小，但不同學者采用的激素種類不同，劑量和給藥途徑也存在差異，方法較難標準化。此外，單獨應用激素還存在壞死部位不集中、動物死亡率高、造模成功率低等缺點[24]。為避免其不足，一些學者采用間斷性給藥，以降低動物死亡率，達到穩定建模的效果。Liu 等[25]采用健康雌性小鼠造模。他們給予小鼠肌內注射甲基強的松龍20 mg/kg，每周前3 d 注射3 次后停4 d，連續使用3 周后停3 周，用時共6 周。他們發現，造模小鼠全數存活，微CT 檢查顯示其股骨頭軟骨面變薄，骨小梁稀疏，HE 染色見骨陷窩內骨細胞減少。

2.2 激素聯合脂多糖誘導

脂多糖（LPS）為外源性致熱源，其可通過介導一系列炎癥因子表達誘導血管中的內皮細胞凋亡，并可通過內源性凝血途徑引起機體的高凝狀態。LPS 與激素合用可造成血管內凝血﹐影響血液循環。臨床中多數骨壞死患者系患有免疫系統疾?。ㄈ缦?、系統性紅斑狼瘡），這些免疫系統疾病導致機體產生微循環障礙，在大量、長期的激素治療后發展為激素性骨壞死[26]。因此，激素聯合LPS的造模方法逐漸為廣大學者所用。

Lv 等[27]采用SD 大鼠造模，于第1 天、第2天肌內注射LPS 1.0 mg/kg，然后連續3 d 注射甲基強的松龍40 mg/kg，4 周后通過組織病理學檢查發現，造模大鼠出現股骨頭的骨小梁斷裂、骨陷窩內骨細胞減少，TUNEL 法檢測顯示實驗組股骨頭骨細胞凋亡率高于對照組。Jin 等[28]則選用雌性C57小鼠進行造模研究，他們于第1 天、第2 天給予小鼠腹腔注射LPS 20 μg/kg，2 d 后每天肌內注射甲基強的松龍 40 mg/kg，并提高喂養槽高度以強迫小鼠站立進食，同時每天將小鼠置于旋轉籠中，鼓勵活動2 h，4 周后通過組織病理學檢查發現，成模率為80%，小鼠死亡率為16.7%。

2.3 激素聯合異種動物血清誘導

類似于LPS，異種動物血清（如馬血清）能誘發機體出現超敏免疫反應，使血管內皮受損，形成血管炎癥。使用激素聯合馬血清則可導致微血管栓塞，從而提高建模成功率。王小龍等[29]使用靜脈注射馬血清加腹腔注射甲基強的松龍的方法對新西蘭大白兔進行造模，4 周后模型大體標本及MRI 圖像均可見骨壞死表現，造模成功率為84.62%，動物死亡率為13.33%。

2.4 酒精誘導

酒精性骨壞死常發生于中青年過量飲酒者，在男性股骨頭壞死病因中占30.68%[26]。近年來，酒精性骨壞死的發病率不斷升高。因此，學者們采用酒精灌胃、含酒精飲食等方法進行骨壞死動物造模，以模仿過量攝取酒精導致的骨壞死。

楊云等[30]使用酒精灌胃法給予Wistar 大鼠46°白酒，并采用抬高喂養槽的方法使其進食時下肢承重，以更接近人類的生物力學作用，6 個月后造模成功率達89.48%，但未出現股骨頭變形塌陷及髖臼磨損改變，大鼠死亡率為10%。Yang 等[31]使用酒精對大鼠進行6 周喂養，初始酒精濃度為5%，以后每周增加5%，最后酒精濃度穩定于30%。該方法比灌胃法更人道，操作更簡單。6 周后經微CT 和組織病理學檢查證實，大鼠股骨頭軟骨下區出現多發彌漫性空腔隙及骨髓壞死，10 只大鼠中8 只出現嚴重股骨頭壞死。

高濃度酒精灌胃法的成模率高，但動物死亡風險也隨之增高，且存在乙醇濃度無統一標準，壞死部位不集中等缺點。目前大部分有關酒精建模的研究都無法進展至股骨頭塌陷階段[32]，造模方案還需進一步改良。

2.5 減壓誘導

減壓性骨壞死屬于比較罕見的骨壞死類型，主要發生于一些特殊工作人員（如潛水作業員、沉箱作業員等），他們在高氣壓環境下突然下降至正常氣壓后，原溶解于血液中的氮氣釋出，并在骨髓中大量堆積，最終導致骨壞死。建立減壓性骨壞死動物模型可用于研究其病理機制、診治及預防等[33]。

目前用于減壓性骨壞死的造模動物主要有羊和豬，而豚鼠、狗等不適用。李慈等[34]進行了動物實驗研究，他們用加壓艙將小型豬置于0.45 MPa壓力環境下6 h，然后于1 min 內將壓力減至正常大氣壓水平，如此處理每周重復2～3 次，共持續6 個月。隨后通過骨掃描及骨病理學檢查發現，實驗動物的肱骨頭、股骨頭血流淤滯，股骨頭壞死變形。Sobakin 等[35]則使用綿羊進行研究，他們將綿羊置于0.28 MPa 壓力環境下24 h，隨后以每分鐘下降0.09 MPa 的速率減壓，通過骨掃描檢查可見近端或遠端長骨均出現骨修復現象﹐提示發生了骨壞死。

減壓誘導造模的優點是骨壞死部位不局限于股骨頭，還可出現其他部位如肱骨、橈骨等壞死，這對于其他部位骨壞死模型的研發和應用有啟發作用。而其缺點也十分明顯，此類動物模型僅能用于減壓性骨壞死的相關研究，且造模周期長，對實驗設備要求高。

3 結語

不同的骨壞死動物造模方法各有優劣，適合于對骨壞死不同方向的研究，目前尚無與人類骨壞死發病機制完全一致的動物模型。激素造模法符合臨床股骨頭壞死的發病過程，研究意義大，但對于采用激素的種類、劑量、給藥方式等尚未有統一結論。對于創傷及手術后恢復不良導致的骨壞死研究，手術造模為最佳選擇。對于酒精導致骨壞死的研究，可選用局部注射無水乙醇、含酒精飲食喂養等方式誘導造模。液氮造模對實驗動物的損傷小，造模方法簡便，建模效果穩定，是目前使用較多的方法，適用于對骨壞死治療的研究。

在骨壞死造模領域，大部分研究集中于股骨頭壞死、Perthes 病，尚缺乏對其他部位骨壞死如肱骨頭壞死、距骨壞死、舟骨缺血性壞死等造模的研究。動物模型的研究能為相關疾病的發病機制、防治方案等后續研究提供基礎，因此不同部位骨壞死模型的研究還需進一步探索。