生物降解材料聚蘋果酸的工藝研究進展

王召霞，黃煜琪，趙 蓉，杜雨澤，馬曉軍，李冬娜,

（1.天津科技大學輕工科學與工程學院，天津 300457；2.浙江大勝達包裝股份有限公司，杭州 311215；3.山西工程技術學院，陽泉 045000）

傳統石油基高分子聚合物具有耐久性、耐腐蝕性和優良的性能，是目前主要的包裝材料來源。然而，由于石油基塑料難以在短時間內自然降解，多年來對全球生態環境造成了大范圍的污染。同時，塑料制品的工業化生產也導致了全球能源消耗的速度迅速攀升，石油資源供不應求，經濟發展受到嚴重阻礙。加之近年來限塑令與雙碳計劃的頒布實施，一方面，人類必須開發新的清潔能源作為維持全球經濟運轉的儲備資源；另一方面，迫切需要研發可降解的塑料以替代不可回收的傳統塑料。生物質作為一種清潔低碳、原料豐富且高效的可再生能源，具有顯著的節能減排效益。我國生物質種類眾多，儲量巨大，其中80%以上來自農林廢棄物、林業廢棄物等木質纖維素材料[1]。全球每年林業和農業廢棄物年產量達1500 億t～2000 億t[2-3]，因此，合理開發利用這些木質資源已成為全球經濟可持續發展的重大戰略決策和選擇。

聚蘋果酸（PMA）是一種生物高分子材料，是以唯一的單體L-蘋果酸（L-malic acid，L-MA）通過無數酯鍵聚合后形成的脂肪族聚合物，具有優異的生物相容性、可生物降解性、易修飾性及水溶性，在生物醫學材料、可降解塑料、食品包裝材料等方面被廣泛研究，是最具發展潛力的“綠色塑料”[4]。近年來，PMA 的生物發酵技術成為國內外學者日漸關注的方向。通過葡萄糖、木糖等為碳源底物被微生物代謝以合成PMA，避免了有毒溶劑的使用，反應過程簡單溫和，能耗低，且產物分子量大。然而，PMA 生物發酵時的碳源成本占總生產成本的60%[5]，限制了PMA 的工業化生產。由于木質生物質含豐富的纖維素和半纖維素，能產生大量葡萄糖和木糖，是理想的替代碳源。利用以廉價生物質能源制備增值化學品的現代生物技術，實現了廢棄木質資源轉化和高值化利用，同時在一定程度緩解全球能源枯竭和生態環境污染的危機。

1 聚蘋果酸的結構及性質

PMA 是一種以L-蘋果酸單體通過38 個酯鍵相互連接而成的一種水溶性脂肪族聚酯化合物，結構簡式為HOOCCH2CH(OH)COOH。在PMA 的分子鏈中，一蘋果酸分子的α-羥基與另一分子的β-羧基是通過酯化作用連接起來的，因此PMA 中存在大量的酯鍵、羥基和自由羧基。PMA 具有3 種結構形態，分別是α-PMA、β-PMA、γ-PMA，如圖1 所示，其中β 型PMA 是唯一可以在自然界生物體內合成的構型[6]。

圖1 PMA 的三種結構

生物合成的PMA 經分離和純化后，一般以鈣鹽、鈉鹽等鹽的形式或自由酸的形態存在，經過冷凍干燥或噴霧干燥后在常態下呈白色粉末狀固體[7]。PMA 分子量的變化范圍很大，故沒有固定熔點和玻璃化溫度。商用PMA 溶液呈橘紅色透明狀，密度1.19～1.22 g/cm3，pH 值為1～2。具有高度化學穩定性及熱穩定性，分解溫度為330 ℃，不隨水蒸氣揮發。

PMA 是一種陰離子酸，其分子鏈上存在無數酯鍵，在無機酸、酶解及加熱條件（185 ℃）的作用下會發生水解而斷裂分解成L-MA[8]。L-MA 是生物體內三羧酸（TCA）循環的中間代謝物，能被用作生物體生長代謝的能量[9-10]，其半數致死量LD50達3.3 g/kg，故L-MA 和PMA 幾乎沒有毒性，同時PMA 具有優異的生物相容性、生物可降解性和無免疫原性等特性[11]。PMA 分子鏈中有許多游離的羧基，應用這些具有反應活性的羧基基團，可與其他功能性分子反應，最終形成具有多種功能的納米平臺[12-13]。羧基與某些藥物基團的有毒側鏈結合后，可降低其毒副作用[14]。由于親水性羧基，PMA 具有良好的水溶性和吸水性。

