基于簡化基因組測序揭示水角的瀕危機制

吳欣儀 王蒙 鄭希龍 張銳 何松 嚴岳鴻

摘要：物種的遺傳多樣性是決定物種適應性和生存能力的關鍵因素。生境片段化是造成生物多樣性喪失的重要因素之一，對植物種群的遺傳多樣性有著重要影響。水角（Hydrocera triflora）作為一種瀕危植物，其遺傳多樣性狀況和瀕危機制尚未有報道。該文收集了水角7個種群共計34個樣本，利用簡化基因組測序技術（RAD-seq）獲得了單核苷酸變異位點（SNP）。通過種群遺傳多樣性和遺傳結構的分析，并結合種群歷史動態分析和不同氣候情景下物種潛在分布區預測，探討了水角的瀕危機制。結果表明：（1）水角遺傳多樣性較低（Ho=0.156 9、He=0.165 4、π=0.186 5），遺傳分化系數較高；AMOVA分析表明，遺傳變異主要發生在種群內。（2）Mantel檢測表明環境距離與遺傳距離、地理距離均呈顯著正相關，分別為P=0.041 2和P=0.008 2。（3）水角的有效種群大小從全新世中期開始持續下降，與瓊北火山群的噴發時間一致。（4）與當代氣候相比，雖然在未來氣候變化下水角的潛在分布區總面積變動不大，但在高CO2排放的情景下，大量的高適生區將會喪失并轉化為低適生區，特別是位于馬來群島的適生區幾乎完全消失。該研究結果表明，生境片段化導致了水角較低的遺傳多樣性和有效種群大小的持續下降。因此，自身更新能力低以及人為活動干擾、城市化等不利的環境條件是導致其瀕危的主要原因。建議加強對水角的就地保護，采用人工授粉等方法提高其基因流以增加其種群的遺傳多樣性，同時，要著重保護濕地免遭破壞。

關鍵詞： 生境片段化， 簡化基因組測序， 遺傳多樣性， 遺傳結構， 物種分布模型， 種群歷史動態

中圖分類號：Q943? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1000-3142（2023）08-1414-14

RAD-seq revealed the endangered mechanism of Hydrocera triflora （Balsaminaceae）

WU Xinyi1， WANG Meng1， ZHENG Xilong2， ZHANG Rui3， HE Song4， YAN Yuehong1*

（ 1. Orchid Conservation & Research Center of Shenzhen / National Orchid Conservation Center of China， Shenzhen Key Laboratory for Orchid Conservation and Utilization， Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration for Orchid Conservation and Utilization， Shenzhen 518114， Guangdong， China; 2. School of Traditional Chinese Medicine Resources， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Shanghai Chenshan Plant Science Research Center， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201602， China; 4. Haikou Wetland Protection and Management Center， Haikou 570135， China ）

Abstract：The genetic diversity of species is a key factor in their adaptability and survival capability. Habitat fragmentation is recognized as one of the key factors causing biodiversity loss， and it has significant impacts on the genetic diversity of plant populations. Hydrocera triflora is an endangered species. Its genetic diversity is unclear and endangered mechanism has not been reported. In this study， 34 samples of H. triflora from seven populations were used to obtain single-nucleotide polymorphisms （SNP） by Restriction-site Associated DNA sequencing （RAD-seq）. We discussed the endangered mechanisms of H. triflora by analyzing population genetic diversity and structure. Additionally， we combined these results with historical population dynamics analysis and predictions of potential species distribution in different climate scenarios. The results were as follows： （1） H. triflora had low genetic diversity （Ho=0.156 9， He=0.165 4， π=0.186 5） and high genetic differentiation coefficient; AMOVA analysis showed that genetic variation mainly occurred within populations. （2） The Mantel test indicated that there was a significant positive correlation between environmental distance and genetic distance， as well as geographical distance， with respective P-values of 0.041 2 and 0.008 2. （3） The effective population size of H. triflora had been continuously declining since the mid-Holocene.（4） The total potential distribution area of H. triflora change slightly in the future compared to that in the modern climate. However， in scenarios of high CO2 emissions， the high suitable area decreased significantly and changed into low suitable area， especially in the Malay Islands where the suitable habitat was almost to extinction. The results indicate that habitat fragmentation caused a sustaineddecrease in the genetic diversity and effective population size of H. triflora. Therefore， the low self-renewal capacity， as well as detrimental environmental conditions such as human disturbance and urbanization， are the primary factors contributing to its endangered state. It is recommended to strengthen the in-situ protection of H. triflora， employing techniques such as artificial pollination to enhance gene flow among populations and thereby increase genetic diversity， and at the same time， we should focus on protecting wetlands from destruction.

