貴州引進6個柑橘品種的有機酸組分和含量差異

李文云, 林 乾, 王小柯, 羅 懌, 李金強

(貴州省果樹科學研究所, 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】柑橘果實酸甜可口、風味濃郁、馥郁芳香,其中有機酸在感官品質中發揮重要作用,是評價果實營養和感官特性的重要指標。有機酸不僅參與光合作用、呼吸作用,還參與酯類、氨基酸、酚類和芳香類物質的代謝[1],影響果實貯藏性和貨架期,被廣泛應用于食品、制藥和生物材料行業[2-3]。柑橘新品種引進是品種結構調整和優勢區域布局的重要環節,而品質分析和評價是新品種引進和生態適應性評價的重要內容。因此,測定分析明確引進柑橘品種的品質特征,對引進地推廣應用具有重要的指導作用?！厩叭搜芯窟M展】果實有機酸組成和含量除受遺傳因素影響外,還受溫度、水分、光照強度環境條件和栽培技術等多個內在和外在因素的影響,使不同品種間有機酸含量和組成存在差異。姚改芳等[4]利用高效液相色譜法(HPLC)檢測98個梨種質資源果實有機酸含量表明,在西洋梨中,63.16%的品種是檸檬酸優勢型;在秋子梨中,94.74%的品種屬于蘋果酸優勢型;在白梨、砂梨和新疆梨中,20.00%～22.22%的品種屬于檸檬酸優勢型。趙愛玲等[5]以219份棗種質脆熟期果實為試材,采用HPLC對7種有機酸進行分析表明,90.41%種質為蘋果酸優勢型,9.58%種質為奎寧酸優勢型。此外,檸檬果實不同組織間也存在較大差異,如果肉和囊衣以積累檸檬酸為主,而黃皮層和白皮層以奎寧酸為主[6]。因此,受品種、環境條件和栽培技術等影響,不同產區果實有機酸含量和組成存在較大差異?！狙芯壳腥朦c】沃柑、大雅、紐荷爾、春見、晚熟8號血橙和瀨戶見為貴州省果樹科學研究所引進種植的6個柑橘新品種,目前尚求購未見該6個引進品種的品質分析和評價相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS)法,對上述6個柑橘品種成熟果實進行有機酸檢測,分析品種間有機酸組成和含量差異,為引進種植的柑橘品質評價提供基礎數據,并為貴州省柑橘品種結構調整提供決策參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 柑橘品種 6個柑橘品種分別為沃柑(WG)、大雅(DY)、紐荷爾(NHE)、春見(CJ)、晚熟8號血橙(XC)和瀨戶見(LHJ),貴州省果樹科學研究所于2017年定植于德江縣龍泉鄉,砧木為香橙,栽培管理條件一致。在果實商品成熟期,選擇長勢良好、無病蟲的植株3株,在樹冠外圍不同方位隨機采摘健康、無病蟲的果實帶回實驗室,用蒸餾水將果面清洗干凈,擦拭果面水分,將果實隨機分成3組,設置3次生物學重復,分離果肉迅速用液氮速凍,置于—80 ℃超低溫冰箱保存待測。紐荷爾和晚熟8號血橙分別于2020年11月和2021年4月采樣,其他品種均于2021年2月采樣。

1.1.2 試劑與儀器 試劑:甲醇和甲酸(Thermo Fisher)均為分析純,共16種標準品,反丁烯二酸和泛酸購于國藥集團,蘋果酸、順丁烯二酸、檸檬酸、丙二酸、戊二酸、琥珀酸、3-羥基-3-甲基戊二酸購于TCI[梯希愛(上海)化成工業發展有限公司],葡萄糖醛酸購于沃凱生物科技有限公司,酒石酸購于上海羽朵生物科技有限公司,L-焦谷氨酸購于阿拉丁試劑有限公司,乙基丙二酸、苯丙酮酸和辛二酸購于上海源葉生物科技有限公司,DL-3-苯基乳酸購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

儀器:Waters UPLC液相儀(Waters ACQUITY UPLC,沃特世科技有限公司)配置AB 4000三重四極桿質譜儀(AB 4000),渦旋儀(QILINBEIER QL866,其林貝爾儀器制造有限公司),冷凍離心機(湘儀,H1850R,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 有機酸提取及檢測

準確稱取50mg果肉樣品置于2 mL離心管中,向離心管中加入0.5 mL 30%甲醇水溶液(含0.1%甲酸),加入100 mg玻璃珠,55 Hz研磨1 min,重復2次; 12 000 r/min 、4 ℃離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜于上樣瓶中[7]進行有機酸檢測。

檢測色譜條件:色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm,5 μm,Agilent公司),進樣量5 μL,柱溫40 ℃,流動相A-水(含0.1%甲酸),B-甲醇水(含0.1%甲酸)。梯度洗脫條件:0～3 min,30% B;3～5 min,30%～50% B;5～7 min,50%～90% B;7～9 min,90% B;9～13 min,30% B。流速0.4 mL/min。質譜條件:電噴霧電離(ESI)源,負離子電離模式。離子源溫度500 ℃,離子源電壓4 500 V,碰撞氣6 psi,氣簾氣30 psi,霧化氣和輔助氣均為50 psi。采用多重反應監測(MRM)進行掃描[8-9]。

