水稻穎殼類病斑突變體glmm1的鑒定與基因定位

徐歡 周濤 孫悅 王木妹 楊亞春 馬卉 李浩 徐大偉 周海 楊劍波 倪金龍,*

水稻穎殼類病斑突變體的鑒定與基因定位

徐歡1,#周濤2,#孫悅1王木妹3楊亞春2馬卉2李浩2徐大偉1周海3楊劍波2倪金龍2,*

(1安徽農業大學 農學院，合肥 230036；2安徽省農業科學院 水稻研究所，合肥 230001；3華南農業大學 生命科學學院，廣州 510642；#共同第一作者；*通信聯系人，email: jlni09@163.com)

【目的】鑒定水稻穎殼類病斑突變體，并進行基因定位，為基因克隆及其分子機制研究奠定基礎?！痉椒ā繉σ吧筒牧螸R005和經EMS誘變得到的穎殼類病斑突變體（）進行農藝性狀分析、掃描電鏡分析、DAB染色和全硅含量測定。與廣親和材料L422雜交獲得的F2群體用于遺傳分析，利用圖位克隆和BSA-seq方法進行基因定位?！窘Y果】突變體在抽穗10 d后穎殼和葉片逐漸出現褐色斑點，成熟后穎殼完全呈現褐色。與野生型相比，突變體的株高、穗長、每穗總粒數、結實率和千粒重等都極顯著降低。DAB染色表明穎殼和葉片的活性氧含量增多；掃描電鏡顯示突變體穎殼和葉片表面硅質細胞皺縮。遺傳分析結果表明，突變體的穎殼類病斑表型受到一對隱性基因控制。利用與L422的F2分離群體，通過圖位克隆和BSA-seq等策略將定位在水稻第2染色體上68 kb的區間內。該區間內有10個候選基因。序列分析發現該區間僅有一個SNP位點，位于基因（）的第5個外顯子上，導致第238位氨基酸由異亮氨酸變為蘇氨酸。對穎殼和葉片全硅含量的測定表明，突變體中硅的積累減少，說明可能是的等位突變?！窘Y論】是新的等位突變基因，該突變造成植株硅含量的降低和活性氧的積累，致使穎殼和葉片產生褐色類病斑。

水稻；突變體；類病斑；硅轉運蛋白；基因定位

類病斑（lesion mimic）是植物在生長發育過程中未受到脅迫而自發產生的壞死斑，在形態上類似于植物遭受病原菌侵染引起過敏反應而產生的病斑，常見于植物的葉片、葉鞘、莖稈和種皮上[1, 2]。類病斑突變體在高等植物中廣泛存在。水稻中已報道了100多個類病斑突變體，主要以葉片類病斑居多，如～[3]，[4]，[5]，[6]和[7]等。類病斑突變體往往表現發育遲緩或早衰，嚴重影響產量的形成；另一方面，大多數類病斑突變體體內防御基因的表達水平顯著提高，植株抗病性增強[8]。因此，對水稻類病斑突變體的研究能促進人們對水稻產量形成與抗病性的協同調控機制的深入理解。

隨著對水稻類病斑突變體研究的深入，越來越多的基因被定位和克隆。這些基因的不同功能決定了類病斑發生機制的差異?？共』蚴撬镜挚共≡秩竞蛿U展的重要基因，其突變可能會導致類病斑產生。編碼一個典型的CC-NB-LRR蛋白，其突變導致過氧化氫和水楊酸過量積累，在水稻葉鞘上出現自發壞死斑[9]。細胞程序性死亡失控同樣能導致水稻類病斑的產生。編碼E3泛素連接酶[4]，該基因突變會導致細胞程序性死亡調控失效，出現大面積的細胞死亡，產生斑點葉。光合色素含量的下降會影響正常的光合作用，導致細胞死亡產生類病斑。水稻突變體中葉綠體嚴重降解，葉綠素含量下降，光合蛋白活性變弱，影響光合作用和葉綠素生物合成，導致活性氧的積累和類病斑的形成[10]。一些信號分子的大量積累也會導致類病斑發生，如活性氧[11]、水楊酸[12]和一氧化氮[13]等。

