低能量激光對人牙周膜細胞白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、骨保護素、核因子-κB受體活化因子配體表達的影響

湯盟 崔占琴 王陽陽 陳增國 李文靜 張翠萍

1.河北醫科大學第二醫院口腔正畸科，石家莊 050000；

2.河北醫科大學第二醫院口腔內科，石家莊 050000；

3.福建省龍巖市永定區醫院口腔科，龍巖 364100

糖尿病是當前較為常見的代謝性疾病[1]，患病人數逐年遞增。與此同時伴隨著人們對口腔健康意識的增強，對口腔頜面部審美要求的提升，在口腔正畸領域，越來越多的糖尿病群體尋求正畸治療。以往研究[2]證實，糖尿病患者體內的炎癥因子水平顯著升高，在正畸治療的過程中，這種異常水平的炎癥因子會造成骨改建過程中一系列信號轉導通路發生改變，引起骨質丟失，使骨吸收的量遠大于骨生成的量，導致骨改建失衡[3]。顯然，這無益于正畸治療過程中的牙齒移動及牙周組織的改建。

骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）系統是骨改建過程中重要的信號通路，且在人牙周膜細胞（human periodontal ligament cell，HPDLC）中有表達[4]。OPG/RANKL的比值可反應骨吸收的狀態，比值增大時表明骨吸收活動減弱，比值減小時提示骨吸收活躍。研究證實，糖尿病患者牙周組織的高血糖環境會上調RANKL的表達并下調OPG 的表達，使糖尿病患者的牙槽骨出現骨質疏松，影響正畸牙移動及整個正畸治療進程。

在正畸過程中，當矯治力施加于被移動牙后，分布于牙齒周圍的牙周膜細胞收到這一力學刺激信號后會分泌多種細胞因子，其中，炎癥因子的表達可以反映骨改建的程度及牙周組織的健康狀況。白細胞介素（interleukin，IL）-6 及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 是介導牙周組織炎癥過程中的重要因子，且對于牙周炎癥的評估具有較強的敏感性及特異性，并參與骨改建的調控。

低能量激光（low-level laser，LLL）具有殺菌、降低炎癥反應水平的作用，對創口愈合及骨組織愈合等均有良好的生物刺激作用，在牙周炎的治療方面應用廣泛[5]。但關于LLL 是否可以通過減輕糖尿病正畸患者牙周組織的炎癥，近而調控破骨通路中相關因子的表達，從而保證糖尿病患者正畸過程中骨代謝平衡的研究鮮有報道。因此本實驗通過體外培養HPDLC，分別用低糖型杜氏改良Eagle 培養基（Dulbecco’s modification of Ea‐gle’s medium，DMEM）和高糖型DMEM 模擬體內的正常血糖和高血糖水平，在給予LLL 干預后，使用自制的持續靜壓力裝置模擬正畸治療過程中牙齒壓力側受力情況，研究高糖環境下LLL 對受壓力刺激的HPDLC中IL-6、TNF-α及OPG、RANKL 表達情況的影響，以期探討LLL 療法能否對糖尿病患者正畸治療過程中的骨代謝紊亂情況產生影響，為糖尿病人群正畸治療過程中骨改建的調控提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑

DMEM（GIBCO 公司，美國），青霉素/鏈霉素溶液（上海碧云天生物科技有限公司），胎牛血清（PAN 公司，德國），0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（BI公司，以色列），CK19（杭州華安生物技術有限公司），通用型SP 試劑盒（上海中杉金橋生物技術有限公司），細胞凍存液（上海雅酶生物醫藥科技有限公司），人OPG、RANKL、IL-6、TNF-α 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELI‐SA）試劑盒（上海愛萌優寧生物技術有限公司）。

1.2 HPDLC的取材及培養

HPDLC 取材自就診于河北醫科大學第二醫院口腔頜面外科12~18周歲患者因正畸減數治療而拔除的健康前磨牙，所有患者無全身系統性疾病，所取牙齒牙周狀況良好，無齲病及其他牙體牙髓疾病，取材前已事先告知患者所取牙用途，并取得患者及家屬知情同意，同時獲得河北醫科大學第二醫院倫理委員會批準，倫理編號為（2022-R752）。牙脫位后，在無菌條件下取材，采用組織塊法進行HPDLC 的原代培養，取傳代第4 代的HPDLC用于后續實驗。