Key words： habitat fragmentation， Restriction-site Associated DNA sequencing （RAD-seq）， genetic diversity， genetic structure， species distribution models， demographic history

保護基因組學（conservation genomics）廣義上是指將基因組技術和方法應用于保護生物多樣性和物種保護工作中的一門學科（Allendorf et al.， 2010），主要聚焦于物種的瀕危機制與保護策略研究。評估物種的遺傳多樣性水平及其在個體和群體中的分布格局是對該物種保護遺傳研究的重要內容（Hamrick & Godt，1996）。分子遺傳標記是評價種質資源遺傳多樣性的重要工具，推動保護遺傳學的發展。雖然遺傳信息早已運用在瀕危物種的研究中，但是全基因組范圍的大量信息標記卻是最近20年才開始使用（Supple & Shapiro， 2018），最初也只是應用在少數的模式植物中。

高通量測序技術（high-throughput sequencing）的飛速發展催生了簡化基因組測序技術。簡化基因組測序（Restriction-site Associated DNA sequencing，RAD-seq）是一種常見的簡化基因組技術，通過測序限制性酶切位點附近的短片段，具有覆蓋度較高、測序成本低等優點。它不受參考基因組的限制，能獲得大量的高質量信息位點（single-nucleotide polymorphisms， SNP）（Davey et al.， 2011；Narum et al.， 2013）。目前，RAD-seq已廣泛應用于群體研究與分子育種等領域，包括分子標記開發、群體遺傳分析、遺傳圖譜構建和全基因組關聯分析等。孫維悅等（2022）通過簡化基因組測序對瀕危植物荷葉鐵線蕨（Adiantum nelumboides）的保護基因組學研究，揭示了其瀕危機制。Cai等（2021）對具有重要經濟價值的熱帶雨林樹種滇南風吹楠（Horsfieldia tetratepala）進行RAD-seq測序，制定了更有效的保護策略。曹毓蓉等（2022）利用RAD-seq對極危物種波葉杜鵑（Rhododendron hemsleyanum）的遺傳特征進行無參考基因組分析，證明對于無參考基因組的極小種群野生植物（plant species with extremely small populations， PSESP）也可用簡化基因組測序手段獲取SNP分子標記。因此，相信針對無參考基因組的瀕危物種，簡化基因組測序可以獲得充足的遺傳信息，為保護基因組學研究提供有效工具。此外，有效種群大小的估計對于保護和管理瀕危物種、了解種群動態以及預測遺傳演化的方向和速度非常重要。種群歷史動態是保護基因組學的重要研究內容（Girod et al.， 2011）。在種群的演化過程中，氣候變化和地質事件作為重要的外部作用力對種群的動態變化起著關鍵作用。

除了物種的自身特征、氣候歷史等因素影響遺傳多樣性以外，生境片段化也是造成生物多樣性喪失的重要因素之一（Wilcove et al.，1998）。生境片段化不僅會導致遺傳多樣性降低、近交自交衰退、基因流減少和種群規模減小等（Young et al.， 1996；陳小勇，2000；Honnay & Jacquemyn， 2007），還會造成物種棲息地減少，影響傳粉者數量，降低傳粉率和繁殖成功率，從而影響物種的多樣性（Aguilar et al.， 2006；González-Varo et al.， 2009）。生境片段化是指原先連續的生境被分割成不同規模和形狀的片段而形成的新的生境格局（Wilcove & Mclellan， 1986）。目前，大部分的研究表明生境片段化對遺傳多樣性產生的負效應多于正效應（武晶和劉志民，2014）。在以專性傳粉的石竹（Dianthus deltoides）研究中，發現片段化生境的石竹其種子結實率低并可能產生自交種子而進一步降低其種群的遺傳多樣性（Jennersten， 1988）。瀕危植物Bankia goodii受生境片段化影響，其路邊的物種個體繁殖力降低（Lamont et al.， 1993）。因此，當瀕危物種遭受生境片段化影響時，應進一步加強研究，以更好地理解生境片段化如何影響植物遺傳多樣性，揭示其瀕危機制并提出有效的保護策略。