2 聚蘋果酸的合成方法

2.1 化學合成法

化學合成法分為直接聚合和開環聚合，能夠獲得三種構型的PMA。直接聚合法以熔融的L-MA 為原料，在無溶劑或有溶劑（二苯醚）的情況下加入催化劑（氯化亞錫、錫粉或氧化亞錫），于高溫下發生脫水酯化反應，一步形成γ-PMA。此法步驟簡單，但溫度要求高，故非常耗能，且催化劑含毒，產物復雜，分離提純的難度高，而且制備的PMA 分子量較低（一般為1500～5000 Da），優點是簡單方便，使用有機溶劑少，產率高，能滿足應用范圍小的低分子量PMA生產，是相對“綠色”的合成方法。開環聚合法分兩種：內酯開環聚合和交酯開環聚合。交酯開環聚合是以天冬氨酸為初始原料，加入芐醇和硫酸，在NaNO3的作用下取代氨基留下羧基以形成交酯，再通過氫解開環聚合形成α-PMA。內酯開環聚合是以L-MA 為原料，經一系列反應形成四元環狀單體芐酯蘋果酸內酯，陰離子開環聚合得到中間體聚β-蘋果酸芐酯，再用引發劑氫解而開環脫芐得到鏈狀β-PMA[15-16]。此法的優點是反應溫度低，PMA 相對分子量大，能達幾萬至幾十萬；但是，此法成本高，產率低，反應步驟復雜，產物分離提純難。

2.2 生物合成法

生物合成法是指利用微生物吸收碳源和營養物質進行代謝和生長，以分泌代謝產物PMA。葡萄糖、木糖、蔗糖、半乳糖、果糖均可被微生物利用以轉化PMA，再經下游處理后可得到PMA 純品。生物合成法的原料來源廣、資源豐富，反應過程溫和、污染小，獲得的PMA 均為β 型、具有相對較高的分子量（6～11 kDa）和純度，分離過程簡單，可以減少石油資源消耗和CO2排放。FENG 等[17]利用細胞固定化后的A.pullulans CCTCCM2012223 進行發酵合成了約123.7 g/L 的PMA。然而，PMA 發酵工藝的總成本中，有60%來自精制碳源的制備，如此高昂的成本限制了其工業生產。利用可再生生物質作為替代碳源進行PMA 發酵成為主要的研究方向。但由于優產菌株難分離、發酵過程難控制、發酵時間長等問題，生物合成PMA 尚未形成大規模生產。

合成PMA的菌種主要有短梗霉（Aureobasidium sp.），出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、多頭絨泡菌（Physarum polycephalum）和圓弧青霉菌（Penicillium cyclopium）等。其中，多頭絨泡菌和圓弧青霉菌產生的PMA 較少，僅2.7～3.3 g/L，無法滿足工業化生產需求，現已很少報道。NAGATA 等[18]從土壤中篩選、分離并鑒定了一種短梗霉菌株Aureobasidium sp.A-91，分別以甘露糖和葡萄糖為碳源進行發酵，合成了12 g/L 和47 g/L 的PMA。目前，主流生產菌株是出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），其合成的PMA 產量高達152.5 g/L。出芽短梗霉產生的PMA 主要以PMA-葡聚糖的結合體分泌到細胞質外。根據PMA 在丙酮中的高溶解性，通過丙酮沉淀可去除連接的葡聚糖，得到較純的PMA。由于每株出芽短梗霉的生理特征和代謝活性不同，PMA 的生產強度存在很大差別。

3 合成階段的影響因素

為實現PMA 發酵的優化控制，需要對發酵培養基的營養成分和發酵條件有充分的研究和認識。碳源、氮源、中和劑、pH 值、接種量等培養基條件的優化可以實現對微生物發酵代謝的控制，從而增加目標產物的積累。

3.1 碳源

碳源是發酵培養基的主要成分之一，為微生物生長提供能源和用以合成菌體生物量的骨架，同時作為底物供菌體合成目的產物。研究發現，各種糖如葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖以及可溶性淀粉、甘油都可以被作為搖瓶中PMA 生產的碳源[19-21]。其中，葡萄糖和蔗糖為碳源時的PMA產量最高，其次是木糖、果糖和麥芽糖。甘油[22]、有機酸[23]、醇等都可被出芽短梗霉用作碳源發酵并刺激PMA 生產。殷海松等[24]發現添加氨基酸也可被菌體作為碳源吸收利用，如天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸和蘇氨酸促進了A.pullulans CGMCC3337 菌體生長和PMA 的生產，在最優組合的氨基酸條件下獲得了57.89 g/L 的PMA，比未添加氨基酸時提高了40.92%。

