歐報春二型花柱的繁育特性研究

劉 柳,劉 艷,李金鳳,張 璐,張曉曼

(河北農業大學 園林與旅游學院,河北保定 071000)

二型花柱是由基因控制的花的多態性,根據柱頭與花藥位置的不同分為長花柱和短花柱,是一種特殊的雌雄蕊異位方式[1],有利于花粉的準確傳遞,促進異交, 避免自花授粉和和形態內授粉。自1583年在耳報春(Primulaauricular)和粉報春(Primulafarinose)中報道二型花柱現象以來,至少在28個由動物授粉的開花植物中發現過這種特殊的花部結構[2-5],這是植物長期繁育和對環境適應性進化的必然結果。二型花柱植物通常具有自交不親和性,但在不同植物中所表現的可育性不同。此外,不同花柱之間還常伴有花粉數量、花藥大小、顏色、柱頭的形狀、突起高度、密度、分布的差異性[6-8],二型花柱的研究是生態學的熱點之一。

歐報春(Primulavulgaris)是報春花科(Primulaceae)報春花屬(PrimulaL.)多年生草本花卉。歐報春全株具香氣,葉面皺,呈長橢圓形,株高10～15 cm,是報春花屬中花色豐富度最高、品種相對最多,且應用最為廣泛的植物,無論是在觀賞價值還是抗性方面都優于其他報春,具有良好的開發前景。目前,對歐報春的研究較少,且已有的研究主要集中在花色形成機理與遺傳[9-10]、栽培育種[11-14]、組培體系的建立[15-16]等方面,缺乏對歐報春二型花柱的花部形態特征、繁育特性等基礎性研究。本文探究了歐報春二型花柱花部特征差異和繁育特性,為二型花柱植物自交不親和機制的研究奠定基礎,對歐報春今后育種提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究供試材料于2021年5月栽培于河北農業大學溫室中(溫度維持在20～25 ℃)。2021年11月-2022年5月選取生長良好的歐報春植株進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 花部形態特征觀測

選擇處于盛花期的歐報春長花柱和短花柱各30株,每株選擇1個花序用游標卡尺分別測量花冠直徑、花冠筒高度、柱頭高度(從子房基部到柱頭頂部距離)、花藥高度(從子房基部到花藥頂部距離)、花筒中部直徑(花冠筒的最窄處)等形態特征, 并將測量的數據分別詳細記錄,單位精確到0.01 mm。

1.2.2 花粉、柱頭形態掃描電鏡觀察

選取處于盛花期的長花柱和短花柱各10朵,分別將花粉用導電膠粘在金屬臺上,噴金,鍍膜,于Prisma E型掃描電鏡中拍照,觀察和測量觀察花粉赤道面觀、極面觀、表面紋飾和網眼形狀,測量花粉極軸長(P)、赤道軸長(E)。同樣步驟觀察花柱,測量花柱直徑和柱頭乳突細胞長度,拍照。

1.2.3 花粉/胚珠比、花粉活力和柱頭可授性測定

選取處于花蕾期的(雌雄蕊成熟但未散粉)長花柱和短花柱各20朵。參照Cruden[17]的方法,摘取所有花藥,用1.0 mol/L HC1在60 ℃條件下水解去除花藥壁,制成2.5 mL的懸浮液。先吸取0.01 mL,制片,重復記數直至觀察完所有懸浮液,分別統計歐報春長花柱和短花柱的花粉量;在解剖鏡下用解剖針挑破子房壁統計胚珠數量。

花粉/胚珠比=該花的花粉總量/胚珠數量。

于上午9:00,分別取開花1,3,5,7,9,11,13,15 d的長花柱和短花柱花粉,用 TTC染色法來測定花粉活力[18]。

花粉活力=具有花粉活力花粉數/觀察花粉總數×100%。

將上述檢測花朵的柱頭用鑷子取下,用聯苯胺-過氧化氫反應液來檢驗歐報春柱頭的可授性[19]。參考孫建等[20]的分級標準,1級:少量氣泡,可授性低,標記為+/-;2級:氣泡較多,可授性中等,標記為+;3級:有大量氣泡,可授性高,標記為+/+。