水稻是典型的“喜硅作物”，在水稻生長發育中硅元素的重要性不言而喻。硅是土壤中含量第二的元素[14]，它主要以單硅酸的形式存在于土壤中。雖然硅并非水稻的必需營養元素，但硅在水稻逆境調節中發揮著非常重要的作用，能很好地抵御真菌、害蟲等生物脅迫以及鹽脅迫、金屬毒害、干旱脅迫、輻射損傷、營養失衡、高溫、冰凍等多種非生物脅迫[15]。硅的吸收和轉運是通過硅轉運蛋白來調節的，是高等植物中第一個被鑒定出來的硅轉運蛋白基因，它主要定位于根的外皮層和內皮層外側細胞膜，它的突變會導致硅吸收缺陷[16, 17]?；驗楣柰馀呸D運蛋白，在大田環境下，突變體植株矮化，穎殼顏色稍有變化，結實率降低，地上部分和穎殼中硅積累量下降[18]。突變體地上部硅沉積混亂，導致硅酸鹽作為硅質體在劍葉中重新沉積從而使葉片上的硅濃度比野生型高很多，而在穎殼中的沉積減少，導致穗部的水分散失，最終表現為白穗[19, 20]。根吸收的硅被硅轉運蛋白Lsi1運進植物體內，然后硅外排轉運蛋白Lsi2負責將硅外排到中柱細胞，通過裝載進入木質部，最終通過Lsi1蛋白進入水稻各組織[21, 22]。硅以單硅酸Si(OH)4被植物吸收，然后以水合二氧化硅（SiO2·H2O）的形式留存在表皮和維管束等組織中形成植硅石[23]。植硅石的研究測試手段包括光學顯微鏡、X射線衍射、透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡等[24]。

在眾多水稻類病斑突變體中，穎殼類病斑突變體鮮見報道。本研究從穩定遺傳的甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate, EMS）誘變材料中發現一個穎殼類病斑突變體，該突變體在抽穗10 d后，穎殼和葉片逐漸出現褐色斑點，成熟后顏色更深，通過基因定位和MutMap分析發現，是基因突變引起的，而基因編碼一種硅轉運蛋白。因此，我們推測突變體穎殼類病斑的出現可能與硅的轉運有關。本研究對該突變體進行表型鑒定、基因定位、理化分析和組織微觀結構觀察，旨在為解析水稻類病斑形成的分子機制提供更多的線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料包括安徽省農業科學院水稻研究所自育材料秈稻LR005和粳型常規稻L422，以及LR005經EMS誘變獲得的突變體(穎殼類病斑突變體，)。材料種植于安徽農業科學院水稻研究所廬江試驗基地，每行種10株，株行距16.5 cm×25 cm，合理施肥和排灌水，抽穗期前后考查穎殼顏色和取樣，成熟期隨機取20株考查株高、穗長、有效穗數、每穗總粒數、結實率和千粒重等農藝性狀。

1.2 DAB染色法

利用二氨基聯苯胺（DAB）能和H2O2發生反應生成紅褐色物質的特性，參考沈旺鑫的方法[25]，進行活性氧的染色。1％DAB溶液配制：將DAB粉末溶于pH為3.8的Tris-HCl，4℃下遮光保存，現配現用。取抽穗期野生型和突變體劍葉放入1%的DAB溶液中，真空處理15 min，后室溫暗處理20 h。將DAB溶液倒出加入無水乙醇，沸水浴褪色至無色。將葉片轉移到提前配制好的固定液（等體積的無水乙醇甘油乳酸混合）中固定8 h后，取出觀察是否有紅褐色出現并拍照。