3.2 氮源

氮源在菌體生長過程中用于構成細胞組分如酶類、蛋白質[25]，同時也作為含氮代謝物合成的底物如氨基酸。研究發現，有機氮源（酵母提取物、胰蛋白酶、玉米漿和丁二酸銨等）對PMA 產量的影響無顯著差異[20]，而無機氮源（NH4NO3、NaNO3、NH4Cl 等）對PMA 合成有顯著影響[26]。而且，氮源的量或碳氮比對菌體生長和PMA 的生產有決定性的影響。WANG等[27]發現0.1 g/L NH4NO3無法滿足發酵前期的細胞生長需要，添加10 g/L NH4NO3時的細胞生長迅速，但發酵結束時仍有未被消耗的NH4+，且不利于PMA生成，當在低氮時（2 g/L），PMA 產量最高。生物質來源的底物一般本身含有天然氮素，能刺激菌體生長繁殖。LEATHERS 等[28]利用A.pullulans 50383 在含最低總氮含量的大麥秸稈水解物中獲得了更高的PMA 產量。CHENG 等[29]用玉米漿作為氮源，發現補充甘蔗汁或大豆糖蜜會降低PMA 產量，因為過多的氮源促進了細胞生長而不是PMA 合成。

3.3 pH 值和中和劑

培養基的pH 值會直接影響到微生物菌體細胞膜的通透性，從而影響微生物對培養基內營養物質及微量元素的吸收利用。A.pullulans 適合在酸性環境中生長，但pH 過低也會影響PMA 合成。研究發現，培養基初始pH 值為4.0～6.0 時，有利于PMA 的合成[11]。靳挺等[30]研究了初始pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）對發酵的影響，隨著pH 的升高，PMA 產量逐漸增加，并在初始pH 值為5.5 時，PMA 的最高產量達16.58 g/L。CAO 等[31]研究發現，控制pH=6.0 及溶解氧濃度大于70%，能顯著促進A.pullulans ipe-1 酵母形態細胞的比例，并提高PMA 的濃度，且在pH＜5時，PMA 被水解了，同時多糖增加。LI 等[32]發現，在pH 為3 的 條 件 下，A.pullulans NG 會 形 成 厚 垣 孢子，抑制PMA 的產生。PMA 呈酸性，在發酵過程中隨著PMA 的積累，發酵液的pH 會大幅降低。因此，需要加入中和劑以維持pH 平衡。

在傳統發酵工藝中，CaCO3是最普遍使用的中和劑，能維持發酵液pH 穩定在適合菌體生長的范圍[27]。外源性Ca2+可以增加短梗霉酵母樣細胞的形成，從而減少酵母細胞向菌絲體的轉化。CaCO3的加入可誘導L-MA 的生成切換到還原途徑，并導致用于PMA 生產的L-MA 的積累。此外，CaCO3以HCO3-的形式提供CO2，為微生物CO2固定提供了充足的底物。

3.4 接種量

接種量決定了A.pullulans 在搖瓶發酵培養中的生長繁殖速度，接種量越大，發酵瓶內A.pullulans繁殖達到高峰的時間越短，PMA 得率越高。但是，如果接種濃度過高會導致溶解氧不足，影響產物的合成，產生過多代謝廢物；接種濃度過低則會延長培養時間，并降低發酵產量。在實際生物發酵過程中，菌株種類、培養基配方、其他發酵條件等都會影響接種量的變化。李睿穎等[33]對高細胞通透性的A.pullulans TJZK-BA21682 生產PMA 發酵過程中的接種量進行了優化，得出其最佳接種量為8%，當接種量過大或過小都會抑制PMA 的合成。