1.3 HPDLC組織來源鑒定

取傳代第4 代生長狀況良好的HPDLC 制作細胞爬片，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫組織化學染色，鑒定其組織來源。

1.4 HPDLC生長曲線的繪制

將第4 代HPDLC 消化離心后制成細胞懸液，調整細胞密度以每毫升3×104個，接種于24 孔板中，每孔1 mL，置于CO2細胞培養箱內培養，24 h后隨機取3孔細胞進行計數，求取平均值，同一時間點連續計數8 d，最后進行細胞生長曲線的繪制。

1.5 實驗分組

根據實驗設計，將HPDLC 隨機分為A、B、C、D 組。A 組：低糖型DMEM+壓力刺激；B 組：高糖型DMEM+壓力刺激；C 組：低糖型DMEM+LLL 照射+壓力刺激；D 組：高糖型DMEM+LLL照射+壓力刺激。C、D 組根據激光能量密度值的不同又分為1 組和2 組，其中C1、D1 組的能量密度值為3.75 J/cm2；C2、D2 組的能量密度值為5.625 J/cm2。分別在0、12、24、48、72 h 共5 個時點定時收集細胞培養上清，每個時點采集3 個樣本。

1.6 LLL照射

本實驗采用pilot-半導體激光儀，波長為810 nm，光纖直徑400 nm，無線頻率2.46 Hz，功率100 mw，光斑面積9.6 cm2。參照以往文獻[6]結果，照射時間=能量密度/功率密度。對C1、C2、D1、D2 組細胞在壓力加載前進行LLL 照射，為避免激光散射對實驗結果造成的影響，只選擇6孔板對角線上的2 孔（圖1 中紅色標記處）進行細胞接種實驗，6 孔板相鄰孔間用4%臺盼藍染液（圖1中藍色標記處）進行分隔，并在6孔板底鋪置不透光黑紙，整個操作過程在暗室中進行。

圖1 LLL照射HPDLC的裝置Fig 1 LLL therapy device for HPDLCs

1.7 細胞靜壓力加載裝置

本實驗參考黃生高等[7]的機械壓力模型構建方法，沿用本課題組原持續靜壓力加載裝置[8]如圖2所示，用以模擬正畸治療時壓力側牙周組織的受力情況。該裝置主要由圓形玻璃片（規格為直徑30 mm，厚4 mm，密度2.5×103kg/m3）加載在鋪滿單層HPDLC 的平底6 孔板上組成。細胞所受壓力計算公式：P=ρh，其中P 為細胞所受壓力，ρ為玻璃密度，h 為玻璃厚度。參照以往文獻[2]報道，本實驗所使用的壓強值為 2 g/cm2。

圖2 HPDLC 持續靜壓力加載裝置Fig 2 Static mechanical pressure sketch map of HPDLCs

1.8 LLL與壓力刺激干預HPDLC

取生長狀態良好的第3 代HPDLC，經胰酶消化離心后用于實驗，以每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔板對角線位置的2 個培養皿中。接種完畢后，將6 孔板移至CO2培養箱內培養24 h，次日對各孔細胞進行換液處理，其中A、C 兩組仍使用含雙抗和20%FBS的低糖型DMEM 培養基進行換液，B、D 兩組更換為含雙抗和20%FBS 的高糖型DMEM 培養基進行換液，2 d 后再次重復上述方式進行換液，每次換液后于鏡下觀察細胞生長情況，待細胞生長接近平底6孔板的板底時，按上述分組給予相應的激光干預和壓力刺激，分別在0、12、24、48、72 h 共5 個時點，定時進行細胞培養上清液的收集并記錄。按照實驗設計，計時收集HP‐DLC 培養液后在1 000 r/min 下離心10 min，取上清液，分裝后于-20 ℃冰箱進行保存，待所有上清液收集完畢，統一將收集的上清液解凍并用ELI‐SA 試劑盒檢測各組IL-6、TNF-α、OPG、RANKL的表達情況。

1.9 統計學分析

應用 SPSS 22.0 軟件包進行統計學分析，實驗所得數據均以平均數±標準差表示，使用t檢驗方法進行各組間均數的兩兩比較，P＜0.05 被視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牙周膜細胞的原代培養結果

