慢性牙周炎與慢性阻塞性肺疾病的潛在共同分子機制及其轉錄因子初探

張晨 候珍珍 宗穎睿

鄭州大學第一附屬醫院口腔預防科，鄭州 450052

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是一種發生在牙周支持組織，由菌斑為始動因子，多種因素共同作用的慢性炎癥性疾病[1]，CP 與全身系統性疾病，如慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）等密切相關[2]。COPD的特征為持續性呼吸道癥狀和進行性氣流阻塞，是全球第三大死亡原因[3]。由于缺乏有效的生物標記物，較難進行早期診斷。二者都是慢性進行性炎癥疾病，同時具有吸煙等共同危險因素，因此有學者[2]認為，二者可能存在一定的因果關系，且具有共同的病理生理過程，但兩者共同的基因調控機制尚不清楚。轉錄因子（transcription factor，TF）作為一種在特定調控序列上結合DNA的蛋白，可通過反轉錄激活或抑制轉錄的蛋白質，進而影響細胞完整性或機體穩態[4]，具有巨大的治療潛力，但相關研究較少。

本研究利用CP（GSE10334 和GSE16134）和COPD（GSE76925）的RNA-seq 數據進行生物信息學分析，在轉錄組水平上揭示二者的cross-talk基因及其相關通路，并尋找了轉錄因子，為二者的生物學機制提供了新的見解，為開發診斷和治療靶點的初步研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 數據收集

從美國國立生物技術信息中心（national cen‐ter for biotechnology information，NCBI）基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數據庫下載CP和COPD相關基因表達芯片數據集：CP的數據集為GSE10334 和GSE16134，COPD 的數據集為GSE76925（表1）。下載GPL570 平臺和GPL10-558 平臺的注釋信息，對數據集進行基因定位，并通過R 語言（v4.2.1）GEOquery 包的“exprs”函數獲取各數據集的表達矩陣。

表1 CP和COPD的數據集Tab 1 Datasets for CP and COPD

1.2 DEG分析

對病例組和對照組進行DEG 分析。使用R 語言（“limma”包），均設置P＜0.05 有統計學意義。GSE10334 和GSE16134 設置|log2FC|>1[5]， GSE-76925 數據集中的log2FC 值較低，故設置|log2FC|>0.5[6]。用R 語言中的“VennDiagram”包篩選GSE-10334、GSE16134 與GSE76925 的DEG 交叉基因，即為潛在的cross-talk基因，并繪制韋恩圖。

1.3 功能聚類分析

對潛在cross-talk 基因進行基因本體（gene on‐tology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。使用R 語言“clus‐terProfiler”包，P值矯正方法采用Benjamini &Hochberg（BH）。在CP 相關數據集GSE10334 和GSE16134 中分別進行|log2FC|相關的功能聚類分析，用R 語言“chordDiagram”包將結果繪制成弦圖。

1.4 蛋白質相互作用網絡分析

使用STRING 線上數據庫（https://cn.string-db.org/），設置置信度得分閾值為0.4，對潛在crosstalk 基因進行差異蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析，并在Cytoscape 軟件（版本3.9.0）中可視化。

1.5 核心基因的篩選

使用Cytoscape 的CytoHubba 插件和MCODE插件進一步篩選上述基因。選擇4 種拓撲分析算法：最大集團中心性（maximal clique centrality，MCC）、最大鄰域分量（maximum neighborhood component，MNC）、度數（Degree）和邊緣滲透分量（edge percolated component，EPC），分別選取前10 位基因。通過MCODE 進行模塊劃分（De‐gree cutoff=2，k-Core=2，node score cutoff=0.2，Max. Depth=100），選取分數最高的2 個模塊中的全部基因。將上述結果取交集，得到核心基因，進行功能類聚分析。

