幽門螺旋桿菌尿素酶納米抗體UreNb重組質粒的構建及其產物的表達、純化與鑒定※

劉文婧,呂慧玲,王順娟,馮 琳,湯 鋒,李潤樂§,胥 瑾*

(1.青海大學醫學部,西寧 810001;2.青海省藏醫院,西寧 810007;3.青海省人民醫院,西寧 810007;4.青海大學高原醫學研究中心,西寧 810001)

課題組前期利用羊駝天然納米抗體文庫,篩選得到了針對幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)尿素酶B亞基(Urease-B)的高親和力納米抗體UreNb。本研究構建幽門螺旋桿菌尿素酶納米抗體UreNb重組質粒,在大腸桿菌系統中通過誘導表達目的蛋白并予以純化,再對表達產物及純化產物進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

pET22b質粒、DH5α感受態細胞、Arctic-Express表達菌、BL-21(DE3)表達菌、Rosetta表達菌、pSumo-mut質粒均購自鐘鼎生物公司。限制性內切酶購自TaKaRa公司,蛋白質Marker購自Thermo公司,IPTG購自Biotopped公司,氨芐青霉素鈉、四環素、卡納霉素購自Solarbio公司,0.22 μm無菌濾器和透析袋購自Ruitaibi公司,Ni-IDA親和層析柱購自GenScript公司,4×蛋白上樣緩沖液購自Solarbio公司。

1.1.2 主要儀器

多聚酶鏈式反應儀購自艾本德公司,凝膠成像分析系統購自法瑪西亞公司,酶標分析儀購自美谷分子公司,蛋白純化儀購自上海嘉鵬有限公司,低溫高速離心機購自德國西格瑪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 UreNb在質粒pET22b中的構建及表達鑒定

在前期研究中經篩選獲得了針對Urease-B納米抗體UreNb的氨基酸序列,經翻譯后得到的核苷酸序列采用密碼子優化后用于全基因合成。在T1連接酶體系下經過酶切(NcoI/XhoI)后連接(4℃,過夜),將UreNb核苷酸序列克隆至質粒pET22b后轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞,獲得重組質粒pET22b-UreNb。從培養的陽性菌落挑選、提取質粒,通過雙酶切(MluI/XhoI)法鑒定克隆結果。pET22b-UreNb分別轉化至表達菌株BL-21、Arctic Express、Rosetta,涂布于含有相應抗性的固體培養基上培養(37℃,過夜)后,挑取單克隆并進行擴大培養,而后分別吸取1 mL菌液加入到200 mL的LB培養基中擴增培養。三種表達菌同時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG。10 mmo/L)進行誘導。通過優化誘導表達條件,使用BL-21表達菌株時,將誘導溫度分別調整至15℃和37℃,使用Arctic Express、Rosetta菌株表達時,將誘導溫度調整至37℃。隨后分別從三個表達菌株中取出1 mL菌液離心后棄上清,將1×上樣緩沖液(100 μL)加入沉淀物中重懸。剩余培養物離心后棄上清用PBS重懸菌體沉淀物,將重懸液用超聲波破碎后,分別取上清與沉淀物加入上樣緩沖液后重懸。做電泳(12% SDS-PAGE)分析后以考馬斯亮藍染色確認誘導表達結果。

1.2.2 UreNb在質粒pSumo-mut中的構建及表達鑒定

用T1連接酶體系連接,將經UreNb納米抗體經過密碼子優化后的核苷酸序列克隆至pSumo-mut表達載體,克隆位點為無縫克隆-XhoI。電轉至大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑選陽性單克隆菌落并提取質粒,通過酶切(MluI/XhoI)鑒定質粒pSumo-mut-UreNb的構建結果。隨后將正確克隆的重組質粒轉化至BL-21,將陽性克隆菌落接種于Kana LB液體培養基(5 mL)中(37℃,220 r/min,過夜),培養后按1%接種于Kana LB液體培養基(50 mL)中培養(37℃,220 r/min)至OD值為0.4～0.6,加入IPTG誘導(15℃,過夜)。次日收集菌體,用超聲波破碎后收集上清及沉淀物。將誘導前、后的菌液以及超聲波破碎后的上清和沉淀物進行SDS-PAGE電泳,以確認誘導表達結果。

1.2.3 重組蛋白pSumo-mut-UreNb的包涵體復性

對上述表達產物鑒定,重組蛋白pSumo-mut-UreNb在沉淀物中表達,遂將上一步驟中經超聲波破碎后的菌液重懸、離心后棄上清。沉淀物分別用50 mM NaH2PO4、10 mM Tris-HCL、8 M尿素溶液混懸后以超聲波裂解。將上述溶液離心后吸取上清加入透析袋中,先后置于添加了還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的復性工作緩沖液中,靜置(4℃,過夜)后離心收集上清。