在原代細胞的培養中，最快5~7 d 即可在顯微鏡下看到細胞從組織塊周圍爬出，慢的則需要20 d左右。圖3A所示為HPDLC原代培養10 d，鏡下可見爬出的細胞胞體形態為長梭形，胞漿透明，胞質豐富，胞核居細胞中央，呈圓形或橢圓形，包含核仁；大約20 d 可見細胞生長至培養瓶底的80%，如圖3B 所示為HPDLCS 原代培養21 d，此時即可對細胞進行傳代培養，傳代后的細胞生長速度較快，約4~5 日即可進行下一次傳代；圖3C所示為HPDLCS傳代3代鏡下所見。

圖3 HPDLC的培養 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 3 Culture of HPDLCs Inverted phase contrast microscope × 100

2.2 牙周膜細胞來源鑒定結果

細胞經HE 染色后，鏡下觀察如圖4A 所示：細胞呈長梭形或多角形，胞核呈圓形或橢圓形，藍染嗜堿性，內含1~5個核仁，胞漿豐富紅染嗜伊紅。免疫組織化學染色鏡下可見：抗角蛋白染色如圖4B 所示呈陰性，胞漿未見染色；細胞抗波形絲蛋白染色如圖4C 所示呈陽性，胞漿棕黃色。綜上判斷細胞符合間充質來源的細胞特征，并結合所取組織部位可判定為所培養細胞為HPDLC。

2.3 細胞生長曲線

將細胞接種于24孔板，觀察細胞的生長狀態，鏡下見細胞生長狀態良好。根據細胞生長狀況繪制如圖5所示的細胞生長曲線，繪制出的生長曲線接近S 形，整個生長周期分為3 個階段，分別為：停滯期、對數生長期和平臺期。接種后的1~2 d，細胞生長較緩慢，未見明顯增殖；3 d 后細胞生長迅速進入對數生長期；生長至7 d，細胞增殖速度減慢，細胞間出現生長抑制，細胞的增殖進入平臺期。整個過程符合體外培養細胞的生長規律。

圖5 HPDLC的生長曲線Fig 5 Grow curve of HPDLCs

2.4 各組炎癥因子的蛋白表達

各組炎癥因子IL-6、TNF-α 的表達水平如圖6所示，由圖可見這兩者的蛋白濃度均隨時間逐漸上升。

圖6 各組炎癥因子的表達情況Fig 6 The expression of inflammatory factors in each group

各組IL-6的表達檢測結果如表1所示。各組組間經兩兩獨立樣本t檢驗可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2 組（P＜0.05）和B 組與D1、D2組（P＜0.01）的差異均有統計學意義。

表1 ELISA 檢測各組IL-6蛋白的濃度表達情況Tab 1 The expression of IL-6 protein was detected by ELISApg/mL

對各組組內的不同時點采用配對樣本t檢驗，統計結果顯示：A 組0 h 與12、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48、72 h；B 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48 h；C1 組0 h與24、48、72 h，12 h與48、72 h；C2組0 h與12、72 h，12 h 與72 h，24 h 與48 h；D1 組0 h 與48、72 h，24 h與48、72 h；D2組0 h與24、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與72 h 間比較的IL-6 蛋白濃度差異均有統計學意義（P＜0.05）。

TNF-α 的蛋白表達情況如表2 所示，各組經組間兩兩獨立樣本t檢驗可知，12 h 后組間比較，A組與B、C1、C2組（P＜0.05）和B組與D1、D2組（P＜0.01）間的差異均有統計學意義。

表2 ELISA 檢測各組 TNF-α蛋白濃度表達Tab 2 The expression of TNF-α protein was detected by ELISApg/mL

針對各組組內不同時點采用配對樣本t檢驗進行差異性檢驗，統計結果顯示：A 組0 h 與24、72 h，12 h 與48、72 h，48 h 與72 h；B 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與72 h，48 h 與72 h；C1 組0 h 與48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與72 h，48 h 與72 h；C2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h與72 h；D1 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；D2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h 間比較的TNF-α 蛋白濃度差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 各組骨改建相關因子的蛋白表達

