放血療法促高原慢性低氧下雄性大鼠紅細胞衰亡的實驗研究※

馮 琳,王順娟,劉文婧,李潤樂,湯 鋒

(1.青海大學高原醫學研究中心,西寧 810001;2.青海省人民醫院,西寧 810007;3.青海省藏醫院,西寧 810007;4.青海大學基礎醫學部,西寧 810016;5.青海省高原醫學應用與基礎研究重點實驗室,西寧 810001)

本課題組前期研究發現,在慢性低氧環境下紅細胞生成增加、衰亡減少。此研究結果在國際學界首次報道,并引發廣泛關注[1]。據此推測放血療法可促高原慢性低氧下雄性大鼠紅細胞衰亡。本課題就此開展相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組

SD雄性大鼠購自重慶騰鑫生物西安分公司[生產許可證號:SCXK(浙)2019-0002],200 g/只。分為對照組(Control)、低氧組(Hypoxia)和放血組(Phlebotomy)。

本研究通過青海大學醫學院倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑和儀器

Annexin V-FITC、Retic-Count和高速分選流式細胞儀購自BD公司,中型低壓氧艙購自貴州哈雷空天環境工程有限公司,全自動血液體液分析儀購自希森美康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 慢性低氧下紅細胞增多雄性大鼠模型建立

Control置青海大學醫學院高原醫學研究中心動物房28 d,Hypoxia和Phlebotomy置醫學院低壓氧艙28 d,Phlebotomy分別于第7、14、21 d經尾靜脈放血500 μL。

1.2.2 血細胞分析

Phlebotomy于第7、14、21 d用EDTA抗凝管采血500 μL,檢測紅細胞(Red blood cell count,RBC)數目、血紅蛋白(Hemoglobin,HGB)含量、血細胞容積(Hematocrit,HCT)、血小板(Platelet,PLT)數量等指標。并于第28 d取三組雄性大鼠全血進行上述項目檢測。

1.2.3 紅細胞滲透脆性實驗

配置梯度濃度生理鹽水1號(6.8 g/L NaCl)、2號(6.4 g/L NaCl)……12號(2.4 g/L NaCl)和13號生理鹽水(0.9%)及14號尿素(1.9%)、15號去離子水。流式管中按序號各添加500 μL溶液,管中滴入一滴全血(約50 μL),靜置30 min觀察血液滲透脆性并記錄。

1.2.4 紅細胞衰亡檢測

全血離心(800 r/min)10 min,取血漿凍存。制備1×bufferr[Annexin V-FITC(BD)]溶液,每管取1×106個紅細胞,用1×PBS緩沖液清洗兩次。每管取1×106個紅細胞添加5 μL FITC試劑,在室溫下避光孵育20 min,添加1×bufferr[Annexin V-FITC(BD)]溶液至終體積500 μL,過濾膜后使用流式細胞儀檢測紅細胞衰亡水平。

1.2.5 網織紅細胞檢測

全血離心(800 r/min)10 min,取血漿凍存。每管取5 μL紅細胞添加1 mL Retic-CountTM染色劑,在室溫下避光孵育30 min。離心(800 r/min)5 min棄上清,加入1 mL 1×PBS緩沖液,清洗兩次,最后添加1×PBS緩沖液至終體積500 μL,過濾膜后使用流式細胞儀檢測網織紅細胞(Reticulocyte,Ret)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 放血對血細胞的影響

Hypoxia雄性大鼠置于模擬海拔5 000 m的低壓氧艙飼養4 w時從尾靜脈采血,進行血常規檢測,結果見表1。Hypoxia紅細胞數量和血紅蛋白含量顯著增加,Phlebotomy相比于Control雖有增加,但明顯低于Hypoxia。同樣,Hypoxia紅細胞比容顯著高于Control和Phlebotomy。Control血小板數量顯著高于Hypoxia和Phlebotomy,同時Phlebotomy相比于Hypoxia明顯增加。

Table 1 Blood Cell Count Analysis

2.2 放血對紅細胞滲透脆性的影響

紅細胞起始溶血濃度為(5.2～4.4)g/L NaCl溶液,至低滲溶液中完全破裂,結果見圖1。低氧促使紅細胞在高于5.2 g/L濃度的NaCl溶液中破裂,紅細胞滲透脆性增加。Phlebotomy和Control溶血水平基本一致。Phlebotomy、Control紅細胞在NaCl溶液中起始溶血的濃度為5.2 g/L,Hypoxia紅細胞在NaCl溶液中起始溶血的濃度為6.0 g/L。結果見表2。

Table 2 Hemolysis of different tube numbers in each group(%)

Figure 1 Hypoxia increases the osmotic fragility of erythrocytes,which can be relieved by phlebotomy

