鐵皮石斛PCR鑒定引物的比較和篩選研究

潘映秋　洪亮　盧啟寰　李兆奎　夏慧麗

摘要：目的：比較并篩選基于PCR技術的鐵皮石斛成分鑒定的高特異性和高靈敏度引物。 方法：選取1組專利報道和2組文獻報道的鐵皮石斛特異性PCR鑒定引物，優化其退火溫度，比較其特異性和靈敏度，篩選出高特異性和高靈敏度的引物。 結果：3組引物的擴增能力、特異性和靈敏度均存在差異，其中1組以鐵皮石斛ITS2區為靶標、引入錯配堿基的雙阻滯鐵皮石斛成分鑒定引物，具有最佳的特異性和靈敏度。結論：通過比較3組鐵皮石斛特異性PCR引物，優選出1組鐵皮石斛成分鑒定引物，為鐵皮石斛成分及其產制品的鑒定提供了參考依據。

關鍵詞：鐵皮石斛；真偽鑒定；引物；特異性；靈敏度鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生草本植物[1]ADDINNE.Ref.{54166D22-E517-4084-8F70-B3213B93AA72}，具有滋養陰津、提高免疫力、抗氧化、促消化等多種藥用和食療功能[2-3]ADDINNE.Ref.{BC806DA9-8879-4364-B2EE-7BB76502168E}。由于鐵皮石斛藥用和食用價值高，市場需求量大，供需失衡導致其價格節節攀升，市場上以次充好、摻假充真的情況屢禁不止。我國石斛共有76個品種和2個變異品種，常見的品種就有15個左右[4]ADDINNE.Ref.{EF492777-2F85-4174-93D4-FA25F38E2F78}。鐵皮石斛與其近緣種外形相似，特別是加工成楓斗等產制品后，更難以從外形上區分[5-6]ADDINNE.Ref.{F56C271D-5B76-46B7-87D3-C07E91B75ECA}。因此，為有效防止摻假偽劣品種流入鐵皮石斛市場，提高鐵皮石斛及其制品的質量，亟需建立靈敏、快速、有效的鐵皮石斛鑒定方法。

分子鑒定作為新興的動植物源性成分鑒定手段，具有準確度高、重現性好等優點，在鐵皮石斛鑒定中的應用研究也日益深入[7]ADDINNE.Ref.{8A6FF192-40AD-4C6F-8F4D-E3DC5EA899FA}，其中DNA條形碼技術和分子標記方法應用較為廣泛。但DNA條形碼技術對儀器配置和人員專業要求高，尚難以在基層推廣；分子標記技術則多用于育種研究，重復性和穩定性尚不能滿足檢驗需求。因此，需要開發更為快捷、易于推廣的鐵皮石斛分子鑒別方法。

盡管已有不少鐵皮石斛特異性PCR檢測方法的報道，但這些方法建立在不同實驗條件、引物及檢測標靶上，檢測效果難以比較和評價。目前，各地食藥檢驗機構大都具備開展常規PCR檢測能力，在此基礎上開發有效的針對鐵皮石斛PCR鑒別方法，更適于在基層推廣應用。本研究選擇并比較了3組不同特征的鐵皮石斛PCR鑒定引物[8-10]ADDINNE.Ref.{C677EFBE-D179-4249-8260-85C13C798835}，旨在篩選出適用于基層檢驗的高特異性和高靈敏度的鐵皮石斛特異性鑒定引物，也可為后續鐵皮石斛多重分子鑒定方法的開發提供基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

鐵皮石斛對照藥材（批號：121501-201402），購自中國食品藥品檢定研究院。其余樣品：鐵皮石斛，采自浙江樂清；霍山石斛，采自安徽霍山；金釵石斛、流蘇石斛、鼓槌石斛、重唇石斛、齒瓣石斛和杯鞘石斛，采自云南寧洱；石仙桃，采自廣東肇慶，經臺州市藥品檢驗研究院鑒定，取其葉用于DNA抽提。試劑：植物基因組DNA提取試劑盒（DHelix）、TaqTM Hot Start Version（Takara）、S2標準卡夾（Bioptic）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2儀器與設備

T100 PCR擴增儀（Bio-Rad）、Lysera高通量組織研磨儀（Biotage）、Nanodrop One超微量核酸蛋白測定儀（Thermo）、Qsep100全自動核酸蛋白分析儀（Bioptic）、ST8R低溫冷凍離心機（Thermo）。