各組骨改建相關因子的蛋白表達如圖7 所示，其中OPG 蛋白濃度變化如圖7A所示，總體呈現先上升后下降的趨勢，以24 h 為界，在0~24 h 內均呈現上升趨勢，24 h 后逐漸下降；RANKL 蛋白濃度變化如圖7B 所示，各組RANKL 蛋白濃度總體呈逐步上升的趨勢；OPG/RANKL蛋白濃度的比值變化如圖7C 所示，各組OPG/RANKL 蛋白濃度比值總體呈現逐步下降的趨勢。

各組OPG 蛋白濃度表達如表3 所示，經組間兩兩獨立樣本t檢驗可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2組和B組與D1、D2組間的差異均具有統計學意義（P＜0.05）。

此外，對各組組內的不同時間點采用配對樣本t檢驗進行差異性檢驗，結果發現：A 組0 h 與12、24 h，12 h 與24 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；B 組0 h 與12、24、48 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；C1 組0 h 與12、24、48 h，12 h 與24 h；C2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48 h，24 h 與72 h，48 h 與72 h；D1 組0 h 與24、72 h，24 h 與72 h；D2 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、72 h，24 h與72 h 間的OPG 蛋白濃度差異有統計學意義（P＜0.05）。

各組RANKL 的蛋白濃度表達如表4 所示，經組間兩兩獨立樣本t檢驗可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2組和B 組與D1、D2組的差異均具有統計學意義（P＜0.05）。針對各組組內的不同時點采用配對樣本t檢驗可知，A、B、C1、D2 組不同時間點RANKL蛋白濃度差異均具有統計學意義（P＜0.05）；C2 組0 h 與24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h；D1組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h 間比較，RANKL 蛋白濃度的差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表4 ELISA 檢測各組 RANKL 蛋白濃度表達Tab 4 The expression of RANKL protein was detected by ELISApg/mL

各組的OPG/RANKL 蛋白濃度比值如表5 所示，經組間兩兩獨立樣本t檢驗可知，12 h 后組間比較，A 組與B、C1、C2組和B 組與D1、D2組的差異均有統計學意義（P＜0.05）。

對各組組內的不同時點采用配對樣本t檢驗，其中A、B、D2組組內各時點間OPG/RANKL蛋白濃度比值差異均有統計學意義（P＜0.05）。C1 組0 h 與24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h與48、72 h；48 h 與72 h；C2 組0 h 與24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h 間OPG/RANKL 比值的差異具有統計學意義（P＜0.05）。D1 組0 h 與12、24、48、72 h，12 h 與24、48、72 h，24 h 與48、72 h，48 h 與72 h 間OPG/RANKL比值的差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

在正畸牙移動的過程中，位于牙根與牙槽骨之間的牙周膜將加載在牙齒上的力傳遞至牙槽骨上，而接收到這一力學信號的牙周組織會發生一系列的重塑和改建，表現為與牽引力方向相同的受壓一側的牙槽骨發生吸收，與牽引力方向相反受牽張的一側出現骨質新生。這是正畸治療過程中的生理學基礎。牙周膜細胞作為牙周膜的主要效應細胞，具有向各種細胞分化的潛能，在受到外力刺激時會分泌多種細胞因子參與骨改建的調控，這是組織重塑與改建的生物學基礎。

OPG/RANKL/RANK 系統在骨改建的過程中發揮重要作用，參與調控破骨細胞的形成、分化和成熟。RANKL和OPG主要由成骨細胞譜系中的細胞產生。對破骨細胞的生成分化起抑制作用。RANK 位于破骨細胞前體的細胞膜上，在破骨細胞的形成中發揮重要作用。RANKL 通過與破骨細胞前體上的同源受體RANK 結合，觸發破骨細胞前體分化為多核破骨細胞，從而導致骨吸收。這種相互作用可被RANKL 的誘餌受體OPG 所阻斷，OPG 通過競爭性結合RANKL 從而阻止RANKL 與其受體RANK 結合來調節過度的骨吸收[4,9-11]。因此，OPG與RANKL的比例關系對于正常骨改建的維持具有重要意義。該比值減小時提示破骨細胞分化增多，骨吸收活躍。該比值增大時，破骨細胞的分化減少，骨吸收反應被抑制，故OPG/RANKL 的比值是評估正畸治療過程中骨吸收的客觀指標之一。