1.3 遺傳分析及定位群體的構建

以為母本與正常材料L422雜交獲得F1，收獲F1種子，種植于安徽省農業科學院水稻研究所廬江試驗基地。觀察F1植株表型并自交得到F2種子。將F2材料種植于安徽省農業科學院水稻研究所廬江試驗基地，觀察F2群體表型，統計F2群體中野生型和突變體分離比，利用F2群體進行遺傳分析及基因定位。

1.4 精細定位和候選基因確定

以F2群體為定位群體，采用改良的CTAB法[26]提取DNA。從F2群體中分別選取30株正常植株與30株極端突變表型植株，分單株提取DNA并等量混合，構建野生型池和突變型池。然后使用120個InDel和180個SSR標記在雙親間進行多態性篩選，再利用篩選出的均勻分布于水稻12條染色體的多態性標記擴增兩個混池，選擇突變型池與突變體親本帶型相同而與野生型池帶型不同的標記，為可能的連鎖標記，完成初步定位。再根據雙親的變異信息在初步定位區間內設計高密度InDel引物進一步縮小定位區間，進行精細定位（表1）。

表1 InDel標記引物信息

取穎殼類病斑表型植株30株提取DNA，等量混合，構建突變型池并隨雙親進行二代測序，用于MutMap分析和預測候選基因。

1.5 掃描電鏡觀察

使用鋒利的刀片將野生型和突變體的穎殼和葉片切成小塊，固定在2.5%的戊二醛溶液里，再用30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、100 %乙醇梯度脫水。將脫水的穎殼和葉片冷凍干燥并鍍金。使用掃描電鏡（Zeiss，EVO MA 15型）觀察野生型和突變體的穎殼和葉片。

1.6 硅含量測定

采集成熟后的野生型和突變體的穎殼和葉片進行全硅含量的測定，每個樣本3次重復。采用硅鉬藍比色法[27]測定硅含量。首先將水稻組織經強堿消煮，將浸出的硅酸與鉬試劑反應生成硅鉬酸，再將硅鉬酸還原為硅鉬藍，在分光光度計上比色，通過與硅標準溶液對比來測定硅含量。

2 結果與分析

2.1 突變體glmm1的表型特征

突變體在幼苗期和成熟期都比野生型矮（圖1-A, B）。在抽穗初期，和野生型的穎殼和葉片上均未出現褐色斑點（圖1-F, I）；抽穗10 d后突變體的穎殼和葉中部逐漸開始出現褐色斑點，葉尖開始干枯（圖1-G, J）；至成熟期，葉中部的褐色斑點不斷延伸，葉尖干枯更加嚴重，穎殼布滿褐色斑點（圖1-E, H, K）。成熟期的性狀調查表明，突變體的分蘗數與野生型無顯著差異，但株高、穗長、每穗總粒數、結實率和千粒重等都極顯著降低（表2），并且粒長變短，粒寬變窄（圖1-C, D）。

A, B?苗期和成熟期的野生型(WT)和glmm1的表型；C, D, E?WT和glmm1的籽粒；F, I?抽穗初期；G, J?抽穗中期；H, K?成熟期。標尺分別為15 cm（A, B）, 1 cm（C, D, E）和4 cm（F, G, H, I, J, K）。

Fig. 1. Phenotypic comparison of WT and mutant.

2.2 活性氧染色

活性氧具有很強的氧化能力，它的積累會損害細胞，嚴重時造成細胞的死亡。類病斑的出現往往與活性氧過度積累引起的細胞程序性死亡有關[8]。為了探究穎殼和葉片類病斑是否也與活性氧過度積累有關，采用DAB染色法分析突變體H2O2在穎殼和葉片中的積累情況。檢測結果顯示，與野生型相比，的穎殼和葉片均被染上褐色（圖2-A, B），表明穎殼和葉片有大量H2O2的積累。由此推測，穎殼和葉片出現的類病斑癥狀可能是活性氧的過度積累所致。

圖2 野生型和突變體glmm1的穎殼和葉片DAB染色

Fig. 2. DAB staining results of glumes and leaves of the wild-type and its mutant.