1.3引物來源

本研究比對的3 組鐵皮石斛PCR鑒定引物分別來自發明專利[8]ADDINNE.Ref.{3E66C777-C00A-462B-951A-D8220D3A8712}、文獻A[9]、文獻B[10]ADDINNE.Ref.{DD779266-95C2-4760-82E3-B0C59D0A7294}，檢測方法均為普通 PCR，各引物信息詳見表1。其中，T1以鐵皮石斛ITS2為靶標；T2同樣以ITS2為標靶，為引入錯配堿基的雙阻滯特異性引物；T3則為基于SCoT標記篩選出的鐵皮石斛特異性擴增引物。同時應用ITS2通用引物對各樣本進行DNA條形碼鑒定[11]ADDINNE.Ref.{EA02F413-F17F-4888-AC50-DA5863F8FC15}。

1.4方法

1.4.1DNA提取及核酸質量檢測對照藥材直接稱取50 mg；其余樣本取鮮葉，冷凍研磨后稱取100 mg。參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，檢測其濃度及質量 （A₂₆₀/A₂₈₀在 1.6～2.0 時DNA 質量滿足實驗要求），4 ℃保存待用。

1.4.2DNA條形碼檢測為確保DNA樣本來源與記錄名稱一致，使用ITS2通用引物對本研究所使用的樣本開展DNA條形碼檢測。目標PCR產物送至生工公司克隆測序，經BLAST比對（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov），確認樣品種屬。

1.4.3PCR退火溫度優化使用鐵皮石斛對照藥材開展3對引物的退火溫度優化實驗，相關設置見表2，退火溫度梯度范圍為55～65 ℃。PCR儀根據設定的溫度范圍，自動分配8個退火溫度，每個溫度設2個平行。PCR反應液配置如下：10×PCR Buffer （Mg²⁺plus） 2.5 μL、dNTP Mixture （各2.5 mmol/L） 1 μL、TaKaRa Taq HS （5 U/μL） 0.3 μL、DNA 50 ng、上下游引物按表2設置加入，超純水補足總體積至25 μL。目標PCR擴增產物送至生工公司進行克隆測序，以確認是否為目標序列。

1.4.4PCR擴增特異性比較選擇最佳退火溫度，使用待評價引物，分別對鐵皮、霍山、金釵、流蘇、鼓槌、重唇、齒瓣和杯鞘石斛及石仙桃進行PCR擴增，比較其特異性，每個樣本設2個平行。

1.4.5PCR擴增靈敏度比較選擇最佳退火溫度，使用待評價引物，對連續梯度稀釋的鐵皮石斛對照藥材DNA進行PCR擴增，比較其擴增靈敏度。DNA梯度濃度分別為50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL，每個PCR體系加入1 μL DNA模板，每個濃度設3個平行。

2結果與分析

2.1DNA條形碼鑒定結果

使用ITS2通用引物對各樣本進行擴增，產物片段大小約為500bp，與預計一致，克隆測序結果經BLAST比對，確認樣本來源與預期一致。

2.2PCR退火溫度優化結果

由圖1可見，8個梯度退火溫度檢測，T1均未擴增得到預期136bp的目標產物，說明該引物無法對鐵皮石斛進行有效擴增。T2和T3均擴增得到預期的397bp和197bp的目標產物，經序列比對分析確認擴增序列為目標序列。綜合分析條帶亮度及非特異擴增條帶，分別選擇61.1 ℃和58.8 ℃作為T2和T3的最佳退火溫度。

2.3引物特異性分析

使用最佳退火溫度對T2和T3的擴增特異性進行分析。由圖2可見，T2僅鐵皮石斛擴增得到397bp的目標條帶，其他樣品均無非特異性擴增，說明T2特異性佳；T3也具有良好的特異性，僅鐵皮石斛擴增得到197bp的目標條帶，但齒瓣石斛在300bp和800bp附近出現非特異擴增，需注意區分。

2.4引物靈敏度分析

使用最佳退火溫度對連續梯度稀釋的鐵皮石斛對照藥材DNA進行PCR擴增。如圖3所示，隨著DNA模板量的下降，PCR擴增產物濃度總體呈下降趨勢。當鐵皮石斛DNA模板量低至0.05 ng/μL時，T2仍能擴增得到清晰的目標條帶；但當鐵皮石斛DNA模板量為0.5 ng/μL時，T3已無法擴增得到目標條帶，因此T3靈敏度欠佳。綜上，引物T2的鑒別靈敏度更高，能更好地滿足實際檢測需求。