糖尿病作為常見的代謝性疾病，以血液中出現的較高水平的血糖濃度為其主要特征，這種異常的高血糖狀態會干擾正常的機體代謝，如引起糖、脂肪和蛋白質等的代謝紊亂，另一方面會影響心血管系統、神經系統、腎、眼等器官的功能障礙。對于口腔的影響主要表現為對牙周組織炎癥反應的促進作用。糖尿病患者血糖水平的升高會干擾微循環系統正常運行，影響正常血液循環，造成組織缺氧，且會加強血小板的黏附和聚集，降低抗凝因子水平，紅細胞脆性的增加會進一步引起組織缺氧，損害血管內皮，為細菌及其毒素的入侵創造了條件[12-14]。相關的研究[15]證實，糖尿病與牙周炎之間存在雙向促進關系。高水平的血糖環境會造成晚期糖基化終末產物（advanced gly‐cation end product，AGE）的增加，AGE 通過與其多配體受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）結合，激活AGE/RAGE 通路引發免疫應答，使得IL-6、TNF-α等大量炎癥因子釋放，從而引發或加重牙周組織的炎癥反應。在眾多的炎癥因子中，IL-6 及TNF-α 在介導牙周炎癥的過程中發揮重要作用[16-18]，對牙周炎的評估具有較強的敏感性及特異性。以往的研究[19]發現，糖尿病患者牙周組織IL-6 及TNF-α 的表達顯著升高。IL-6 是由免疫細胞分化形成的一種多功能的細胞因子，可誘導破骨細胞的骨吸收反應。在炎癥性牙周組織中IL-6 水平顯著升高。Irwin 等[20]的研究顯示，IL-6與牙周組織的破壞密切相關。Yakovlev等[21]對青少年人群的牙周炎進行研究發現，在其齦溝液中也檢測到了IL-6 水平的升高。TNF-α 是破骨細胞激活因子，可誘導破骨細胞分化, 在低濃度條件下即可明顯增強破骨細胞形成[22-23]。在體外實驗中發現，TNF-α 可能會抑制OPG 合成，進而導致骨量減少。Takeichi 等[22]研究發現，在慢性根尖周炎的根尖周病變中檢測到TNF-α，TNF-α 會刺激炎癥和骨吸收的發生。Gaspersic 等[23]認為，TNF-α 對大鼠實驗性牙周炎的進展有促進作用。Lee 等[24]報道TNF-α 在牙周炎的齦溝液中增加，促進牙槽骨吸收。因此本研究選取IL-6、TNF-α 及OPG、RANKL 這4 個細胞因子作為檢測指標對骨改建水平進行評估。

LLL 又稱低強度激光或弱激光等，通常其輸出功率小于250 mw，常用的波長范圍為600~950 nm[25]，常見的He-Ne激光、半導體激光都屬于此類。利用半導體作為增益介質的激光器稱為半導體激光，鋁、鎵、砷、銦化物等是常見的半導體激光介質，不同的介質也決定了激光的波長，常見范圍在800~980 nm。本實驗中所用激光為半導體激光，其良好的組織穿透性和熱效應使其在臨床中獲得了廣泛的應用，半導體激光能被內源性發色團如血紅蛋白和黑色素吸收，它對血紅蛋白的吸收率最高，在有血液存在的情況下表現最好，且體積小巧，操作便捷，故為當前在牙周組織疾病尤其是牙周炎的治療中應用最廣泛的一種LLL 療法[26]，其中本研究所應用的810 nm 的鎵鋁砷激光器和980 nm 的銦鎵砷化激光器為半導體家族中應用最廣泛的2種。

LLL 已經過一系列的體內和體外的研究證實有緩解牙周組織炎癥的作用，為探究LLL 能否通過減少糖尿病患者的牙周組織炎癥反應，降低相關炎性因子的表達，進而抑制其對OPG/RANKL/RANK 信號通路的不良影響導致的骨代謝異常。本研究通過體外培養HPDLC，在體外持續靜壓力模型上模擬臨床正畸治療過程中壓力側的HPDLC受力情況，在加力前給予LLL 干預，探究在高糖環境下LLL對受壓力刺激HPDLC 的IL-6、TNF-α、OPG、RANKL 表達的影響，以期探討在臨床中是否可以應用LLL 對糖尿病正畸患者治療過程中的炎癥反應和骨改建進行調控。