2.3 基因定位及候選基因確定

2.3.1 遺傳分析

2.3.2 精細定位

選取120個InDel和180個SSR標記對親本L422和進行多態性篩選，共選出覆蓋在水稻12條染色體上的多態性標記91個。利用這91個多態性標記進行初定位，結果顯示位于第2染色體標記X1和X6之間，物理距離約為2.48 Mb（圖3-A）。通過在該區間設計高密度標記（表1），并結合染色體步移策略，將精細定位在標記Y3和Y5之間，物理距離為68 kb，覆蓋10個編碼基因（圖3-B和圖3-C）。根據水稻基因組注釋計劃數據庫（http://rice.uga.edu/）提供的信息，對該區間的10個基因進行注釋分析（表4），其中（）和（）已被克隆。編碼硅轉運蛋白，它的突變會導致地上部組織硅含量的減少[16]；編碼Cullin蛋白，是RING型E3泛素連接酶的一部分，該基因突變體的葉片表面會出現淺紅色褐斑，葉片中積累更多過氧化氫[28]。由于突變體穎殼和葉片表面植硅石結構和二氧化硅細胞均發生了變異，同時穎殼和葉片活性氧也均出現了過度積累，這暗示和都有可能是的候選基因。

表2 野生型與突變體glmm1的主要農藝性狀比較

表中各數據以“平均值±標準差”形式呈現。**代表野生型與突變體間的差異達0.01顯著性水平。樣本量：株高=20，穗長=20，有效穗數=20，每穗總粒數=10，結實率=10，千粒重=4。

The data in the table are listed as means ± standard deviation. **Difference between WT and mutant is significantat0.01 level. Sample size: for plant height,=20; for panicle length,=20; for grain number per panicle,=20; for seed-setting rate,=10; for thousand grain weight,=4.

表3 glmm1穎殼類病斑性狀的遺傳分析

2.3.3 MutMap分析

通過對親本L422、LR005和突變體混池高通量測序（MGI-DNB Seq測序平臺），共獲得34.6G數據，GC含量為43%～44%。參考基因組為日本晴，基因組大小365M，來源于Rice Genome Annotation Project網站(http://rice.uga.edu/)。三個樣本的GC含量分別為43.95%、43.3%和44%，Q30分別為91.22%、91.5%和89.59%。表明測序質量高，一致性好，可用于MutMap分析。

采用YuSugihara的MutMap分析腳本，將滑動窗口(slide windou)設置為2M、以步長100 k，利用QTL-seq（https://github.com/YuSugihara/mutmap）進行分析。根據分析結果發現，在第2染色體上檢測到一個超過0.99閾值線的正態分布峰，該區域與之前定位的結果一致（圖3-D）。在該區域內僅有1個SNP的SNP指數達到了1，位于基因（）上。通過對該基因測序，結果表明該突變位于基因的第5個外顯子上（圖3-F），突變造成編碼的第238位氨基酸從異亮氨酸（Ile）變為蘇氨酸（Thr）（圖3-E），與之前SNP指數為1的位點一致；而基因組序列在野生型和突變體之間沒有差異。根據以上結果我們推測，突變體表型可能是基因突變所致。

2.4 掃描電鏡分析

為了探究穎殼和葉片出現褐色斑點的原因，對野生型和突變體的穎殼及葉片進行了掃描電鏡分析。穎殼掃描電鏡結果表明，與野生型雙乳突狀的結構相比（圖4-A, B和圖4-E, F），在突變體植株出現褐色斑點前后，穎殼表面植硅石結構遭到破壞，表現為粗糙和皺縮（圖4-C, D和圖4-G, H）。葉片的掃描電鏡結果顯示，野生型正常（圖4-I, J和圖4-M, N），葉片出現褐色斑點前后表面的啞鈴型二氧化硅細胞也遭到了破壞（圖4-K, L和圖4-O, P）。這表明基因的突變導致了水稻穎殼植硅石結構和葉片表面硅質細胞的破壞。

表4 候選區間基因注釋

圖3 水稻GLMM1基因的精細定位

Fig. 3. Fine mapping of ricegene.

