紅豆杉枝枯病病原鑒定及殺菌劑室內毒力測定

喬雨晴 ， 李媛 ， 羅國安 ， 徐燕婷 ， 汪天娜 ， 蘇秀

（1. 浙江農林大學林業與生物技術學院, 浙江 杭州 311300； 2. 余姚市林業服務中心, 浙江 余姚 315400； 3. 景寧畬族自治縣沙灣鎮人民政府, 浙江 景寧 323507； 4. 杭州市臨安區植物檢疫站, 浙江 杭州 311300）

曼地亞紅豆杉Taxus×media是東北紅豆杉Taxus cuspidata和歐洲紅豆杉Taxusbaccata的雜交種，其植物學特征介于雙親之間，生長速度快，生物學特性穩定。自20 世紀90 年代我國引種后，現已在各地廣泛栽植。曼地亞紅豆杉體內紫杉醇含量較高，藥用價值極高[1-2]，同時也具有較高的生態價值，對環境適應能力較強，可廣泛應用于水土保持林、水源涵養林[3]。

曼地亞紅豆杉常見病害主要有紅豆杉莖腐病、紅豆杉白絹病、紅豆杉炭疽病等[4-5]。枝枯病是近年來日益嚴重的病害，其病原侵染性強，病害蔓延迅速，常導致枝條枯死，嚴重時可造成大面積植株死亡。在杭州臨安、余杭等地，曼地亞紅豆杉枝枯病發病較為普遍，嚴重地區發病率可達80%左右，造成巨大的經濟和生態損失。目前，曼地亞紅豆杉枝枯病病原尚未明確，影響了病害的科學防控。

本研究對采集于浙江臨安的曼地亞紅豆杉枝枯病病樣進行組織分離，基于病原形態學、致病性和分子序列特征對病原進行了鑒定，并采用菌絲生長速率法測定了6 種常用殺菌劑的毒力，以期為該病害的科學診斷與有效防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020 年10 月，從臨安區潛川鎮銀福紅豆杉基地采集曼地亞紅豆杉枝枯病病枝，用于組織分離、純化和培養。同時，將基地中采集的3 a 生健康曼地亞紅豆杉樹苗，置于25 ℃恒溫培養室培養用于接種。

選擇常用的6 種殺菌劑作為供試藥劑。50%多菌靈可濕性粉劑（WP），安徽華星化工有限公司；250 g/L 吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫植物保護有限公司；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（WG），拜耳股份公司；60%吡唑醚菌酯·代森聯WG，巴斯夫歐洲公司；48%苯甲·嘧菌酯懸浮劑（SC），惠州銀農科技股份有限公司；啶氧菌酯SC，美國杜邦公司。

1.2 病原菌的分離鑒定

選取發病枝條病健交界組織采用組織分離法進行病原菌分離純化[6]，直至獲得純培養物。制作臨時玻片，參照蔡磊 等[7]的方法通過光學顯微鏡觀察病原菌形態和培養特征。采用創傷接種法將分離純化得到的菌株接種至健康樹苗側枝部位，測定其致病性。采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取分離菌株總DNA，進行rDNA-ITS、β-tubulin、tef1基因序列的PCR 擴增，具體反應體系和擴增條件均參照石凌波[8]的方法進行。rDNA-ITS 的PCR 擴增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[9]，βtubulin引物為Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）[10]，tef1擴增引物為EF1-526F（5′-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3′）和EF1-1567R（5′-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3′）[11]。取PCR 產物5 μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶是否單一清晰，切膠回收后送公司測序。將測序結果提交至NCBI 數據庫，經BLAST 數據分析后，選取合適的參比菌株的基因序列，采用MEGA7 軟件進行同源性分析，對串聯后的序列基于鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹。

1.3 藥劑室內毒力測定

采用菌絲生長速率法[12]測定6 種殺菌劑對病原菌的毒力。50%多菌靈WP 的質量濃度梯度為0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 mg/L，其他藥劑的質量濃度梯度均為8，4，2，1，0.5，0.25 mg/L。配制不同質量濃度的含藥PDA 平板。取培養4 d 的病原菌菌落，用打孔器取直徑7 mm 的菌餅，將菌餅分別接種在含有不同質量濃度藥劑的PDA 培養基上，以加入清水的培養基作為對照。每個處理重復3 次。接種病原菌后將培養皿倒置放于25 ℃恒溫培養箱黑暗培養，待對照組菌絲長至培養皿的2/3 后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4 數據處理

計算每個菌落直徑的平均值和藥劑對菌絲生長的抑制率。使用SPSS 22.0 軟件進行分析，將藥劑質量濃度轉化為以10 為底的對數值作橫坐標，各處理質量濃度的生長抑制率轉化成概率值作縱坐標，求出各藥劑的毒力回歸方程、半最大效應濃度（EC50值）和相關系數[13]，根據EC50值評價殺菌劑的毒力大小。

菌絲生長抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100

2 結果與分析

2.1 病原菌形態和發病癥狀

經組織分離純化的菌株高度一致，選取代表菌株LA-02 在PDA 培養基上25 ℃培養6 d 后，菌落呈白色輪紋絮狀（圖1A，B），15 d 后菌落上出現含分生孢子的黑色黏液（圖1C）。分生孢子呈梭形、橢圓形或近圓柱形，直或稍彎曲，大小為（21 ～29）μm × （7 ～ 9）μm，孢身4 個隔膜；頂端細胞透明，中間3 個細胞著色，圓錐或圓柱形，細胞壁薄且光滑，具有2 ～ 3 根頂端附屬絲，一根基部附屬絲（圖1D）。菌株LA-02 形態學特征與新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsissp. 真菌較為一致[14]。