本研究采用組織塊法體外培養HPDLC，選擇傳代第4代的細胞進行試驗。實驗所用細胞加力裝置沿用了本課題組之前的持續靜壓力加載模型，此種方法的壓強值只受玻片自身厚度及密度的影響，故操作過程中易于控制所加載力值的大小，壓力持續加載，整個實驗過程中可避免對細胞生長環境的改變，且板底細胞受力均勻。由于玻片自身透明，所以整個操作過程中，可隨時在鏡下觀察細胞的狀態，亦不會影響到細胞正常生長狀態下的溫度及濕度，操作簡便，可以模擬臨床中正畸加力后壓力側牙周組織的受壓狀況。黃生高等[7]和張建興等[27]采用四唑鹽比色（methyl thiazo‐lyl tetrazolium，MTT）法進行檢測了壓力對于細胞的毒性損傷及增值率的影響，對比壓力培養組與對照組之間的吸光度值（optical density，OD），發現只有4 g/cm2的較大應力組會對細胞毒性產生影響，其余組細胞損傷均在可接受范圍內，可以得知玻片產生的壓力對于細胞生長并未產生明顯損傷。本實驗設定的持續靜壓力值為2 g/cm2，研究認為此時壓力側的骨改建最為活躍，細胞狀態較佳。較小的力值不利于相關因子的充分表達，過大的壓力反而會使相關的細胞因子表達水平下降，這可能是由于過大的應力超過了細胞所能承受的力值范圍，會干擾細胞的正常生理功能。也再次印證了正畸臨床過程中，過大的應力加載不僅不會加快牙齒的移動，反而使牙齒的移動發生停滯。這提示臨床醫生在接診患有糖尿病的正畸患者時，應重視治療過程中的施力方式，避免因正畸矯治力過大而引起牙槽骨的異常吸收、牙齒松動甚至脫落，所以本研究最終設定的持續靜壓力值為2 g/cm2。

關于LLL 治療的參數設定，國內外學者做過大量的研究[28-30]，認為波長在600~950 nm 的波長范圍內，激光能發揮較好的生物刺激作用，激光的透射量接近最大值，此外，紅外輻射在血紅蛋白和水中的吸收系數較低，在組織中的穿透深度較高[31]，本實驗所用的pilot 砷化鎵鋁半導體激光（810 nm）即在此波長范圍內。對于LLL 治療效應影響較大的另一重要參數為能量密度，能量密度較小時會產生正向刺激作用，當能量密度超過一定范圍，則會產生抑制作用。Wang 等[5]使用Nd:YAG 激光對炎癥狀態下的人牙周膜干細胞（hu‐man periodontal ligament stem cell，HPDLSC） 進行照射，結果顯示8 J/cm2的LLL 可有效調節HP‐DLSC 的成骨潛力，4~8 J/cm2的LLL 能促進HP‐DLSC中的氧化應激水平，降低HPDLSC中炎癥細胞因子的表達和活性氧基團或分子（reactive oxy‐gen species，ROS）水平；16 J/cm2的LLL 可顯著抑制HPDLC 的增殖和成骨分化，并促進炎性細胞因子和ROS水平。Rigi-Ladez等[32]用波長為810 nm和940 nm 的二極管激光器對牙周膜干細胞進行照射后發現，2 種波長的LLL 均在2.5 J/cm2組時細胞有顯著增殖。后續的學者[6]研究發現，LLL 治療的理想能量密度值為2~12 J/cm2，能量密度計算公式：（功率×時間）/光斑面積，通過公式可知，由于6孔板底面積是確定的，所以只能通過改變照射時長來調整能量密度值?？紤]到在實際操作過程中6孔板底面積及接受LLL照射時長等因素，本實驗設定2 個能量密度值分別為3.75、5.625 J/cm2，以探究不同能量密度值對骨改建的影響是否存在差異。