水角（Hydrocera triflora）系鳳仙花科（Balsaminaceae）水角屬（Hydrocera）多年生水生草本植物，產自中國（海南）、印度、斯里蘭卡、泰國、越南、老撾、柬埔寨、馬來西亞及印度尼西亞。喜生于湖邊、沼澤濕地或水稻田中。對海南省水角資源現狀的調查發現，隨著農村旅游的開發建設，水體被改造，濕地被大量開發利用，水角生境受到不同程度的破壞，該種分布范圍越來越狹窄，十分罕見（王景飛等，2017）。在《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷（2020）》評估報告中，水角處于瀕危（EN）等級。有關水角的相關研究較少，2014年中國科學院昆明植物研究所在?？诘貐^重新發現了該種植物，這是30多年來該物種在國內再次被發現。水角屬和鳳仙花屬（Impatiens）的花發育揭示了鳳仙花科最早期分化譜系的進化趨勢，花序從簡單的軸生花序漸進轉變成更復雜的腋生花序以及花被片的分化是一個漸進的過程（Janssens et al.， 2012）。水角屬作為鳳仙花科的單種屬，研究其遺傳多樣性不僅可以評估生境片段化對遺傳多樣性的影響，同時也為鳳仙花科的進化和系統分類提供基礎數據。

本研究以來自?？诘貐^7個種群的34個水角個體為實驗材料，通過RAD-seq簡化基因組測序技術，進行群體遺傳分析，以探明以下內容：（1）基因組水平下水角的遺傳多樣性和遺傳結構；（2）水角有效種群大小的歷史變化；（3）不同氣候情景下水角的潛在分布區變化。以期為水角種質資源的保護利用、育種策略的實施提供理論依據。

1材料與方法

1.1 實驗材料

對分布在?？谑械乃沁M行野外采集（圖1），共收集到7個種群合計34個樣本。每個種群均有一份憑證標本，存放于深圳市蘭科植物保護研究中心標本館（CNOCC）。每個種群具體信息見表1。

1.2 DNA提取和RAD文庫構建

本研究利用天根植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）進行適當改良后對所有樣品的基因組DNA進行提取。通過瓊脂糖凝膠電泳和Qubit濃度檢測后，送至上海元莘生物醫藥科技有限公司測序。采用EcoR I限制性內切酶進行酶切后構建長度范圍在300～500 bp的雙端測序文庫。純化后的文庫在Illumina Novoseq 6000測序平臺完成該物種簡化基因組測序。

1.3 獲取單核苷酸多態性（SNP）

在測序數據下機后，利用FastQC軟件進行質控，包括去除接頭、poly_A和低質量的數據，最后得到高質量的數據（clean data），用于后續的分析。本研究利用Stacks v2.54軟件（Catchen et al.， 2013）對水角的RAD-seq數據進行無參De Novo組裝和變異檢測。分別運行Stacks軟件內的process_radtags對樣本進行過濾，除去不含RAD標簽的序列。使用ustacks對每個樣本建立位點，設置控制錯配數的參數M為3，每個等位基因所需的最小片段數m為3；運行cstacks程序構建包含所有位點信息的catalog目錄文件，設置位點間允許的錯配數n為3；運行sstacks程序把每個樣本比對到創建的目錄上；通過tsv2bam、gstacks以及population程序得到包含75 209個SNPs位點的vcf文件。為保證下游分析的可靠性，使用VCFtools v0.1.13軟件（Danecek et al.， 2011）對Stacks軟件中檢測出的SNPs進一步過濾。設置--max-missing 0.9，即最大缺失率為90%；--maf 0.05，將最小等位基因頻率設置為0.05；--minDP 5，確?；蛐妥钚∩疃葹?。過濾后剩下高質量的38 667個SNPs用于后續群體遺傳結構的分析。

1.4 群體結構分析

基于34個水角樣品的SNPs位點，運行vcf2phylip腳本構建個體間的遺傳距離矩陣，利用IQ_TREE v1.6.9軟件（Nguyen et al.， 2015）使用最大似然法（maximum likelihood， ML）進行系統樹的構建。根據1 000次重復的快速自展（ultrafast bootstrap， UFBoot）（Minh et al.， 2013）和SH-aLRT（Guindon et al.， 2010）測試進化枝，得到最終的系統發育樹。利用FigTree v1.4.3軟件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/gtree/）可視化和編輯生成的樹文件。