1.2.4 雜交指數估測和雜交親和性測定

依Dafni[21]的方法,通過對歐報春成熟情況,性器官空間位置和花序直徑來估算歐報春雜交指數。

對歐報春的栽培種群進行人工授粉,設置6種授粉組合:(1) 同型自花授粉,每日上午8:00,分別選擇當天開放長花柱和短花柱的花朵,在未開放前套袋,7 d后揭開袋子,用潔凈的刷子蘸取同一朵花的花粉進行授粉并套袋,標記具體的授粉時間。(2)異株同型授粉,每日上午8:00,分別選擇當天開放長花柱和短花柱的花朵,未散粉前對母本去雄并套袋。父本花粉,選擇不同株的同型植株,未開花前進行套袋,待開花7 d后收集花粉用潔凈的刷子對母本進行授粉并套袋,標記具體的授粉時間和父母本。(3)異型花間授粉,每日上午8:00,分別選擇當天開放長花柱和短花柱的花朵,未散粉前對母本去雄并套袋。父本花粉,選擇異型植株,未開花前進行套袋,待開花7 d后收集用潔凈的刷子對母本進行授粉并套袋,標記具體的授粉時間和父母本。同株長花柱記作P,短花柱記作T,不同株長花柱記作P1,短花柱記作T1。每種處理做50個重復,結實后在解剖鏡下統計飽滿種子數。

為了觀察6種授粉組合授粉后花粉的萌發、花粉管的生長和進入子房的情況,于授粉后1 h,2 h, 4 h, 6 h,8 h,12 h,18 h,24 h,48 h,72 h取下各組合的雌蕊,裝入FAA溶液的離心管中處理24 h,放入70%的乙醇中進行儲存備用。取出雌蕊,用蒸餾水沖洗3～4次,將長花柱、短花柱雌蕊分別放入盛有2 mol/L、4 mol/L的NaOH溶液的離心管中,分別軟化60 min,30 min后取出,用蒸餾水沖洗,放入0.1%水溶性苯胺藍溶液中進行染色。采用常規制片法制片[22],用熒光顯微鏡觀察,測量花粉管長度和花柱長度,計算相對位置。

1.3 數據處理

試驗數據利用 SPSS 22.0進行數據處理分析,用Duncan法比較不同處理間差異,采用Excel匯總數據和制作圖表。

2 結果與分析

2.1 花部形態特征觀測

通過觀察花部結構的發現,歐報春為典型的二型花柱植物。長花柱柱頭高于花藥,在花冠口處可見(圖1,A、B);短花柱柱頭低于花藥,雄蕊在花冠口處可見(圖1,C、D)。

A. 長花柱花部形態;B.長花柱剖開圖;C.短花柱花部形態;D.短花柱剖開圖

由表1可知,長花柱的花冠直徑為3.86 cm,短花柱為3.74 cm, 長花柱大于短花柱0.12 cm, 差異不顯著;長花柱的花冠筒長度為1.43 cm,短花柱為1.55 cm,長花柱小于短花柱0.12 cm,差異顯著;長花柱柱頭高度為1.28 cm,短花柱為0.79 cm,長花柱大于短花柱0.49 cm,差異極顯著;長花柱花藥高度為0.83 cm,短花柱為1.35 cm, 長花柱小于短花柱0.52 cm,差異極顯著;長花柱花筒中部直徑為0.37 cm,短花柱為0.36 cm, 長花柱大于短花柱0.01 cm,差異顯著。綜上所述,長花柱和短花柱的相同花部之間存在差異。

表1 長花柱和短花柱的花部形態特征

2.2 花粉、柱頭觀察

歐報春的長花柱和短花柱花粉粒較小,并都以單粒的形式存在,形狀均為超長球形,因而不易從外形上將2種花粉區別開;花粉赤道面觀均為近橢圓形(圖2,A、C);極面觀均為近圓形(圖2,B、D);外壁紋飾為網狀雕紋;網眼形狀為密網紋;具有萌發溝;長花柱的極軸長和赤道軸長分別為15.62,17.09 μm,短花柱相對應各部分別為24.08,25.57 μm,長花柱均小于短花柱,呈極顯著差異(表1)。