2.3 放血對紅細胞衰亡的影響

Hypoxia雄性大鼠紅細胞衰亡減少。表3顯示,低氧可以抑制紅細胞衰亡,經過放血治療,Phlebotomy紅細胞衰亡數量較Hypoxia顯著增加。流式結果顯示紅細胞衰亡:Hypoxia(0.07±0.01)與Phlebotomy(0.10±0.02)相比,P=0.001;Control(0.10±0.01)與Hypoxia(0.07±0.01)相比,P=0.001。

Table 3 Eryptosis was analyzed in different groups by flow cytometry

圖2顯示,放血可以促進紅細胞在低氧下的衰亡;圖3顯示,當紅細胞數量逐漸趨于正常狀態時,紅細胞衰亡數量逐漸減少。結果見表4,2 w(0.20±0.01)與3 w(0.15±0.02)相比,P=0.001;3 w(0.15±0.02)與4 w(0.09±0.02)相比,P=0.001。

(A)and(B)Rat erythrocytes binding Annexin V-FITC after phlebotomy in three group

(A)and(B)Rat erythrocytes binding Annexin V-FITC after phlebotomy during the first week to the fourth week

Table 4 Dynamic results of eryptosis by flow cytometry

2.4 放血對網織紅細胞的影響

圖4、表5顯示,網織紅細胞數量增加則新生紅細胞增加,隨之成熟紅細胞的數量增加,低氧和放血療法均可以刺激網織紅細胞增加,Hypoxia(0.04±0.01)與Phlebotomy(0.05±0.02)相比,組間差異無統計學意義。然而網織紅細胞Phlebotomy動態數據結果如圖4、表6,放血后網織紅細胞的增加始終維持在固定范圍,不會持續增加,1 w( 0.04±0.03)、2 w(0.05±0.04)、3 w(0.04±0.02)、4 w(0.06±0.03)組間差異無統計學意義。

(A)and(B)is reticulocyte in Different groups at the same time.(C)and(D)is Dynamic analysis of reticulocyte

Table 5 Reticulocyte in different groups by flow cytometry

3 討論

放血療法雖被應用于相關疾病治療[2],但目前針對其作用機制并無明確說明。本研究基于前期研究基礎,提出放血療法可改善低氧對紅細胞衰亡的抑制作用。

紅細胞在長期慢性低氧環境下由代償性增加逐漸轉變為過度增加,課題組前期研究發現慢性低氧促進新生紅細胞增加、抑制成熟紅細胞衰亡。同時新生紅細胞增加,紅細胞數量和血紅蛋白含量不斷增加,紅細胞比容增加,血液粘稠致血流速度緩慢,加重機體微循環障礙及其他癥狀[3]。而放血使紅細胞數量減少、紅細胞比容降低、血液黏滯度下降,從而改善機體微循環障礙。

在紅細胞的生命周期里,紅細胞需要不斷經受血流的高壓沖擊,經過微小血管時不斷被擠壓,此過程中的紅細胞需要具有高度的變形性和結構的完整性。慢性低氧延緩紅細胞程序性死亡致衰老的紅細胞增加,數量增加致細胞結構不規則、紅細胞脆性增加、抵抗力減弱,在血流的沖擊和微血管的擠壓下,細胞的結構受到破壞,可塑性降低[4]。本研究結果顯示,經放血干預后,紅細胞變形能力增強、脆性降低,功能恢復、抵抗力增加,在運輸過程中不易被破壞,更易通過微小血管完成物質交換。

雖然放血可以促進紅細胞衰亡,但適當的放血并不會持續增加紅細胞的衰亡。針對放血療法,不論是治療高原紅細胞增多癥、真性紅細胞增多癥或其他疾病均效果明顯[5,6],放血排出的不止是成熟紅細胞,同時還包括各個階段的未成熟紅細胞,機體感應到未成熟紅細胞減少,會自發生產紅細胞,紅細胞會代償性增加。網織紅細胞是晚幼紅細胞脫核后的未成熟紅細胞,最終發展成成熟紅細胞,是衡量骨髓造血功能和新生紅細胞的重要指標[7]。本研究結果顯示,雖然Hypoxia和Phlebotomy網織紅細胞均有增加,但放血導致的紅細胞增加不同于低氧引起的紅細胞增加,低氧造成的紅細胞增加是一種長期、慢性的惡性循環,最終導致紅細胞越來越多。而放血組動態數據顯示,網織紅細胞的增加始終保持在一個范圍內,各組間差異無統計學意義。

綜上所述,放血療法可促進高原慢性低氧下雄性大鼠紅細胞的衰亡,降低慢性低氧對雄性大鼠紅細胞衰亡的抑制作用。同時放血不會持續刺激雄性大鼠紅細胞衰亡,也不會持續刺激雄性大鼠網織紅細胞增加。