將之前獲得的高質量的SNP數據集使用VCFtools軟件轉換成ped和map文件后進行過濾生成bed文件，用Admixture（Alexander et al.， 2009）基于每個個體的基因型推斷個體祖先成分，模擬在亞群數K值為2到7情況下的分群情況，根據不同K值模擬下的最小交叉驗證（cross validation， CV）獲得最佳分群數。

使用GCTA v1.26.0軟件（https：//yanglab.westlake.edu.cn/software/gcta/）生成用于PCA分析的矩陣，用R語言中的ggplot2軟件包繪制主成分分析的結果圖。

1.5 群體遺傳多樣性分析

通過Stacks軟件中的Populations子程序計算物種水平的近交系數（inbreeding coefficient，FIS），觀察雜合度（observed heterozygosity， Ho），期望雜合度（expected heterozygosity， He）。同時基于所有（變異和非變異）位點計算核苷酸多態性（nucleotide diversity， π）等遺傳參數。再用R語言的GroupGenome v2.6.1程序包（Pfeifer et al.， 2014）計算種群間遺傳分化系數（genetic differentiation among populations， FST），衡量群體間遺傳分化水平。

1.6 Mantel相關性檢驗和分子方差分析

為了評估7個水角種群的遺傳距離、地理距離以及環境距離之間的相關性，利用R軟件中的“raster”和“rgdal”提取每個種群點的氣候信息，構建19個環境因子的環境距離矩陣，用“geosphere”構建地理距離的矩陣，利用“ape”讀取遺傳距離矩陣，用“ade4”對兩兩矩陣進行9 999次的Mantel重復檢驗，利用“ggplot”進行Mantel檢驗結果的繪圖。此外，利用Arlequin 3.5軟件（Excoffier & Lischer， 2010）進行分子方差分析（analysis of molecular variance， AMOVA）。AMOVA 基于進化距離（evolutionary distance）來度量并計算單倍型（含等位基因）或基因型間的方差（δ2），計算組間遺傳分化系數（genetic differentiation among groups， FCT），推斷群體不同遺傳組分之間的變異水平。

1.7 種群歷史動態分析

基于SMC模擬種群歷史動態的方法是高度依賴于完整基因組上的重組圖譜，并不適用于無參考基因組的物種（Li & Durbin， 2011）。而基于點位頻譜（site frequency spectum，SFS）的方法不依賴于位點之間的連鎖或連續性（Gutenkunst et al.， 2009），并且對近期的種群歷史大小變化有較高的分辨率（Liu & Fu， 2015; Lapierre et al.， 2017）。因此，將所獲得的SNP數據使用基于SFS的Stairway Plot v2（Liu & Fu， 2020）推測水角在100 kya～1 kya（thousand years ago）間的Ne變化。生成無缺失且無連鎖不平衡（linkage disequilibrium， LD）的SNP數據集，將VCF文件用python腳本easySFS（https：//github.com/isaacovercast/easySFS）建立一維（one-dimensional， 1D）SFS。將SFS狀態指定為folded，以統計次等位基因的SFS。選擇使位點數盡量多的projection值輸出SFS信息，將SFS信息輸入Stairway Plot v2運行所需的blueprint文件中。突變率設置為1.0×10-8，2年為一代，200次自展檢驗用于計算Ne中位數及95%置信區間。結果在R語言中可視化。

1.8 潛在分布區預測

根據材料采集，分布點通過GPS實地定位以及中國數字植物標本館（http：//www.cvh.org.cn/）和全球生物多樣性信息網絡（https：//www.gbif.org/）等相關數據庫獲取標本采集地經緯度信息，共收集到東南亞水角坐標信息200余個。對所有數據按照MaxEnt模型（http：//biodiversity informatics.amnh.org/open_source/maxent）要求進行標準化處理， 并且為了防止在進行最大熵模型分析時出現過擬合現象，將水角的分布數據進行篩選，在50 km2內的分布點僅保留1個，共計得到29個具有經緯度信息的水角分布點并整理生成CSV文件。

從全球氣候數據庫WorldClim 2.1（http：//www.worldclim.org）分別下載全新世中期（mid-Holocene， MID; 約6 000年前）、當代（1970—2000年）和未來（2081—2100年）的19個生物氣候變量，數據空間分辨率為2.5 min（5 k分辨率）。未來氣候情景選擇CMIP6中SSP1-2.6和SSP5-8.5（shared socioeconomic pathway，SSP）的兩組數據，分別表示年平均溫度上升1.4～1.8 ℃和4.4～4.8 ℃。

