禽流感火麻油佐劑滅活疫苗實驗室乳化條件研究

陸有飛 黃慶南 李鳳梅 莫宏志 黃睿思 覃彬茜 陳超燕 謝江*

（1. 廣西農業職業技術大學，南寧 530007；2. 廣西麗誠東生物股份有限公司，南寧 530105；3. 平南縣上渡街道農業綜合服務中心，廣西 貴港 537300）

禽流感（AI）是威脅人類和禽類健康的一種重要疾病，我國現將其列為重大動物疫病，采取強制免疫進行防控。目前國內外生產的禽流感疫苗多為以礦物油為佐劑的滅活疫苗，其優點是價格便宜，疫苗免疫抗體效價高，免疫期持續期長；缺點是接種后不易吸收代謝，動物組織中殘留的苯環結構，進入食物鏈會威脅人類健康［1-2］。不同來源的礦物油質量各異，其免疫增強作用和安全性風險也存在差異［3-5］，尋找無副作用、無殘留、免疫效果好的新型佐劑一直是疫苗的研究方向。

火麻是一種藥食同源的?？浦参?，世界各地普遍種植?；鹇橛陀址Q火麻仁油，為火麻果仁壓榨出的一種可食用的植物油。世界長壽之鄉廣西巴馬縣盛產火麻油?；鹇橛透缓退?、亞油酸和α-亞麻酸等多種不飽和脂肪酸，具有降血脂、抗疲勞、抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用［6-9］，在食品、化妝品、保健品和藥品生產中得到廣泛應用［10-12］，在動物營養方面的應用證實具有促進生長和脂質代謝、提高免疫力和抗氧化能力［13-14］，但是在獸醫生物制品方面的應用尚未見報道。為尋找安全、無毒、無殘留的新型滅活疫苗佐劑，本研究使用火麻油代替礦物油作為疫苗佐劑，開展禽流感火麻油佐劑滅活疫苗實驗室制備乳化條件研究，以確定疫苗的實驗室制備工藝規程，現將初步結果報告如下。

1 材料

1.1 疫苗毒株

禽流感H9 亞型HN03 株，由廣西麗誠東生物股份有限公司提供，購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 實驗動物

SPF 種蛋購自淅江立華農業科技有限公司。SPF雞由廣西麗誠東生物股份有限公司提供。

1.3 主要試劑

火麻油（壓榨一級）購自廣西巴馬千百年健康食品有限公司。吐溫-80、司班-80 購自國藥集團化學制劑有限公司。硫乙醇酸鹽培養基（T.G）、酪胨瓊脂（G.A）和葡萄糖蛋白胨湯（G.P）購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.4 主要儀器和設備

高速乳化機購自青島雙峰壓力容器有限公司。高速離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。全自動孵化機購自青島興儀電子設備有限責任公司。旋轉粘度計購自上海昌吉地質儀器有限公司。

2 方法

2.1 禽流感火麻油佐劑滅活疫苗制備工藝

2.1.1 抗原制備

禽流感（H9 亞型，HN03 株）合格抗原批號為20221110，由廣西麗誠東生物股份有限公司根據《禽流感（H9 亞型）滅活疫苗（HN03 株）生產工藝規程》［15］（以下簡稱《規程》）制備，經甲醛滅活。

2.1.2 油相制備

取一定量的司班-80 加入60℃的火麻油中，攪拌均勻后置116℃高壓滅菌40 min，冷卻至25℃備用。

2.1.3 水相制備

先將吐溫-80 置116℃高壓滅菌40 min 后冷卻至25℃，再取一定量的吐溫-80，加入禽流感滅活抗原液中，混合均勻后備用。

2.1.4 乳化方法

根據油相與水相比例設置，先將油相加入乳化缸內，以1000 r/min 邊攪拌邊將水相加入油相中，再以6000~12000 r/min 轉速乳化5 min，即得油包水型禽流感火麻油佐劑疫苗。

2.1.5 疫苗乳化條件的優化

2.1.5.1 單因素試驗 分別考察吐溫-80 占比、司班-80 占比、油相與水相比例和轉速對疫苗乳化效果的影響。采用固定3 個變量，變化考察變量。吐溫-80 占比、司班-80 占比為其用量占乳化總量的體積百分比。

（1）吐溫-80 占比 吐溫占比分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，司班-80 占比為2.5%，油相與水相比例為2∶1，轉速為9000 r/min，分別進行乳化。按《規程》進行穩定性檢驗：取疫苗10 mL 加入離心管中，以3000 r/min 離心15 min，測定水相析出的量。

（2）司班-80 占比 司班-80 占比分別為2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%，吐溫-80 占比為試驗（1）中得到的較優值，油相與水相比例為2 ∶1，轉速為9000 r/min，分別進行乳化，按《規程》進行穩定性檢驗。

（3）油相與水相比例 油相與水相比例分別為3∶1、7∶3、2∶1、3∶2、1∶1，吐溫-80 占比與司班-80 占比采用試驗（1）（2）中所得到的較優值，轉速為9000 r/min，分別進行乳化，按《規程》進行穩定性檢驗。

（4）乳化轉速 轉速分別為6000 r/min、7000 r/

min、8000 r/min、9000 r/min、10000 r/min，吐溫-80占比、司班-80 占比及油相與水相比例采用試驗（1）（2）（3）中所得到的較優值，分別進行乳化，按《規程》進行穩定性檢驗。