1.2.4 pSumo-mut-UreNb融合蛋白的純化分析

使用經Binding-Buffer(0.15 M NaCl,20 mM Tris-HCl,pH為8.0)預平衡的親和層析柱,沖洗至流出液OD280值到達基線后加入復性后的蛋白溶液。用Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM Imidazole,0.15 M NaCl,pH為8.0)沖洗,至流出液OD280值到達基線。用Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM Imidazole,0.15 M NaCl,pH為8.0)洗脫目的蛋白,收集流出液進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 pSumo-mut-UreNb純化蛋白鑒定

將1.2.4步驟中的凝膠用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上,以鼠源His-tag為一抗、HPR標記羊抗鼠IgG為二抗,添加顯色液使用熒光化學發光儀成像進行Western Blot驗證。

2 結果

2.1 pET22b-UreNb的質粒構建及表達鑒定結果

Ure-Nb目的基因經密碼子優化后得到的核苷酸序列如下:CCATGGGCCAGGTTCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGTGGTCTGGTTCAGGCAGGTGGTTCACTGCGCCTGAGCTGTGCTGCTAGCGGTAATACCCTGCGTATTGTTGCAATGGGTTGGTATCGCCAGGGTGCAGGCAATAAACGTGATCTGGTGGCAAGTATTAGCACCAGCAATGATCGTACCACCTATGCCGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGTCGTGATAGTGCAAAAAACACCATGTATCTGCAGATGAATAGCCATCATCATCATCACCATTGACTCGAG。目的序列連入載體pET22b后經酶切(MluI/XhoI)的鑒定結果見圖1。圖1顯示,克隆位點與酶切位點不在同一位置,圖中條帶顯示的片段大小與預期設計大小一致(1 200 bp),表明納米抗體UreNb目的序列已成功插入質粒中,表示重組表達載體pET22b-UreNb構建成功。

M:Marker;Line1:酶切前質粒;Line2:酶切后質粒

將pET22b-UreNb分別轉化至表達菌株BL-21、Arctic Express、Rosetta中,其中圖2、3顯示BL-21表達菌株在誘導溫度為15、37℃時未出現表達條帶。

M:Marker;Line1:pET22b誘導(空載);Line2:未誘導;Line3:誘導后;Line4:誘導破碎后上清;Line5:誘導破碎后沉淀物

M:Marker;Line1:pET22b誘導(空載);Line2:未誘導;Line3:誘導后;Line4:誘導破碎后上清;Line5:誘導破碎后沉淀物

圖4、5顯示表達菌Arctic Express、Rosetta被誘導(37℃)后未見明顯表達,故更換重組表達載體為pSumo-mut。

M:Marker;Line1:pET22b誘導(空載);Line2:未誘導;Line3:誘導后;Line4:誘導破碎后上清;Line5:誘導破碎后沉淀物

M:Marker;Line1:pET22b誘導(空載);Line2:未誘導;Line3:誘導后;Line4:誘導破碎后上清;Line5:誘導破碎后沉淀物

2.2 pSumo-mut-UreNb的質粒構建及表達鑒定結果

經T1連接酶體系連接,將UreNb插入原核表達載體pSumo-mut,克隆位點為無縫克隆-XhoI,序列如下:CAGGTTCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGTGGTCTGGTTCAGGCAGGTGGTTCACTGCGCCTGAGCTGTGCTGCTAGCGGTAATACCCTGCGTATTGTTGCAATGGGTTGGTATCGCCAGGGTGCAGGCAATAAACGTGATCTGGTGGCAAGTATTAGCACCAGCAATGATCGTACCACCTATGCCGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGTCGTGATAGTGCAAAAAACACCATGTATCTGCAGATGAATA GCTAACTCGAG。目的序列連入載體pSumo-mut后,提取質粒經酶切(MluI/XhoI)鑒定,條帶大小與預期大小一致(1 500 bp),表明UreNb目的序列已成功插入質粒中,表示重組表達載體構建成功,見圖6。

M:Marker;Line1:酶切前質粒;Line2;酶切后質粒

經IPTG誘導表達蛋白pSumo-mut-UreNb,對未誘導樣本、誘導后樣本及破碎后上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。圖7顯示,在破碎后沉淀部位27 kD處可見明顯增粗條帶,而在可溶條帶中未見。上述實驗結果證明,原核表達載體BL-21能夠成功表達重組蛋白pSumo-mut-UreNb,且重組蛋白pSumo-mut-UreNb在原核表達載體BL-21中是以包涵體形式表達。