運行MaxEnt軟件模擬水角在不同氣候情景下的潛在分布格局，設置訓練集為75%，測試集為25%進行模擬分析。將物種分布數據與氣候環境數據一起導入MaxEnt中，選擇刀切法（Jackknife）模型迭代500次，計算各環境變量對物種分布格局的貢獻率，繪制響應曲線并制作預測圖。加載到ArcGIS 10.2中，提取東南亞區域，根據生境適宜度指數（habitat suitability index， HSI），劃分為四個等級。其中，HSI≤0.1為非適生區；0.1<HSI≤0.3為低適生區；0.3<HSI≤0.5中適生區；HSI>0.5為高適生區。采用ROC曲線評價預測模型的準確性，同時根據氣候因子的貢獻率判斷影響物種分布的主導環境因子。

2結果與分析

2.1 測序數據概況

本研究利用RAD簡化基因組技術對34個水角樣本進行測序，測序結果以FASTQ（簡稱fq）格式儲存，包含了測序的序列信息和其對應的測序質量信息。經過質量評估和過濾后，共獲得37.91 Gb的clean data數據，平均每個樣本為1.12 Gb。每個樣本的reads讀長在2 512 919到55 093 740，其中GC含量均值為36.2%，所有樣本的Q30均值為92.9%，表明測序質量較高，達到后續分析的要求。使用Stacks進行無參考基因組分析后，得到水角34個樣本的平均位點數為68 226，平均片段覆蓋深度為8.61 X。經過VCFtools再次過濾后，最終獲得38 667個高密度的SNP位點。

2.2 群體遺傳結果分析

進行Structure分析發現，當K=3時，CV值最?。▓D2：A），說明34個個體可分為3個遺傳聚類（圖2：B）。利用最大似然法（ML）基于38 667個SNPs位點對34個樣本構建的系統進化樹表明（圖2：C），每個種群的個體都能聚在同一個遺傳分支上，并具有100%的支持率。昌旺溪（CWC）、卜茂村（BMC）、東興村（DXC）的遺傳結構更相似為一組（Cluster 1）；卜壁村（BBC）、卜史村（BSC）、文選村2（WXC2）的遺傳結構顯示出更近的親緣關系，傾向于另一組（Cluster 2）；文選村1（WXC1）表現出與其他種群不一樣的遺傳結構，為Cluster 3。主成分分析（PCA）是根據群體的原始數據矩陣計算出單個個體的特征向量，再繪制特征向量的散點圖來獲得群體分類情況。34個樣品基于主成分1和主成分2繪制PCA圖（圖3）?？梢?，每個種群都分布得很集中，這與系統樹結果一致。其中DXC、CWC、BMC、BBC和WXC2分布相對集中。在PC2維度上，WXC1與其他種群相隔得較遠，這與structure分析的結果一致。

2.3 群體遺傳多樣性分析

對7個種群的遺傳多樣性信息進行的統計分析表明（表2），34份材料的平均Ho、He和π分別為0.156 9、0.165 4和0.186 5，各種群中均具有特有等位基因，平均值為828.29，其中BSC的特有等位基因最高（1 445），同時其Ho最低（0.079 1）。核苷酸多樣性（π）分析表明，π=0.015 02～0.239 9，在采樣地東部的Cluster 1種群（BMC、CWC和DXC）具有更高的遺傳多樣性。FIS =-0.006 1～0.168 3，種群內FIS平均值為0.061 67，其中CWC和WXC2略為負值，說明這兩個種群存在雜合子過?，F象。

基于38 667個SNPs位點的34個水角樣本種群間成對的FST值計算結果（表3）表明：FST為0.203 5～0.584 6，其中CWC與BMC之間的FST值最?。?.203 5），表明兩個種群間的遺傳交流在所有種群間最為頻繁。其他成對FST均大于0.25表明水角7個種群間的遺傳分化程度較高。其中，WXC1種群分化最大，與其他6個種群間的遺傳分化系數均值為0.528 1。