1.6 轉錄因子的預測

利用Cytoscape 中iRegulon 插件預測上述核心cross-talk 基因的重要TF。選擇10 k Motifs 數據庫（PWM 庫），設置富集分數閾值為3.0，AUC 值閾值為0.03，排序閾值為5 000，標準化富集分數（normalized enrichment score，NES）為根據PWM庫富集出來計算的得分，選擇NES≥7 的轉錄因子構建調控網絡。

2 結果

2.1 DEG的篩選

對3個組織樣本數據集進行數據分析，根據設定的閾值進行篩選，GSE10334 包含63 個CP 和27個侵襲性牙周炎患者，共183 個病例樣本和64 個對照樣本，共篩選出164 個DEG，其中119 個上調，45 個下調；GSE16134 包含65 個CP 和55 個侵襲性牙周炎患者，共241 個病例樣本和69 個對照樣本，共篩選出208個DEG，其中154個上調，54個下調；GSE76925 有111 個COPD 病例樣本，40個對照樣本，共篩選出1 408 個DEG，其中557 個上調，851 個下調（表1）。DEG 的火山圖如圖1A~C 所示。將得到的DEG 取交集，共有21 個潛在cross-talk基因（圖1D）。

圖1 CP和COPD的火山圖及其DEG的韋恩圖Fig 1 Volcano plots of CP and COPD, Venn diagram of DEGs

2.2 潛在cross-talk 基因的功能聚類分析和其PPI網絡

本研究將21 個潛在cross-talk 基因進行GO 分析和KEGG 分析，圖2A 顯示前3 位的結果：最顯著富集的生物學過程為整合素激活（GO：00336-22，校正P=8.71×10-4），細胞定位顯著富集在細胞外圍（GO：0009897，校正P=0.026），最顯著富集的分子功能是CXCR3 趨化因子受體結合（GO：0045236，校正P=0.003）。KEGG 通路最主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用（hsa04060，校正P=0.007）。圖2B、C 分別展示了潛在crosstalk 基因及其在CP 相關數據庫GSE10334 和GSE-16134中的log2FC。

圖2 功能富集分析Fig 2 Functional enrichment analysis

STRING 線上數據庫構建的PPI網絡包括21 個節點和20 條邊，結果采用Cytoscape 軟件可視化（圖3）。篩選出連接最多的前10 個基因為CD19、IRF4、CD79A、CD27、TNFRSF17、SELL、POU-2AF1、CXCL13、FCRLA和CXCL12。表2顯示了4 種算法的PPI 網絡中前10 個基因的拓撲特征。MCODE 進行模塊劃分，第一模塊包含的基因為CD79A、FCRLA、CD19 和IRF4（得分為3.333），第二模塊包含的基因為CD27、SELL 和CXCL13（得分為3.000）。取交集后得到7 個核心基因為CD79A、FCRLA、CD19、IRF4、CD27、SELL 和CXCL13（圖4A）。

圖3 構建的PPI網絡Fig 3 Constructed PPI network

表2 PPI網絡中前10個基因的拓撲特征Tab 2 Topological characteristics of top 10 genes in PPI network

2.3 核心基因的功能聚類分析

將得到的7 個核心基因再次進行功能聚類分析，圖4 和表3 可見，顯著富集的生物學過程包括淋巴細胞分化（GO：0030098，校正P=7.38×10-4）、基于免疫受體體細胞重組的適應性免疫應答（GO：0030098，校正P=7.38×10-4）和B 細胞分化（GO：0030098，校正P=0.001）；細胞定位顯著富集在細胞外圍（GO：0009897，校正P=0.004）、脂筏（GO：0030098，校正P=0.019）和膜微區（GO：0030098，校正P=0.019）；最顯著富集的分子功能是肝素結合（GO：0008201，校正P=0.025）、糖胺聚糖結合（GO：0005539，校正P=0.025）和硫化合物結合（GO：1901681，校正P=0.025）。KEGG 通路富集分析最主要富集于原發性免疫缺陷（hsa05340，校正P=0.003）、B細胞受體信號通路（hsa04662，校正P=0.007）和細胞因子-細胞因子受體相互作用（hsa04060，校正P=0.060）。