A. 長花柱花粉, 標尺=5 μm;B.長花柱花粉, 標尺=10 μm;C.短花柱花粉, 標尺=10 μm;D.短花柱花粉, 標尺=10 μm;E.長花柱, 標尺=500 μm;F.長花柱, 標尺=200 μm;G. 短花柱, 標尺=500 μm;H.短花柱,標尺=200 μm。

長花柱的花柱直徑小于短花柱,呈極顯著差異(表1);歐報春柱頭表面未發現黏性物質,且分泌物較少,不易捕獲花粉(圖2,E、G);柱頭與花柱連接孔處較光滑,長花柱外壁為細微的網狀結構,短花柱為粗糙的網狀結構;柱頭表面均有乳突,長花柱柱頭的乳突細胞長度顯著大于短花柱(表1),因而容易固定短花柱所產生的較大花粉,短花柱柱頭的乳突較短(圖2,F、H),從而更容易固定長花柱花所產生的較小花粉。

2.3 花粉/胚珠比、花粉活力和柱頭可授性測定

歐報春長花柱單花花粉總量為18 425粒,短花柱為14 918粒,花粉數量差異不顯著(表2);長花柱胚珠數量為48.00,短花柱為44.08,胚珠數量差異不顯著;長花柱P/O比為384.20,短花柱為369.70,按Cruden的標準,歐報春的繁育系統屬于兼性異交類型。

表2 花粉-胚珠比值

由表3可知,不同開花時期長花柱和短花柱的花粉活力存在一定差異,花粉活力隨時間的變化相似。歐報春長、短花柱的花粉活力開花后均逐漸升高,在第7天時達到最高,分別為73.06%和79.90%,然后再降低,第15天時花粉失去活力。不同開花時期長、短花柱的柱頭可授性也存在一定差異,總體呈先升后降的趨勢。開花第1天,長花柱已具備中等程度的可授性,而短花柱可授性低;開花第7～11天時,長、短花柱均具備高可授性;開花第15天,長、短花柱的可授性均由高降為低。綜上所述,長花柱和短花柱的花粉活力和柱頭可授性能在較長時間內維持較高活力。

表3 歐報春花粉活力與柱頭可授性檢測結果

2.4 雜交指數估測和雜交親和性測定

根據Dafni 對雜交指數估算標準(表4),長花柱和短花柱的單花直徑都遠大于6 mm,賦值為3;花藥開裂與柱頭具有可授性之間不同步,賦值為1; 長花柱的花藥與柱頭在空間上有隔離,不能接觸,賦值為1,雜交指數值為5; 短花柱的花藥與柱頭雖然在空間上有隔離,但柱頭位于花藥下方,所以花藥與柱頭可能會有接觸,賦值為0,雜交指數值為4,因此根據Dafni的標準,歐報春的繁育系統類型可定為異交,部分自交親和,需要傳粉者。

表4 歐報春雜交指數估測

由表5可知,不同授粉組合均可結實,但結實數之間存在差異,具體表現為短花柱為母本的異型花間授粉>長花柱為母本的異型花間授粉>長花柱自花授粉和長花柱異株同型授粉>短花柱自花授粉和短花柱異株同型授粉>長花柱和短花柱的對照。綜上所述,異型花間授粉的結實數明顯高于自花授粉和異株同型授粉,短花柱為母本的異型花間授粉組合親和性優于其他組合,由對照組可知,在無傳粉昆蟲的溫室中歐報春能少量結實。

表5 人工授粉結實數

花粉管觀察試驗結果表明,長花柱、短花柱異花授粉無論時間長短花粉管都順利到達子房,長花柱為母本的異型花花間授粉花粉管在72 h內到達子房(圖3,A),短花柱為母本的異型花間授粉花粉管在48 h內到達子房(圖4),并與胚珠結合(圖3,B),花粉管的生長速度最快;長花柱自花授粉中部分花粉管72 h可到達子房(圖3,C),長花柱異株同型授粉僅有少量花粉管到達花柱與子房的連接處;短花柱自花花粉異株和同型花粉萌發情況較差(圖3,D),但花粉萌發后的生長速度與異型花粉授粉無顯著差異。綜上所述,歐報春存在自交不親和,長花柱的自交不親和性低于短花柱。