1.3 數據分析

根據標準品出峰時間和標準曲線分別對有機酸進行定性和定量分析。利用 Microsoft Office Excel(Microsoft,Seattle,WA)進行數據統計和作圖,利用SPSS進行差異顯著性分析。對揮發性物質進行歸一化處理后,利用R軟件繪制PCA(Principal Components Analysis,主成分分析)圖和熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同柑橘品種的有機酸組分及含量

從圖1看出,6個柑橘品種中共檢測出16種有機酸,其中,檸檬酸含量最高,為1 222.16～1 273.97 μg/g,平均1 240.62 μg/g,相對含量50.77%(WG)～62.53%(XC);其次是蘋果酸,為425.00～670.20 μg/g,平均551.90 μg/g,相對含量21.04%(XC)～27.69%(WG);再次是泛酸,為310.55～551.08 μg/g,平均465.63 μg/g,相對含量15.38%(XC)～22.38%(LHJ)。其他13種有機酸平均含量低于15 μg/g,排序依次為琥珀酸(12.46 μg/g)>葡萄糖醛酸(3.55 μg/g)>順丁烯二酸(2.89 μg/g)>反丁烯二酸(2.33 μg/g)>丙二酸(2.13 μg/g)>酒石酸(1.69 μg/g)>L-焦谷氨酸(1.19 μg/g)>3-羥基-3-甲基谷氨酸(0.83 μg/g)>辛二酸(0.27 μg/g)>苯丙酮酸(0.17 μg/g)>乙基丙二酸(0.12 μg/g)>DL-3-苯基乳酸(0.04 μg/g)>戊二酸(0.03 μg/g);相對含量均不足1%。

圖1 不同柑橘品種的有機酸含量、相對含量和平均含量

6個柑橘品種的總有機酸含量為2 501.88～2 019.71 μg/g,以NHE最高,XC最低,兩者相差482.17 μg/g。各品種總有機酸含量排序依次為NHE(2 501.88 μg/g)>WG(2 420.56 μg/g)>CJ(2 338.11 μg/g)>LHJ(2 226.73 μg/g)>DY(2 206.2 μg/g)>XC(2 019.71 μg/g)。

2.2 不同柑橘品種有機酸組成差異

從圖2看出,6個柑橘品種中有機酸含量存在顯著差異。檸檬酸含量以NHE最高,達1 273.97 μg/g,顯著高于其他品種,其余依次是XC、WG和DY,三者間差異不顯著;CJ和LHJ含量顯著低于以上4個品種。蘋果酸含量依次為WG>NHE>CJ>DY>LHJ>XC,含量最高的WG(670.20 μg/g)是最低XC(425.00 μg/g)的1.58倍,除DY與LHJ間差異不顯著外,各品種間差異均達顯著水平。泛酸含量依次為NHE>CJ>LHJ>WG>DY>XC,NHE顯著高于其余5個品種,CJ與LHJ間差異不顯著,均顯著高于WG、DY和XC,WG、DY和XC間差異均達顯著水平。除檸檬酸、蘋果酸和泛酸外的其余13種有機酸中在6個品種間含量差異較大,DL-3-苯基乳酸在XC中未被檢測到,辛二酸在WG、DY、NHE、CJ和LHJ中未被檢測到,乙基丙二酸在DY、NHE、CJ和XC中未被檢測到;不同品種間戊二酸含量差異不顯著;琥珀酸含量WG最高,為21.93 μg/g,顯著高于其余品種,其次是LHJ,顯著高于NHE、XC、DY和CJ,NHE、XC、DY、CJ間差異均達顯著水平,含量最高的WG是最低CJ(5.23 μg/g)的4.19倍;順丁烯二酸和反丁烯二酸含量最高均為WG(4.38 μg/g和4.03 μg/g),均顯著高于其余品種,含量最低均為XC(1.79 μg/g和1.58 μg/g),與最高間分別相差2.45倍和2.55倍;葡萄糖醛酸在不同品種的含量順序為WG>XC>CJ>DY>LHJ>NHE,WG顯著高于其余品種,XC、CJ和DY顯著高于LHJ和NHE;丙二酸含量NHE(3.70 μg/g)顯著高于其余品種,DY最低(1.25 μg/g),差異顯著;酒石酸含量為WG>NHE>XC>CJ>LHJ>DY,WG和NHE均顯著高于其余品種;L-焦谷氨酸含量為CJ>DY>WG>LHJ>NHE>XC,各品種間差異達顯著水平;3-羥基-3-甲基谷氨酸含量WG最高,其次為NHE,均顯著高于其他品種;苯丙酮酸含量為WG>LHJ>DY>CJ>NHE>XC,各品種間差異顯著。