2.4 AMOVA分子方差分析和Mantel檢測

AMOVA分子方差分析的結果（表4）顯示，當把7個水角種群分成上述3個群組時， 9.35%的遺傳變異發生在組間，群組間的遺傳分化系數為FCT=0.093 53，說明群組間的遺傳分化不顯著。種群內的遺傳變異占總變異的52.65%，種群間的遺傳變異率為38%?；谶z傳距離和環境距離的Mantel檢測，結果表明兩者之間存在顯著正相關（R=0.434 6，P=0.041 2）（圖4：A）；基于遺傳距離和地理距離的Mantel檢測， 結果證明兩者之間不存在顯著的聯系（P=0.339 3）（圖4：B）；基于環境距離與地理距離的Mantel檢測結果表明環境距離與地理距離呈顯著正相關，意味兩者之間存在很強的聯系（R=0.643 2，P=0.008 2）（圖4：C）。

2.5 群體大小歷史分析

為在Stairway Plot中對水角的群體大小隨時間變化進行推測，首先篩選到不連鎖的SNP數量38 667個。Stairway Plot推測該種群100 kya～1 kya的有效群體大小變化（圖5）。由圖5可知，在11.7 kya的末次冰期（last glacial period， LGP）以后，種群有收縮趨勢。在MID時期，特別是在4 kya～2 kya，水角有效種群大小出現明顯的下降。

2.6 不同情景下的潛在分布格局

根據MaxEnt模型AUC值均大于0.952，表明該模型預測物種適宜分布區的結果比較可靠。在環境變量中，溫度季節性、最冷月份的最低溫度、年平均溫度和海拔所占貢獻率較大，表明它們是影響水角分布的主要環境因子。

結果表明從MID時期到當代 （圖6：A，B和表5），水角的總適生面積大幅度的減少，主要表現在高適生面積減少29%，中適生面積減少34%。未來在SSP1-2.6情景下（圖6：C和表5），水角的潛在分布總適生面積較當代增加了4.74%，主要表現在低適生面積較當代增加了33.40%。在SSP5-8.5情景下 （圖6：D和表5）， 水角的總適生面積變動不大，但是高適生面積大幅減少， 高適生面積較當代減少了23.34%，中適生面積較現在減少了4.91%，而低適生面積增加了72.94%。由此可見，在未來隨著CO2濃度的升高，全球平均溫度的升高，海平面的上升，生境破碎化嚴重，對水角的高適生區有很大的影響，大量的高適生區將會喪失或轉化為低適生區。

3討論與結論

3.1 水角的遺傳多樣性：生境片段化降低了水角的遺傳多樣性

自20世紀90年代以來，生境片段化問題在國內逐漸受到關注，一直是保護生物學和生態學領域的研究熱點之一。起初集中在熱帶雨林中開展（朱華等，2001；王喜龍等，2016），亞熱帶森林次之（李銘紅等，2008）。在不同生境類型中，島嶼的研究僅占2%（吳倩倩等，2017）。研究物種的遺傳多樣性，不但可以反映物種適應環境變化的潛力，而且還可以為物種資源特別是瀕危物種現有的生存方式及狀態進行有效的評估（Mable， 2019）。研究發現，由于遺傳漂變和近交的原因，地理分布廣泛的物種遺傳多樣性高于地理分布狹窄的稀有和瀕危物種（Cole， 2003），遺傳多樣性水平較低是一個物種瀕?；蚍植吉M窄的普遍特征（Gitzendanner & Soltis， 2000；景昭陽等，2023）。核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的整體指標（Catchen et al.， 2013b）。本研究利用SNP分子標記對水角7個種群進行群體遺傳學分析，結果顯示水角具有較低的遺傳多樣性（π=0.186 5，Ho=0.156 9，He=0.165 4）。在瀕危植物荷葉鐵線蕨的群體遺傳分析中也有類似的發現，其不同居群的平均π、Ho和He分別為0.373、0.106和0.135（孫維悅等，2022）。與木本植物相比，草本植物具有更低的遺傳多樣性（Chung et al.， 2020）。利用RAD-seq技術研究的極危樹種波葉杜鵑的遺傳多樣性為（π=0.241 0，He=0.226 7）（曹毓蓉等，2022）。與同科的物種相比，水角的平均He為0.165 4，略低于大旗瓣鳳仙花（Impatiens macrovexilla）的He（0.018 6）（Zhou et al.， 2020）。同時本研究結果發現，水角的平均Ho小于平均He，盡管結果在統計上不顯著，但這也暗示著水角種群中存在雜合子缺失和一定程度的近交，是生境片段化的遺傳效應的表現。Dixo等（2009）研究發現，巴西大西洋沿岸森林中蟾蜍（Rhinella ornata）種群遺傳多樣性與破碎化面積呈正相關，生境片段化對剩余棲息地之間的基因流也產生負面影響。生境片段化導致種群之間的遺傳流動受到限制，從而導致種群內部的近親交配增加，雜合子缺失的發生，進而降低其遺傳多樣性。