3討論與結論

2020年版《中國藥典》對鐵皮石斛的鑒別采用性狀鑒別、顯微鑒別和化學鑒別等方式[1]ADDINNE.Ref.{4E40F4AD-B590-424B-A59F-A4E8B7EAA1A2}。這些傳統的鑒別方法得到的結論往往不夠完善，特別是對于加工后喪失鐵皮石斛形態的粉末或液體制劑更難進行有效鑒定，且檢測結果易受外界因素及生物體發育階段的影響。此外，中國藥典以多糖和甘露糖的含量測定為指標對鐵皮石斛進行質量控制，但這些指標并非鐵皮石斛特有，因此難以鑒別鐵皮石斛同屬偽品[1]ADDINNE.Ref.{A0CA587E-7DD9-48CD-850D-4854906EA1F7}。

PCR作為一種高效、便捷、準確的動植物源性成分鑒定手段，已在食品藥品源性成分鑒別上有了非常廣泛的應用。本研究選擇了具有代表性的3組不同特性的鐵皮石斛特異性PCR鑒定引物，對其進行了退火溫度的優化及特異性和靈敏度的比較。結果表明，來自專利[8]ADDINNE.Ref.{80C180BE-1866-4E7B-A6AD-9F7484E1135E}的以鐵皮石斛ITS2為靶標的特異性PCR引物無法擴增得到鐵皮石斛特異性目標片段，這可能是由于ITS2區存在較多多態性位點[12]ADDINNE.Ref.{AFC469D8-A74A-4D9A-A8B0-142EF8861106}，該專利在引物設計時參照的ITS2序列與本研究所選用的鐵皮石斛ITS2序列在引物區域存在差異，因此在對鐵皮石斛進行特異性引物設計的時候，可結合收集到的樣品序列及NCBI等基因數據庫中報道的序列，綜合比對序列之間的特異性和多態性位點才能更加準確地開展相關引物的設計。文獻A[9]ADDINNE.Ref.{2348BDC3-0811-4627-B234-1A4005C309D6}同樣基于鐵皮石斛ITS2區，選擇2個SNP位點設計了1對在3′端倒數第2位引入錯配堿基的雙阻滯特異性引物，可特異性擴增鐵皮石斛，后續檢測表明該方法具有良好的特異性和靈敏度，檢測限低于0.05 ng/μL，這可能與該引物所使用的SNP位點位于具有高拷貝數的ITS序列有關。文獻B[10]ADDINNE.Ref.{891E0521-5C30-4EFB-9B12-E980F8E50B8E}則基于新型的SCoT標記篩選出鐵皮石斛特異性擴增引物，檢測結果表明該引物可特異性擴增鐵皮石斛，但檢測靈敏度欠佳，且存在較多非特異性擴增產物，這可能是由于該引物通過分子標記篩選，基因組中存在多處可與引物結合的序列，產生了非特異性擴增，進而影響結果判定。

因此，綜合考慮3對引物對鐵皮石斛的擴增能力、特異性及靈敏度，來自文獻A的T2引物可作為鐵皮石斛成分鑒定的首選，并可進一步推廣應用于實際檢測工作中，該方法也可為后續鐵皮石斛的多重分子鑒定及定量檢測方法的開發提供基礎。參考文獻

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Comparative and Screening Study on PCR Identification Primers for Dendrobium officinalePAN Ying-qiu， HONG Liang， LU Qi-huan， LI Zhao-kui， XIA Hui-li

（Taizhou Key Laboratory of Drug Composition and Adulteration Identification Technology，

Taizhou Food Inspection and Testing Center/Taizhou Institute of Drug Inspection，Taizhou 318000， China）Abstract：ObjectiveTo comparie and screen high specificity and sensitivity primers in Dendrobium officinale ingredient identification methods based on PCR.MethodPCR identification primers for Dendrobium officinale were selected from one group of patent reports and two groups of literature reports， and their annealing temperatures were optimized. The amplification specificity and sensitivity of the primers were compared， and high specificity and sensitivity primers were screened out. ResultThere were differences in amplification capacity， specificity and sensitivity respectively among these 3 groups of primers. One group targeting the ITS2 region of Dendrobium officinale and introducing a pair of double-blocked specific primers for Dendrobium officinale identification had the best specificity and sensitivity. ConclusionBy comparing 3 groups of Dendrobium officinale-specific PCR primers， one group of primers was selected as a preferred one， which provided a reference for the identification of Dendrobium officinale and its products.

Keywords：Dendrobium officinale; authenticity identification; primer; specificity; sensitivity