B圖中箭頭所指位置為胚珠;D圖中箭頭所示為花粉萌發。

T×P.短花柱×長花柱;P×T.長花柱×短花柱;P×P.長花柱×同株長花柱;P1×P1.長花柱×不同株長花柱;T×T & T1×T1.短花柱×同株短花柱&短花柱×不同株短花柱。

3 討 論

二型花柱植物在形態上的差異除了雌雄蕊高度外還有花部特征的多樣性[23]。歐報春長花柱的花冠直徑和花筒中部直徑大于短花柱,這通常被認為是一種機制,以補償花粉粒到達長花柱的偏差,迫使長花柱比短花柱吸引更多的傳粉者[24]。歐報春長花柱的花柱高度與短花柱的花藥高度相近,與買金梅對刺葉彩花(Acantholimonalatavicum)的研究結果[25]一致,究其原因,應是避免雌雄蕊的相互干擾,同時促進異型花間的授粉。研究發現歐報春長花柱的花粉和花柱形態與短花柱不同,長花柱柱頭的乳突較短花柱的長,容易固定短花柱產生的較大的花粉,短花柱柱頭的乳突較短,從而更容易固定長花柱花產生的較小的花粉,與馮建菊等人對新疆紫草(Arnebiaeuchroma)和盧婉佩對小報春(Primulaforbesii)的研究結果[26-27]一致?；ǚ坌螒B和柱頭乳突的差異葉會導致花粉粘附能力的不同,從而影響植物的繁殖特性,如對二型花柱植物白花丹(Plumbagozeylanica)的花粉外壁與柱頭角質層形態研究發現,其會影響物理接觸和化學過程[28]。此外,有研究表明不親和反應與花粉和柱頭結構和化學成分有關[29]。

傳粉在對植物的繁育中有重要意義,花粉活力和柱頭可授性是影響傳粉成功的重要因素[30]。TTC染色法具有快速、準確、靈敏度高等特點,聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性在報春中被廣泛應用[31]。柱頭是接受花粉的部位,其活性影響花粉的附著、萌發和花粉管伸長。當花粉活力與柱頭可授性都處于高活力時,是收集花粉的最佳時期,也是最佳的授粉時段,有利于植物順利進行授粉受精過程。根據花粉/胚珠比、雜交指數估測結果來看,歐報春的繁育系統為異交和自交都有。雖有研究表明二型花柱植物往往遵循的嚴格自交不親和繁育系統[32-34],與本試驗結果不同。但也存在二型花柱的植物具有部分自交親和[23,35],如紫草科的一些品種通常具有自交親和性[36],四季報春(Primulaobconica)[31],翠南報春(Primulapatens)[37]也存在自交親和性。同一屬中花柱異型的植物的繁育特性可能也不同,與所處環境有關,如在水仙屬中比利牛斯山黃水仙(Narcissusalbimarginatus)和密花兜被(N.calcicola),是自交不親和的, 而非洲之戀水仙(Narcissusrupicola)是自交親和的,是因為該物種是分布于地中海的高海拔地區,環境惡劣, 傳粉昆蟲甚少, 在此環境下植物失去自交不親和系統,來確保繁殖成功[38]。歐報春這種自交親和的繁育系統可能是與其生活史相適應的[39],是對自身的一種生殖保障。

雜交授粉試驗表明長花柱的自交不親和性顯著低于短花柱,這與Massinga等人的研究結果,存在部分報春花屬植物的長花柱具有一定的自交親和性,而短花柱表現為嚴格的自交不親的一致[8],其原因還需進一步探究。熒光顯微觀察表明,無論是自花花粉、異型花粉還是異花花粉均能在長花柱的柱頭上萌發,只是異型花粉的萌發速度快于其他類型,而短花柱為母本的植株無論自交還是同型異株授粉更多的表現為自交不親和,花粉無法在柱頭上萌發,與邵劍文等人對安徽羽葉報春的研究結果[40]一致。這是因為長花柱依靠控制花粉管的生長對花粉進行選擇和識別,短花柱于花粉在柱頭表面萌發的階段對花粉進行識別。Tremayne對報春花屬植物研究發現自交阻礙發生在花柱中的類型比自交阻礙發生在柱頭表面的類型更容易產生種子[41],本試驗結果進一步驗證了這一結論。