不同種群間的遺傳距離有助于對不同種群的遺傳多樣性進行研究， 也可用來表述群體遺傳結構差異。不同種群之間的群體遺傳多樣性可通過FST進行研究。當FST為0.25以上，表示種群間有很大的遺傳分化（Wright， 1978）。在水角7個種群兩兩之間的21對FST中有20個FST大于0.25，表明7個種群間的遺傳分化水平較高。AMOVA分析表明，水角38%的遺傳變異發生在組內群體間，而群體內的遺傳變異更高，為52.65%。當前并未見有對水角遺傳多樣性的研究，鳳仙花科僅僅包括水角屬和鳳仙花屬，這些植物在分類學上密切相關。因此，對鳳仙花科的研究結果可以為水角的遺傳多樣性研究提供一些初步的參考。鐘云芳等（2014）利用ISSR對鳳仙花科的研究中發現，海南鳳仙花（Impatiens hainanensis）自然種群的主要變異來自種群內（92%），種群間變異較少（8%），水角也有與之一致的結果，即種群內的遺傳變異較大。同時在對大旗瓣鳳仙花的研究中也發現，無論是利用ISSR分析（李祥軍，2013），還是使用基于“跳躍基因”或基于逆轉錄轉座子的引物間結合位點（inter-primer binding site， iPBS）標記系統來評估（Zhou et al.， 2020），其種群內的遺傳多樣性大于種群間的，即主要的遺傳多樣性存在于種群內，表明該種在收集種質的每個地點都有廣泛的基因型。在聚類分析、遺傳結構分析和PCA分析中，本研究收集到的海南水角群體可分為3個具有不同遺傳組分的組。盡管存在這些不同的遺傳組分，但其組間的遺傳分化較低（FCT=0.093 53）?？紤]到水角的生境特征以及人類建筑、農田等人為屏障的存在，我們推測亞居群的形成可能是生境隔離所致。

對水角的環境距離、遺傳距離和地理距離的Mantel相關性檢驗結果表明：水角環境距離與地理距離具有顯著的正相關（P=0.008 2），同時環境距離和遺傳距離也存在顯著的正相關（P=0.041 2），意味著水角種群之間的遺傳分化與它們之間的環境差異有關，并且這種環境差異與地理距離的變化密切相關。但是其地理距離與遺傳距離沒有顯著相關性（P=0.339 3），即水角種群的遺傳距離沒有隨著隔離距離的增加而增加。這與海南鳳仙花自然種群的遺傳距離和地理距離呈顯著的高度相關性（r=0.952，P<0.01）有差異（鐘云芳等，2014）。這可能是水角不同于廣泛的水生植物，其具有肉質假漿果，裸露于水面或沉入水中，可供鳥類或魚類等動物取食，因此其地理距離不能反映其種群的遺傳距離。也可能與水角的狹窄分布，不同種群間其地理距離過近有關?？傮w而言，水角種群遺傳分化水平高，遺傳距離與環境距離相關但與地理距離不相關，這說明水角種群間的遺傳分化主要受到生境片段化所引起的環境距離的影響，而不是地理距離的影響。