2.5 全硅含量的測定

由于編碼產物為硅轉運蛋白，為了探討該突變是否會造成植株硅含量的變化，對成熟后的野生型和突變體的穎殼和葉片進行全硅含量的測定。結果顯示，的穎殼和葉片的全硅含量和野生型比較均顯著降低（圖5），野生型中穎殼的全硅含量為23.00 g/kg，突變體中葉片的全硅含量為3.43 g/kg；野生型中葉片的全硅含量為31.23 g/kg，突變體中葉片的全硅含量為4.82 g/kg。表明的基因突變導致了其體內全硅含量的降低，進一步表明即為。

A, C, I, K?抽穗初期野生型(WT)和glmm1的穗和葉片的表型特征；B, D, J, L?抽穗初期WT和glmm1的穗和葉片的掃描電鏡觀察；E, G, M, O?成熟期WT和glmm1的穗和葉片的表型特征；F, H, N, P?成熟期WT和glmm1的穗和葉片的掃描電鏡觀察。標尺為4 cm（A, C, E, G, I, K, M, O），40 μm(B, D, F, H, J, L, N, P)。紅色箭頭指向植硅石和二氧化硅細胞。

Fig. 4. Scanning electron microscopy observation of rice glumes and leaves.

3 討論

在已發現的100多個類病斑突變體中，大多數的斑點出現在葉片上，但它們出現的時間各不相同，[29]、[30]、[31]和[32]等突變體分別在播種10、14、20和30 d后葉片開始出現斑點，[33]在3～4葉期，[34]在開花期，[6]在分蘗后期。本研究的突變體在抽穗前不出現類病斑，抽穗10 d后逐漸出現褐色病斑，隨著水稻的不斷成熟，褐色病斑的數量不斷增多，并且這些褐斑不僅出現在葉片上還出現在穎殼表面。這表明類病斑的出現依賴于一定的生長發育進程。

A?穎殼；B?葉片。**代表野生型與突變體間的差異達0.01顯著水平(n=3)。

Fig. 5. Determination of total silicon content of the wild type (WT) and its mutant.

水稻類病斑發生過程中活性氧發揮著重要作用?；钚匝跷镔|主要存在于細胞的線粒體和葉綠體中，通常在植物體內維持低濃度的動態平衡，在受到病原菌侵害時，激活植物的免疫反應，抵御病原菌的侵染，是植物限制病原菌侵染的重要途徑[35]。然而，大量積累的活性氧會影響細胞正常的生理活動，破壞細胞結構和穩態，進而引起細胞程序性死亡，產生褐色類病斑[36]。Lin等[37]發現的類病斑突變體由于體內活性氧含量升高，激活了硝酸還原酶的活性，造成一氧化碳的大量積累，產生類病斑。本研究的穎殼類病斑突變體不僅在葉片上檢測到活性氧積累，而且在穎殼上同樣檢測到大量的活性氧存在?；钚匝醯姆e累通常是由于細胞內活性氧清除機制受到干擾，如細胞內超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽等含量或活性降低，導致不足以清除新產生的活性氧。水稻缺硅會導致抗氧化能力的降低和活性氧的積累。前人研究表明，過表達的水稻比野生型和轉基因水稻擁有更多的抗氧化酶類，如抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等，在應對紫外線輻射時表現出更好的耐受性[38]，推測突變體可能對硅元素吸收減弱導致抗氧化能力衰退，進而引起活性氧的積累。

本研究對突變體進行了遺傳分析和基因定位，發現受單隱性基因控制，通過精細定位和MutMap分析預測該基因可能為（），測序分析發現突變體在基因的第5個內含子的堿基由T變為C，造成編碼的第238位氨基酸從異亮氨酸Ile變為蘇氨酸Thr；而突變體是單堿基突變,由G變為A，造成第132位的丙氨酸變成蘇氨酸。這兩種突變都會降低硅元素積累，但其他性狀不盡相同，可能是突變位點不同所致。由此推測，是基因的新等位型。