表3 核心基因的GO分析和KEGG分析Tab 3 GO analysis and KEGG analysis of the hub genes

2.4 轉錄因子的預測結果

共得到7 個符合條件的主調控因子，分別為IRF4、ELF1、GSC、GATA1、PAX3、SRF 和PAX8，其中IRF4 的NES 最高（9.880），調控4 個目標基因（FCRLA、IRF4、CXCL13 和CD19）（表4）。

表4 核心基因的NESTab 4 The NES of hub gene

3 討論

Takeuchi等[2]通過一項基于900人、5年隨訪的隊列研究表明，CP 為COPD 的獨立危險因素，其嚴重程度與COPD 的風險正相關。本研究整合了CP和COPD的基因表達譜數據，通過分析其crosstalk 基因、富集生物學過程和相關通路，探討了二者潛在的共同關鍵分子機制。為了更準確地篩選模塊內的核心基因（hub 基因），本研究采用了4種不同的拓撲分析算法，最終結果表明，CD79A、FCRLA、CD19、IRF4、CD27、SELL 和CXCL13可能為連接CP 和COPD 的核心cross-talk 基因。這些基因的潛在相關性基于其在疾病樣本中的表達量。其中，CD79A、CD19和CXCL13在CP或COPD中的作用已被報道。同時，參與CP和COPD的通路可能包括原發性免疫缺陷、B細胞受體信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用?；诮Y果的多樣性及其復雜性，本文將集中討論這3條信號通路。

原發性免疫缺陷（primary immunodeficiency，PI）可以通過影響免疫系統器官和細胞（T 細胞、B 細胞和自然殺傷細胞等）的成熟、分化和功能，進而破壞細胞和體液免疫或非特異性防御機制，增加患者對自身免疫性疾病、感染和惡性腫瘤的易感性[7]。PI 常伴有組織壞死、潰瘍和細菌侵襲，導致早發性、侵襲性牙齦炎和牙周炎[8]。由于缺乏抗體，患者易發生上呼吸道和下呼吸道感染，且反復發作[9]。

雖然CP 的始動因子為牙菌斑，但宿主的免疫反應能影響其進展和嚴重程度，從而決定機體對CP 的易感性。固有和適應性免疫應答的性質和控制決定了宿主對細菌的應答方式。其中B 細胞是適應性免疫的重要組成部分，可以和活化的CD4+輔助性T 細胞協同產生可溶性抗體，在身體各個部位中和感染因子（體液免疫）[10]。B 細胞受體是由2 種跨膜蛋白（CD79A 和CD79B）結合免疫球蛋白M 組合而成的異源二聚體信號復合物[11]，識別抗原后可激活SRC 家族激酶、蛋白酪氨酸激酶和TEC 家族激酶，并招募與CD19 或BCAP 結合的脂質激酶PI3Kδ，進而激活相關基因的表達，這些基因可參與B 細胞增殖、分化、免疫球蛋白產生等[12]。

CD19 與CP 的促炎細胞因子緊密相關[13]，CD19+B 細胞是CP 的主要B 細胞成分之一[14]。B 細胞處于免疫系統和骨系統的核心位置，參與CP 的發生發展，其作用機制包括破壞細胞外基質、骨平衡調節［核因子κB 受體活化因子配體（recep‐tor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）-核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nu‐clear factor-κB，RANK） -骨保護素（osteoprote‐gerin，OPG）］，甚至可以作為破骨細胞樣細胞發揮吞噬作用[15]，RANKL-RANK-OPG 三聚體通過與內皮細胞、上皮細胞和破骨前體細胞相互作用，調節成骨細胞、血管生成和牙周袋形成。B細胞間相互作用釋放淋巴毒素（lymphotoxin，LT）和基質細胞，產生穩態趨化因子（CXCL13、CXCL12、CCL21 和CCL19）[16]。研究[17]表明，CXCL13 分泌細胞分布在B細胞區，負責B細胞趨化，與牙齦炎相比，牙周炎患者的牙周袋上皮下結締組織中含有更多的CXCL13 分泌細胞，其與B 細胞數量相關。Litsiou 等[18]檢測了COPD 患者肺濾泡，發現CXCL13 水平升高，并且與淋巴濾泡所占面積相關。B 細胞產生LT 并向CXCL13 趨化，CXCL13又增加B 細胞中膜結合型LT 的表達，進一步刺激CXCL13的產生。因此，本研究結合已被實驗驗證的結果可以得出，B 細胞受體信號通路可能為CP和COPD的潛在共同分子機制。