M:Marker;Line1:pET22b誘導(空載);Line2:未誘導;Line3:誘導后;Line4:誘導破碎后上清;Line5:誘導破碎后沉淀物

2.3 重組蛋白pSumo-mut-UreNb的包涵體復性和純化結果

目標蛋白經包涵體變、復性和純化后對超聲波破碎處理后的樣品、純化后流出樣品及洗脫樣品進行SDS-PAGE分析。圖8顯示,純化后的目的蛋白純度較高。

M:Marker;Line1:未純化蛋白;Line2:洗脫液中的蛋白;Line3:純化后的目的蛋白

對純化后獲得的目的蛋白以鼠源His-tag為一抗、HPR標記羊抗鼠IgG為二抗進行Western Blot驗證,結果顯示,目的蛋白大小約為27 kDa左右,與理論分子量基本吻合,結果符合實驗預期結果,見圖9。

M:Marker;1:純化后樣品

3 討論

目前,單克隆抗體應用于檢測及診斷治療方面的研究較多,但小分子納米抗體的應用還在起步階段[1],尤其在幽門螺旋桿菌感染治療方面還未出現用于診斷及治療的納米抗體。幽門螺旋桿菌作為胃部特異性病原菌,是導致胃部疾病發生發展的重要細菌,其中Urease的表達貫穿于幽門螺旋桿菌整個生命活動的始終[2]。本研究中尿素酶納米抗體能夠特異性結合Urease-B亞基,使其失去活性。另一方面,Urease-B含有酶活性中心,具有很高的抗原性,是開發預防和治療性疫苗的潛在抗原[3]。納米抗體天然存在于駱駝科及鯊魚科動物血清中,與傳統單克隆抗體不同,納米抗體的獨特結構和小分子量,以及高穩定性為抗體藥物的開發提供了全新的思路,同時也可因需要而進行人源化改造[4]。因此尋找合適的表達載體,并且能夠高效、大量表達此抗體,可有助于后期的實驗研究。

本實驗在抗體表達過程中首先選擇了pET-22b質粒,此質粒能夠將表達的目的蛋白定位在細胞外周質腔后形成可溶性蛋白[5]。隨后使用表達載體pSumo-mut,此質粒不僅能夠提高蛋白的溶解性,而且有助于誘導蛋白形成正確折疊,從而形成三級空間結構[6]。其攜帶的6×His標簽使重組蛋白可以通過Ni柱親和純化后獲得高純度的蛋白。利用Sumo蛋白酶能夠特異性切割融合蛋白,從固定的位置將pSumo-mut蛋白與重組蛋白徹底分離[7]。在原核表達系統中,BL-21大腸桿菌表達菌株不含lon、OmpT蛋白酶,所以可降低細胞中表達的異源蛋白的降解水平并且提高轉化效率[8]。ArcticExpress菌株是BL-21的改良菌株,可促進表達蛋白的穩定,此表達菌可降低重組蛋白包涵體的形成率,增加可溶重組蛋白的表達量及生物活性[9]。Rosetta菌株可補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對應的tRNA,提高外源基因的表達水平[10]。本研究首先選擇pET-22b載體擬提高可溶蛋白表達率,然后選擇Arctic Express、BL-21、Rosetta三種表達菌分別測試重組蛋白表達成功率,結果顯示,成功構建的pET-22b-UreNb均未在上述三種表達菌中有效表達。隨后將重新構建的重組質粒pSumo-mut-UreNb轉化入表達菌BL-21中進行表達,經鑒定可在沉淀物中大量表達,純化后經過SDS-PAGE、Western Blot驗證,鑒定其為成功表達載體,成功獲得UreNb純化蛋白。pSumo-mut載體因攜帶Sumo融合蛋白,能夠使目的蛋白形成正確折疊,且后續經特異性切割融合蛋白后,重組蛋白N端無氨基殘留,有利于后續研究的進行。

青海地區幽門螺旋桿菌感染的發生率較高,其感染與胃潰瘍、胃炎以及胃癌的發生也有一定相關性[11]。幽門螺旋桿菌感染存在于疾病的活動期和靜止期,活動期感染增殖速度更加迅速,患者臨床癥狀更為明顯[12]。在幽門螺旋桿菌的刺激下,不但可以誘發胃癌,而且能夠影響胃癌的浸潤及轉移。因此,在高原地區胃部疾病的防治中,控制幽門螺旋桿菌感染是現階段仍需解決的重要問題。

鑒于以上納米抗體UreNb的應用前景,本研究基于前期研究基礎,構建了該納米抗體的重組質粒,建立了原核表達體系,經純化得到了其純化蛋白,為制備幽門螺旋桿菌診斷抗體開辟了新的途徑。