3.2 水角的群體歷史：萬年前瓊北火山群爆發后水角種群大小急劇衰退

物種的種群歷史動態是其所經歷的歷史事件和遺傳特性共同作用的結果（Hewitt， 2000），能預測物種當前和未來的生存力（Hare et al.， 2011）。本研究通過使用大量的SNP標記對水角進行群體大小歷史分析，發現水角在100 kya到末次冰期之前，有效種群大小都相對穩定，我們推測這與全新世早期，全球性氣候轉溫，海南島植物區系較為興盛發達有關（顏家安，2006）。水角的有效種群大小從末次冰期（LGP：11.2 kya）后開始持續下降，直至現在。瓊北火山群的噴發活動可能發生在距今約1萬年（樊祺誠等，2004），這與水角有效種群大小開始下降時間吻合，推測瓊北火山群的噴發活動可能引起土地破壞、氣候變化或其他環境因素的改變，導致水角生境的片段化，限制了水角的基因交流。在MID時期，水角有效種群大小在明顯下降。MID是一個全球范圍內人類活動擴張的重要時期。在這個時期，人類社會經歷了從狩獵采集生活方式向農業和定居生活的轉變，這對環境演化也產生了重要影響。在新石器中晚期，有1萬余人覓食于海南島，與植物爭地，植物生境也逐漸發生較大的變化（司徒尚紀，1987）。蔣有緒等（2002）對海南島北部火山口沉積孢粉的研究，發現海南島的農業活動早在3 000 aBP就開始對地低植物具有較明顯的影響。由此推測，水角的有效種群大小在歷史時期首先受到瓊北火山群爆發的影響，進而又受到人類活動的影響，兩種因素疊加導致生境的持續變化。這種有效種群大小的減少可能導致了其遺傳多樣性的喪失和種群的遺傳分化，逐漸形成如今的分布格局。

3.3 水角的潛在分布格局：高CO2排放情境下水角的高適生區轉變為低適生區

在環境因子貢獻率的分析中，本研究分析所得，溫度季節性、最冷月份的最低溫度和年平均溫度的總貢獻率占比達67.6%，這與水角喜溫怕寒，溫度低于15 ℃即停止生長的生活習性相符（王景飛等，2017）。而海拔占了第四高的貢獻率7.4%，表明它是影響水角分布的主要環境因子之一，也佐證了在海南鳳仙花的研究中低海拔的遺傳多樣性遠遠高于高海拔梯度的種群這一結果，說明海拔是影響群體基因流的重要因素（鐘云芳等，2014）。

對不同氣候情景下東南亞地區的水角的潛在分布適生區進行模擬分析，結果表明從MID時期到當代，水角的總適生面積大幅度的減少，其中位于海南島的適生區由高適生區和中適生區的分布格局轉變為當代的以低適生區為主的分布格局。這與種群歷史動態分析結果一致，表明從MID時期開始，水角的生存受到威脅直至現在。與當代氣候相比，在未來氣候變化下水角的潛在分布區總面積變動不大，但低適生面積較當代增加了33.40%。特別是在SSP5-8.5的氣候環境情景下，高適生面積較現在減少了23.34%，取而代之的是低適生面積增加了72.94%。其中，位于馬來群島的適生區幾乎完全消失。根據政府間氣候變化專門委員會（Intergovernmental Panel on Climate Change， IPCC）發表的《第六次評估報告》，在SSP5-8.5的氣候環境下，CO2排放量到2050年將增加一倍，到2100年全球平均氣溫將升高4.4 ℃。我們推測這可能與氣候變暖條件下亞熱帶北界向北推移有很大的關聯，未來CO2濃度升高將引起全球變暖，動植物的分布逐漸向高緯度和高海拔地區移動（Tingley， 2014），從而導致水角在馬來群島的適生區近乎消失。這些分析結果表明，未來的氣候變化將進一步影響水角的適生區，特別是高適生區將面臨喪失和轉變的風險。這說明水角種群面臨著適生環境變化的挑戰，其保護策略也應隨之調整。

人類開荒、伐木、放牧等活動以及交通和水庫建設等是全球自然生境面臨著生境喪失、片段化威脅和生物多樣性降低的主要原因（Laurance et al.， 2014; Haddad et al.， 2015）。城市化也加劇棲息地的破碎化，特別是對于城市中殘余的小種群本土植物更是如此。

對于水角而言，較低的遺傳多樣性水平，可能削弱了其在遷徙過程中的適應潛力，導致其有效種群規模降低。種群內的遺傳分化系數較高，說明其自然種群之間的基因流動較少。環境距離與遺傳距離、地理距離之間均呈顯著正相關，表明環境因素在水角種群遺傳分化中起到重要的作用，而地理距離則作為間接因素通過影響環境差異來影響遺傳分化的發生。因此，限制水角種群發展的重要原因來自其自身較低的遺傳多樣性和生境因素，具體表現為濕地生境的片段化嚴重，再加上人為活動干擾、城市化等不利的環境條件使得其生境進一步被破壞，種群規模進一步減小，逐步形成如今瀕危的狀態。針對水角瀕臨滅絕這一現象，一方面要著重保護濕地免受人為因素的破壞，其次進行就地保護，更有效地提高其群體的遺傳特性；另一方面采用人工授粉等方法提高其基因流，以促進其種群的發展。

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