注:同一有機酸不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同柑橘品種有機酸主成分和熱圖分析

主成分圖(PCA)用于分析有機酸間含量與品種間關系,實現種質類別的預測,以及檢測樣品間的重復性優劣。從圖3看出,不同品種3個生物學重復均聚類在一起,表明樣品重復性較好,數據可靠。6個品種明顯分為6組,表明6個樣品有機酸存在差異。主成分1(PC1)和主成分2(PC1)可以解釋68.9%的方差,其中,主成分1(PC1)解釋44.6%的方差,主成分2(PC1)解釋24.3%的方差。聚類熱圖(圖4)更直觀地將檢測到的16種有機酸表達豐度呈現出來,也進一步說明6個品種有機酸存在明顯差異。

圖3 主成分分析不同柑橘品種有機酸

注:紅色表示相對豐度高,藍色表示相對豐度低。

3 討論

有機酸是糖酵解、三羧酸循環和糖異生等代謝活動的重要底物,是果實品質形成的物質和能量基礎,是評價果實風味、口感、成熟度和耐貯性的重要品質指標[10],對消費者的購買偏好性具有決定性作用。

根據成熟果實有機酸積累特征,將果實分為檸檬酸積累型、蘋果酸積累型和酒石酸積累型[11]。大部分園藝作物為檸檬酸積累型和蘋果酸積累型,少部分為酒石酸積累型,如柑橘[12-13]、果梅[14]、菠蘿[15]等以積累檸檬酸為主,屬于檸檬酸積累型;桃[16]、蘋果[17]、歐李[18]等以積累蘋果酸為主,屬于蘋果酸積累型;葡萄[19]是酒石酸積累型的典型代表。然而同一類型不同品種間有機酸含量和組成也存在較大的差異,如大部分梨以積累蘋果酸為主[20]。李甲明等[21]研究表明,鴨梨×京白梨雜交后代高酸個體(GS-Y14)為蘋果酸積累型,低酸個體(DS-Y182)為檸檬酸積累型。張微等[22]在分析普通型和大果型蘋果梨不同發育時期果實有機酸組分時也表明,蘋果梨按有機酸積累類型可分為檸檬酸型和蘋果酸型。研究表明,紐荷爾、沃柑等6個柑橘品種成熟果實均以檸檬酸含量最高,屬于檸檬酸積累型,即檸檬酸是6個柑橘品種的特征有機酸,是酸度品質的重要貢獻者。雖然6個品種檸檬酸平均含量達1 240.62 μg/g;而蘋果酸和泛酸的平均含量分別為551.90 μg/g和465.63 μg/g,品種間均達到顯著差異。除以上3種主要有機酸外,其他13種平均含量均較低,均在15 μg/g以下,對酸度品質的貢獻較小。因此,總有機酸的差異主要由蘋果酸和泛酸含量引起。

在大多數果實中,有機酸在果實發育前期逐漸升高,臨近成熟時降低[23-24]。果實有機酸代謝是個復雜的過程,除受環境條件和栽培技術影響外,還受到自身復雜的代謝網絡調控。其中,自身復雜的代謝網絡調控是影響有機酸積累的根本因素。大部分果實以積累1～2種有機酸為主,其他有機酸含量較低。參與這些主要有機酸代謝可能與(Citrate Synthase,CS)、順烏頭酸酶(Aconitase,ACO)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPC)、磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPCK)等結構基因存在密切聯系,還可能受到各類調節基因單獨或協同調控[25-27]。品種間有機酸的積累差異可能是以上一種或多種因素綜合調控的結果。

4 結論

貴州引進紐荷爾、沃柑等6個柑橘品種共檢測出16種有機酸,分別為檸檬酸、蘋果酸、泛酸、琥珀酸、葡萄糖醛酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、丙二酸、酒石酸、L-焦谷氨酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、辛二酸、苯丙酮酸、乙基丙二酸、DL-3-苯基乳酸和戊二酸,其中,檸檬酸相對含量最高,平均為1 240.62 μg/g,占總有機酸含量的50%以上,是酸度品質的重要貢獻者;其次是蘋果酸和泛酸,兩者平均含量分別為551.90 μg/g和465.63 μg/g,且6個品種間均達顯著差異,其他13種有機酸平均含量低于15 μg/g,相對含量均不足1%。6個柑橘品種總有機酸含量表現為紐荷爾(2 501.88 μg/g)>沃柑(2 420.56 μg/g)>春見(2 338.11 μg/g)>瀨戶見(2 226.73 μg/g)>大雅(2 206.2 μg/g)>晚熟8號血橙(2 019.71 μg/g),其中,蘋果酸含量依次為沃柑>紐荷爾>春見>大雅>瀨戶見>血橙,泛酸含量依次為紐荷爾>春見>瀨戶見>沃柑>大雅>血橙。檸檬酸、蘋果酸和泛酸為主要有機酸,三者相對總量占有機酸總量的87.19%,6個品種總有機酸的差異主要由蘋果酸和泛酸含量引起。