根據本課題組以往的研究[8]發現，HPDLC 在正常培養條件下僅有少量的OPG、RANKL 表達分泌，而較低濃度的因子表達不足以引起骨改建反應的發生，故本研究未設定空白對照組。以往的文獻[2]報道，高糖環境及壓力刺激會促進HPDLC炎癥因子IL-6、TNF-α的表達。本研究發現，當給予HPDLC 持續靜壓力刺激后，IL-6、TNF-α 濃度隨時間逐漸上升，與低糖環境組相比高糖環境組中，IL-6、TNF-α 增長的趨勢更加明顯，在24 h 前增幅較大，24 h 后緩慢增長。高水平表達的IL-6、TNF-α 會進一步刺激OPG 的下降和RANKL 的上升，與此同時，同時點OPG/RANKL 的比值較正常組明顯降低，這表明高糖環境會促進壓力側骨吸收。有學者[33]曾進行動物實驗，建立大鼠牙移動的模型，最終通過顯微CT 對牙移動后壓力側的牙周組織切片觀察發現，在對被移動牙進行施力的過程中，OPG、RANKL 均呈現增加趨勢，且二者均表現為受壓早期增加，后期出現降低，相較之下RANKL 對這種刺激的反應出現更早，即RANKL 的表達峰值先于OPG。另外的研究[34]則發現，在給予HPDLC 壓力刺激后，OPG 的表達出現下降，RANKL 的表達升高。劉長庚等[35]對在不同時段正畸力作用下的HPDLC 進行提取和培養，利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對壓力區的OPG 進行檢測發現，在牙移動的最初，幾乎不能檢測到OPG，牙移動3 個月時OPG 表達達到高峰，牙移動結束時該因子又出現下降，這表明OPG 在牙齒移動過程不同階段的表達，呈現先升高后降低的趨勢。本研究發現，OPG 蛋白濃度以24 h 為界，24 h 之前OPG 呈現上升趨勢，24 h 后OPG 的濃度隨時間逐漸下降。RANKL 的蛋白濃度在0~72 h 之間隨時間逐漸上升，且在12 h后增幅明顯。OPG/RANKL的比值隨時間呈下降趨勢，可見在以往的研究中關于壓力刺激下HPDLC 分泌OPG 的變化并未有明確的規律。相較于OPG 的表達，OPG/RANKL 的表達可能更具有客觀性，更能表達牙周組織改建的狀態。本研究發現，當給予實驗組LLL 干預后，會降低炎癥因子IL-6、TNF-α 的表達，并上調OPG，下調RANKL 的表達，以對抗高糖環境產生的影響，從而使OPG/RANKL 的比值趨近于正常對照組，表明LLL 可拮抗高糖環境引起的炎癥因子水平升高以及OPG/RANKL 的比值下降。實驗中還觀察到，在3.75~5.625 J/cm2這一能量密度范圍內，隨LLL 劑量的增大，其產生的調控作用增強，表明在一定能量密度范圍內，LLL 的作用發揮隨劑量增加而增強，由此可以得出相關的細胞學結論，即LLL 具有降低高糖環境中受壓力刺激的HPDLC炎癥因子IL-6、TNF-α分泌水平的作用，并可參與對骨改建相關因子OPG與RANKL的調控。

盡管有相當多的體外實驗、動物模型實驗和臨床對照實驗證實了其有效性，但在臨床應用LLL 的過程中還存在很多爭議，主要原因是目前針對LLL 發揮效應的真正機制尚未完全清楚還有待進一步的研究。不同的參數設定會影響LLL 效應的發揮，例如波長、功率、能量密度、照射時間、頻次及相關劑量等，同時實驗對象和操作方法的差異也會對實驗結果產生影響。與此同時，不同的實驗對象和操作方法也需要對激光的波長進行進一步相應的探索，這是本實驗需要下一步需要探索的目標。本研究通過體外實驗初步證實了LLL 對于高糖環境下受靜壓力刺激的HPDLC 的炎癥因子及相關的骨改建因子有調控作用，由此可以推測，在臨床中，可以嘗試應用LLL 來減輕糖尿病患者正畸治療過程中牙周組織的炎癥反應進而調節骨代謝失衡。為LLL 應用于糖尿病患者的正畸治療提供理論依據及臨床指導。在實驗設計方面本研究尚存在一定的不足，在對LLL 療法的參數設定時沒有探究更大范圍的能量密度值對實驗結果產生的影響。所以能夠根據治療需要制定出標準化、統一化、規范化的參數，對于LLL療法在臨床中的應用具有重要意義，也需要進一步探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。