4 木質資源生物轉化PMA 的研究進展

木質資源的成分主要為纖維素、半纖維素及木質素，也存在少量果膠、樹膠、藻膠和瓊脂等，其結構非常復雜[34]。在新型生物能源發酵技術中，木質資源中的纖維素和半纖維素具有非常高的利用價值。纖維素鏈經纖維素內切酶、外切酶與β-糖苷酶水解后可產生大量葡萄糖[35]。而半纖維素可被水解轉化成豐富的單糖如己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖），以及含量很低的鼠李糖和果糖。利用廢棄木質資源作為底物發酵生產PMA 成為廣大科技工作者的研究重心，因為，該原料不僅成本低廉，而且由其轉化合成的PMA 產量最高可達114.4 g/L，產物分子量與用精制糖發酵時的基本一樣，具有極高的經濟效益。目前，已經有研究將大麥秸稈、小麥秸稈、玉米、玉米芯、大豆殼、甘蔗渣、生甘薯、菊芋莖塊等可再生木質資源制備成可發酵糖，代替精制碳源應用于PMA 的低成本發酵生產，如表1 所示。

表1 出芽短梗霉利用不同木質資源生產PMA

CHENG 等[29]發現A.pullulans ZX-10 將大豆糖蜜中的所有碳水化合全部轉化為PMA，且在氮限制發酵中的PMA 產量為71.9 g/L，得率為0.69 g/g。WEI 等[36]發現甘蔗汁可以作為經濟的底物，發酵過程中無需任何預處理或營養補充，獲得了116.3 g/L的高PMA 效價和0.41 g/g 的得率。LEATHERS 等[28]利用堿性H2O2預處理后的玉米纖維和小麥秸稈作為唯一碳源合成了20 g/L 以上的PMA。ZAN 等[37]利用廉價的生甘薯水解物作為底物，在有氧纖維床生物反應器中合成了最高產量為57.5 g/L 的PMA。ZOU 等[38]發現，由農業廢棄物玉米芯制備的水解液可以很好地用于分批發酵生產28.6 g/L 的PMA。XIA 等[39]使用經簡化后的菊芋莖（JA）水解物組成的培養基，發現JA 提高了丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶活性，從而獲得了比葡萄糖培養基更高的PMA濃度（114.4 g/L），而且在不添加外源氮源下，預處理后JA 中的生產率比單一葡萄糖高了2 倍。YEGIN等[40]使用稀酸預處理的大麥秸稈制備了一種水解液，其總發酵糖可達94.60 g/L，并且促進PMA 產量達35.76 g/L，得率為0.39 g/g。XIA 等[41]利用農產工業廢渣通過固態發酵的方法由A.pullulans HA-4D從甘薯渣和麥麩（質量比1∶1）的混合底物生產PMA，最高產量達75.4 mg/g。CAO 等[42]以甘蔗渣水解液為原料合成PMA，發現將酸和酶水解產物混合不利于PMA 的生產。利用甘蔗渣酶水解產物生產PMA 的產量比由酸水解產物獲得PMA 的產量高25.4%，說明酸水解產物更有利于微生物細胞生長，對PMA 產量的增加沒有顯著影響。WANG 等[43]選擇具有高營養價值和低成本特性的玉米浸液作為生長因子發酵合成PMA，在添加3 g/L 玉米浸液后，PMA的產量和微生物細胞生長分別提高了32.8%和41.8%。

5 總結與展望

PMA 是一種非常有前途的高分子聚合物，具有廣泛的應用前景，然而碳源的高成本和低產物得率使得大多數研究依然停留在實驗室階段，阻礙了PMA 的大規模生產?；诖?，研究者探索了以成本低廉的木質資源為碳源底物生物轉化PMA 的潛力，取得了顯著成效。但還存在一些問題和挑戰：

（1）由于木質素的存在，大部分來源于木質資源的原料在進行水解預處理時會產生許多木質纖維素抑制物（如糠醛、5-羥甲基糠醛、乙酸、甲酸等），這類物質對微生物的生長和代謝具有明顯的抑制作用。為了去除或減少這些消極影響，一般需要通過化學還原、物理吸附或加入生物酶的方法對水解液進行解毒。這增加了成本負擔，還存在糖損失、廢料和抑制物回收困難等問題，使用的化學試劑和吸附樹脂也對環境造成了一定壓力。

（2）大部分來自農業副產物的廢材本身含有復雜的重金屬離子、油脂和農藥殘留，從而造成可發酵糖轉化率低和糖酸轉化率低等問題。而玉米、甘薯這類農業作物富含淀粉，是A.pullulans 代謝的優質碳水化合物，能夠產生高效價的PMA（10.1～123.7 g/L）。但是，這類農業生物質是全球范圍的主要糧食作物，需求量極大，不太適合于PMA 的商業化生產。因此，開發低毒、低成本、高營養且不與食品供應鏈競爭的木質生物質碳源是今后研究的主要方向。