細胞因子在CP 和COPD 的進展過程中發揮關鍵作用，其作為內環境和驗證過程的中樞調節因子，可將組織細胞與淋巴細胞和輔助細胞群連接起來，從而影響機體的免疫反應。病變牙周組織中產生的細胞因子等促炎介質可通過血行轉移，增加機體的炎癥負擔，刺激肝臟產生C 反應蛋白、白細胞介素（interleukin，IL）6、轉鐵蛋白和淀粉樣蛋白A等，進而促進肺組織的炎癥反應[19]。代表性促炎細胞因子為IL-1 家族和IL-6 家族等，對淋巴細胞的促進和組織破壞具有多效性。其中，牙周炎的嚴重程度與患者齦溝液中的IL-1β 含量有關[20]。免疫小鼠和大腸桿菌相互誘導產生IL-1β，誘導輔助T 細胞（helper T cell，Th）1 和Th2 的增殖[21]，進而造成牙周病的發生。COPD 嚴重程度也與患者痰中的IL-1β含量有關[22]，IL-1β可顯著激活巨噬細胞，并分泌趨化因子、炎癥因子和基質金屬蛋白酶9[23]。另外IL-6 在牙周炎的起始期和急性期起關鍵作用，促進成骨細胞中受體激活因子的表達，進而促進骨吸收[24]。IL-6可與其他細胞因子協同作用，不僅參與先天免疫和后天免疫，而且參與COPD 的一些全身性特征和共病的惡化，例如胰島素抵抗、骨質疏松、內皮細胞功能受損和抑郁等[25]。綜上所述，CP 和COPD 可能存在IL-1和IL-6等相同的致病細胞因子。

轉錄因子TRF4 與cross-talk 基因的調控有關，干擾素調節因子可以調節先天和適應性免疫反應，促進炎癥反應以及調節免疫細胞分化[26]，可能促進了CP 和COPD 的發生發展。但具體作用尚未被證實，應深入研究相關轉錄因子，為各種疾病治療的潛在靶點開辟新的可能性。

通過對上述病理生理學中共同致病因子和信號通路的探討，筆者推測CP 和COPD 可能具有相同的分子機制，在疾病的發生發展中有一定的相關性。但由于樣本臨床資料的局限性，即未納入患者的年齡、性別、吸煙習慣和藥物治療等影響因素，并不能充分驗證這一推測，因此還需要進一步研究，如充分考慮樣本異質性，擴大樣本量，對二者人口學指標進行傾向性評分匹配后，進行前瞻性研究；利用單細胞測序技術，在單個細胞的層面上，通過對基因組學、轉錄組學、微生物組學和空間轉錄組學等研究明確二者的共同發病機制或潛在的轉化機制。無論如何，這提示醫師在臨床實踐中，共同認識、跨學科治療和預防這兩種疾病的必要性。

綜上，本研究初步表明核心cross-talk 基因（CD79A、FCRLA、CD19、IRF4、CD27、SELL和CXCL13）和轉錄因子TRF4 可能參與了CP 和COPD 共同分子機制，并討論了3 條可能的共同通路：原發性免疫缺陷、B細胞受體信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用。這將作為相關領域未來研究的基礎，為未來藥物開發和減輕二者轉化風險的研究提供新方向，但仍需進一步地實驗驗證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。