圖1 曼地亞紅豆杉枝枯病病原菌落特點Fig. 1 Pathogen colony morphology of T. × media branch blight

接種LA-02 后的發病植株病斑部位再次組織分離獲得菌株的菌落特征、分生孢子形態等均與LA-02 一致；感病部位呈淡褐色，逐漸凹陷、溢縮，呈現明顯凹斑，皮層干枯（圖2A，B）；對照組傷口無任何感病癥狀（圖2C）。因此，分離菌株LA-02確定為曼地亞紅豆杉枝枯病的病原菌，符合科赫法則。

圖2 曼地亞紅豆杉枝枯病發病癥狀Fig. 2 Symptom of T. × media branch blight

2.2 系統發育樹

菌株LA-02 與新擬盤多毛孢屬棒狀新擬盤多毛孢菌N.clavispora聚類在一個小的分支上（圖3）。LA-02 的ITS 序列（ON394607）與NCBI 中ITS 序列（MG729676.1）相似度達100%，β-tubulin序列（OQ 790164）與NCBI 中β-tubulin序列（OP654877.1）相似度達100%，tef1序列（OQ790165）與NCBI 中tef1序列（MT745889.1）相似度達98.83%。結合系統發育分析與形態學鑒定特征，將曼地亞紅豆杉枝枯病病原菌LA-02 確定為棒狀新擬盤多毛孢N.clavispora。

圖3 聯合rDNA-ITS，β-tubulin 和tef1 基因序列構建的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of LA-02 constructed by combining rDNA-ITS, β-tubulin and tef1 gene sequences

2.3 殺菌劑的毒力

6 種殺菌劑均對菌株LA-02 的菌絲生長有不同程度的抑制作用（表1）。50%多菌靈WP 和250 g/L吡唑醚菌酯EC 對菌絲的抑制效果較好，EC50分別為0.065，0.548 mg/L，且無顯著差異。

表1 藥劑對曼地亞紅豆杉枝枯病病原菌的室內毒力Tab. 1 Laboratory toxicity of different fungicides to pathogen of T. × media branch blight

3 討論

新擬盤多毛孢屬真菌屬于子囊菌門Ascomycota，其寄主?；圆桓?，可侵染多種植物，引起枝枯、葉枯、葉斑等不同癥狀，是重要的植物病原菌[15-16]。由于形態學指標的界限不明顯，擬盤多毛孢屬真菌的分類一直存在爭議，曾經過多次修正[17]。2014 年，Maharachchikumbura 等以LSU 構建系統進化樹為依據，并結合形態學特征，將擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis進一步分為新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsis、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis以及假擬盤多毛孢屬Pseudopestalotiopsis[18]。

Jeewon 等[19-20]指出，新擬盤多毛孢屬真菌的形態學和分子生物學特征具有對應關系，將兩者相結合進行鑒定，結果更為準確，尤其是多基因序列聯合分析能夠更為科學地對新擬盤多毛孢屬真菌進行鑒定，聯合ITS、tef1和β-tubulin進行串聯系統發育分析能夠較好地區分擬盤多毛孢的模式種，是目前較為準確的鑒定方式[21-22]。有學者基于形態學觀察，并通過聯合rDNA-ITS、β-tubulin、tef1進行多基因分析，將引起廣東地區女貞葉斑病病原確定為棒狀新擬盤多毛孢N.clavispora[23]；也有學者聯合rDNA-ITS、核糖體大亞基（LSU）將引起福建地區南方紅豆杉葉斑病的病原確定為N.clavispora[24]。本研究分離得到曼地亞紅豆杉枝枯病病原代表菌株LA-02，經形態學、致病性測定和rDNA-ITS、βtubulin、tef1基因聯合分析，鑒定其為棒狀新擬盤多毛孢N.clavispora。

通過對供試菌株進行室內毒力測定可以看出，多種供試藥劑對LA-02 菌絲生長具有很好的抑制效果，其中50%多菌靈WP 和250 g/L 吡唑醚菌酯EC 對菌絲生長有較強的抑制作用。多菌靈為高效低毒內吸性殺菌劑，對許多植物真菌病害都有良好防效，且對土壤微生物影響小[25]。李青杰 等[26-27]研究發現吡唑醚菌酯對N.clavispora抑制效果最好，具有較高的抑菌活性，可深入進行田間防治試驗。溫浩 等[28]發現咪鮮胺、戊唑醇等藥劑對新擬盤多毛孢病菌均有一定抑制作用。因此，咪鮮胺、戊唑醇等可作為備選藥劑以應對N.clavispora的抗性發展。

供試殺菌劑的EC50僅作為室內毒力參考，不能直接應用于林間，實際應用中會受到多種環境因素的影響，因此本研究的結果還需進行林間防治試驗加以驗證，明確其發病規律和發生原因，綜合分析誘發因素，以更準確地指導曼地亞紅豆杉枝枯病的科學防治。