2.1.5.2 正交試驗 以單因素試驗結果為基礎，正交試驗以吐溫-80 占比（A）、司班-80 占比（B）、油相與水相比例（C）、乳化轉速（D）4 個因素為考察對象，選擇每個因素最優點及其前后各一點共3 個水平，設計L9（34）正交試驗（表1）分別開展。

表1 L 9（34）正交試驗設計表

2.2 疫苗試制與檢驗

根據方法2.1 確定禽流感火麻油佐劑滅活疫苗最優乳化條件，參照《規程》規定的抗原含量（每毫升乳劑含禽流感抗原0.24 mL），用火麻油代替礦物油制備禽流感火麻油佐劑滅活疫苗3 批，進行物理性狀及無菌檢驗。

2.2.1 疫苗物理性狀檢驗 取試制疫苗每批5 瓶，參照《規程》中《性狀檢驗操作細則》進行檢查。方法如下：

2.2.1.1 外觀：取疫苗加入無色透明玻璃瓶，在2000 Lx 日光燈光照度下，目測疫苗顏色。

2.2.1.2 劑型：為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量試制疫苗滴于冷水中，除第一滴外，均應不擴散。

2.2.1.3 穩定性：吸取疫苗10 mL 加入離心管中，以3000 r/min 離心15 min，取出觀察乳劑管底水相析出的量，應不超過0.5 mL。

2.2.1.4 黏度：用旋轉式粘度計測定，應＜200 cP。

2.2.2 疫苗的無菌檢驗：取試制疫苗每批5 瓶，按《規程》中《無菌/純粹檢驗操作細則》進行檢驗。無菌取樣分別接種含硫乙醇酸鹽培養基（T·G），酪素胰酶瓊脂（G·A）及葡萄糖蛋白胨湯（G·P）培養基中，置37℃培養96 h，觀察有無細菌、霉菌生長。

結果判定：樣品應5/5 無菌生長。如發現污染雜菌或結果可疑時，可抽取10 瓶樣品重檢，重檢結果仍有雜菌，應判為不合格。

3 結果與分析

3.1 疫苗乳化條件的優化

3.1.1 單因素試驗結果

通過穩定性檢驗以試制疫苗水相析出的量多少來評價其穩定性。結果顯示，吐溫-80 占比為3.0%時，疫苗水析出量最??；司班-80 占比為4.5%時，疫苗水析出量最??；油相與水相比例為7∶3 時，疫苗水析出量最??；乳化轉速10000 r/min 時，疫苗水析出量最?。▓D1）。因此確定吐溫-80 占比3.0%、司班-80 占比4.5%、油相與水相比例7∶3、乳化轉速10000 r/min 為各因素最佳水平。

圖1 單因素試驗對水析出量的影響

3.1.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表2，方差分析見表3。根據表2 極值（R）的大小可知各因素對疫苗乳化效果的影響依次為C ＞D ＞A ＞B，即油相與水相比例對疫苗乳化效果的影響最大，司班-80 占比（%）對乳化效果影響最??；由k（同一因素同一水平三個試驗結果的均值，k 值越小說明析出水量越?。┲悼芍?，疫苗乳化條件最優組合為A2B3C2D2，即吐溫-80 占比3.0%，司班-80 占比4.5%，油相與水相比例為7∶3，乳化轉速10000 r/ min。由方差分析結果（表3）可知，各因素對疫苗乳化結果影響無顯著性差異。因此選取最優組合A2B3C2D2即吐溫-80 占比3.0%，司班-80 占比4.5%，油相與水相比例7∶3，轉速10000 r/min 為疫苗試制最佳乳化條件。

表2 正交試驗結果

3.2 疫苗試制與檢驗結果

根據疫苗乳化條件最優組合試制禽流感火麻油佐劑滅活疫苗3 批，按照《規程》中《性狀檢驗操作細則》和《無菌/純粹檢驗操作細則》進行檢驗，檢驗結果見表4，驗證了最優組合試制的疫苗最穩定。

表4 疫苗檢驗結果

4 討論

乳化條件優化試驗結果表明，吐溫-80 占比為3%、司班-80 占比為4.5%、油相與水相比例7∶3、乳化轉速為10000 r/min 是疫苗最佳乳化條件，制備的疫苗穩定性最佳。試制的禽流感火麻油佐劑滅活疫苗為微黃白色油包水型均勻乳劑，黏度合格，無細菌、霉菌污染，經3000 r/min 離心15 min 劑型穩定。本試驗結果與黃慶南等［16］的火麻油乳劑穩定性研究結果一致，經3000 r/min 離心15 min 不分層。閆馨月等［17］研究通過適當的超聲處理可提高火麻油乳劑的穩定性，該方法可為疫苗乳劑制備工藝的進一步研究提供借鑒。

火麻油中必需脂肪酸的組成與比例更符合動物代謝需要，在動物營養方面的研究極具功能性開發潛力，在新型無殘留的動物疫苗佐劑方面的應用探索也具有進一步研究的價值，但火麻油佐劑的質量標準及其配方的優化、疫苗免疫持續期、疫苗保存期等有待后續的深入規范研究。

5 結論

本研究首創采用火麻油代替礦物油作為佐劑，實驗室研究能夠制備出穩定的禽流感火麻油佐劑滅活疫苗。