水稻是典型的“喜硅作物”，硅元素在水稻表皮細胞的硅質化，病蟲害的防御和養分轉運等方面都發揮著重要的作用[39]。植硅石廣泛存在于水稻的穎殼表皮，它的中空狀隆起體區別于別的禾本科植物，具有光滑的外壁丘形隆起和雙乳狀突起。植硅石的形成主要是通過“硅質化”代謝產生的，水稻由根部吸收的硅酸通過蒸騰作用至地上部，然后沉積在葉片和穎殼等器官的表皮細胞上[40-43]。這種沉積與水稻的硅元素吸收情況密切相關，水稻的新嫩葉片在缺硅處理后未出現明顯的硅化細胞并且乳突較小，而供硅處理的情況則截然不同，呈現均勻分布的硅化細胞和較大的乳突[44]。本研究發現穎殼和葉片表面的植硅石形態和結構異常，均出現了不同程度的皺縮和破損。對野生型LR005和突變體穎殼和葉片的全硅含量檢測結果表明，硅元素在的吸收和積累受到抑制，從而導致了植硅石形態和結構的異常。初步闡釋了水稻突變體的表型及候選基因，為解析穎殼類病斑的基因克隆和分子機理的解析提供理論基礎。

謝辭：本研究二代測序工作得到了國家基因庫的支持，特此致謝。

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Characterization and Gene Mapping of a Glume Lesion Mimic Mutantin Rice

XU Huan1,#, ZHOU Tao2,#, SUN Yue1, WANG Mumei3, YANG Yachun2, MA Hui2, LI Hao2, XU Dawei1, ZHOU Hai3, YANG Jianbo2, NI Jinlong2,*

(College of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230001, China; College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; These authors contributed equally to this paper; Corresponding author, email: jlni09@163.com)

【Objective】The aim of this study is to identify and map the glume lesion mimics mutant genein rice, and to lay a foundation for gene cloning and molecular mechanism research. 【Method】Agronomic traits analysis, scanning electron microscopy observation, DAB staining, and total silicon content determination were performed on the wild-type material LR005 and the glume lesion mimics mutantobtained through EMS mutagenesis. The F2population derived fromand L422 was used for genetic analysis, and gene mapping by map-based cloning and BSA-seq method. 【Result】The mutant gradually showed brown spots on the glumes and leaves 10 days after heading, and the glumes were completely brown at mature stage. Compared with the wild type, the mutant showed highly significant reductions in plant height, panicle length, total number of grains per panicle, seed setting rate and 1000-grain weight. DAB staining showed that theglumes and leaves had increased ROS(reactive oxygen species) content; Scanning electron microscopy observation showed that the siliceous cells on the surface of the mutant glumes and leaveswrinkled. The genetic analysis showed that the glume lesion mimics phenotype ofwas controlled by a pair of recessive genes. Using the F2segregating population ofand L422,was localized to a 68-kb interval containing 10 genes on chromosome 2 by map-based cloning and BSA-seq. Sequence analysis revealed only one SNP in this interval, which located in the fifth exon of the gene(LOC_Os02g51110), resulting in a substitution of Ile with Thr. The reduced accumulation ofsilicon was found by measuring total silicon content of the glumes and leaves, suggesting thatmay be a mutant allele of. 【Conclusion】is a new mutant allele of, which causes a reduction in silicon content and accumulation of reactive oxygen species in plants, resulting in brownspots on glumes and leaves.

rice; mutant; lesion mimic; silicon transporters; gene mapping

10.16819/j.1001-7216.2023.221201

2022-12-05；

2023-01-31。

安徽省重點研發計劃資助項目(202104g01020013, 202104b11020008); 安徽省農業科學院青年英才計劃資助項目（QNYC2019, QNYC2022）；水稻遺傳育種安徽省重點實驗室開放課題（SDKF-2021-02）。