HtrA1 在潰瘍性結腸炎患者腸黏膜和外周血中的表達及臨床意義

陳智成，蘇麗婷，李義諾

（1.武警河南省總隊醫院消化內科，河南 鄭州 450052；2.河南省第三人民醫院綜合內科，河南 鄭州 450052）

潰瘍性結腸炎(UC)是炎癥性腸病的主要類型，其特征是反復發作的慢性非特異性胃腸道炎癥[1]。研究發現血小板炎癥反應參與了UC 的病理生理過程[2-3]，UC 患者具有顯著的血小板活化，可能需要高溫需求絲氨酸蛋白酶A（High temperature requirementprotein A，HtrA）活化，然后分泌炎癥因子IL-1β，參與炎癥過程。HtrA1 是一種熱誘導基因，對于細菌在高溫下的生存必不可少，HtrA1 可以在高溫下降解周質中錯誤折疊的蛋白質[4]。HtrA1 參與了多種炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、感染和敗血癥。在硫酸葡聚糖誘導的結腸炎小鼠模型中，HtrA 表達在第5 天增加并在2 周內保持在高水平[5-6]。與野生型小鼠相比，表達HtrA1 過表達突變體的轉基因小鼠表現出STAT3 的磷酸化增加，且遭受的結腸炎更嚴重。在2,4,6-三硝基苯磺酸誘導的結腸炎小鼠模型中，HtrA1 在腸粘膜淋巴細胞中高表達，HtrA1 低表達小鼠隨著年齡的增長而自發發展為結腸炎[7-8]。本研究旨在研究HtrA1 在UC 患者腸黏膜和外周血中的表達及臨床意義，為UC 的診斷及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年1 月至2020 年12 月武警河南總隊醫院收治的潰瘍性結腸炎患者130例為病例組，所有病例組的病理診斷由本院病理學家確診。病例組全結腸病變33 例，左側結腸病變68 例，乙狀結腸病變15 例，直腸病變病14 例。依據改良的Mayo 評分系統對疾病進行分期：活動期輕度（排便次數＜4 次/d，無明顯臨床癥狀，ESR低于20 mm·h-1）45 例，活動期重度（腹瀉次數≥6次/d，明顯血便，體溫高于37.8℃、脈搏＞90 次/min，Hb 小于75%正常值，ESR 大于30 mm·min-1）25例，活動度中度（上述癥狀或體征介于輕度和重度之間）60 例。依據預后情況分為預后良好組（黏膜愈良好、無復發、無并發癥）（101 例），預后不良組（黏膜愈合欠佳、復發、合并并發癥或接受結腸切除術治療）（29 例）。納入標準：（1）年齡≥18 歲；（2）符合 《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012，廣州)》以及的《中國炎癥性腸病標準診治共識分析》；（3）患者與家屬知情同意。排除標準：（1）腸結核；（2）癌癥史；（3）妊娠期婦女。選擇同期非潰瘍性結腸炎患者（結腸鏡檢查正常結腸組織）130 例為對照組。

1.2 方法

1.2.1 腸黏膜和外周血中HtrA1 mRNA 測定 常規獲取血清；組織樣本在結腸鏡檢查或手術時獲得，對直腸乙狀結腸（肛門近端10～20 cm）進行活檢。在結腸鏡檢查時獲得的組織用鑷子收集，并立即置于RNAlater 或快速冷凍中。手術樣本由人體組織研究中心通過在結腸切除術后不久對粘膜進行剝離并置于RNAlater 或快速冷凍中獲得。在4℃下2 至4 周后，去除多余的RNAlater，并將組織儲存在-80℃。使用帶有無RNAase 珠子的BulletBlender（NextAdvance，AverillPark，NewYork）將組織勻漿，并使用QiagenAllprepDNA/RNA/miRNA 提取試劑盒（Hilden，德國）提取總RNA。使用Agilent2100 生物分析儀測量RNA 完整性。分析中使用的所有樣品的RNA 完整性值為0.6。對于HtrA1 mRNA PCR，使用通用cDNA 合成試劑盒(Exiqon)從250 ng 總RNA 制備cDNA。HtrA1、GAPDH 的引物由Exiqon 設計和合成。使用ExiLENTSYBRGreenmastermix (Exiqon) 使用Roche Light Cycler480(Roche Indianapolis IN)進行定量實時逆轉錄PCR。HtrA1、GAPDH 序列如下：HtrA1(F:TCGTCGATGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGC，R:TTGCGATCGATGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATGC)，GAPDH (F:TCGAGCGATCGTACGTAGCTAGCTGACTGATCGATCGTAGCTAGCTAGC，R:TGTCGTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTC)。使用2-DDCt方法進行HtrA1 水平定量。

1.2.2 AST、ALT、TBIL、ALB、ESR、PT、PTA 指標測定 貝克曼AU-680 全自動生化分析儀（美國庫爾特公司）以及CA-7000 全自動凝血分析儀（希森美康）測定白蛋白（Albumin，ALB）、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartateamino transferase，AST）、總膽紅素（Total bilirubin，TBil）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三脂（Triglyceride，TG）、凝血酶原時間（Prothrombintime，PT）、凝血酶原活動度（Prothrombin activityprothrombin time activity，PTA）；血沉（Erythrocyte sedimentation rate，ESR）。

1.3 統計分析 采用SPSS 25.0 對數據分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t 檢驗或單因素方差分析比較，相關分析采用Pearson 分析，多因素Logistic 回歸分析探討潰瘍性結腸炎預后的相關因素，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組、病例組一般臨床資料比較 表1 可見，與對照組比較，病例組ALB、TBIL、PT、PTA、MELD 水平升高（P＜0.05）；而兩組性別、年齡、ALT、AST、TC、TG 等比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 對照組、病例組一般臨床資料情況比較

2.2 對照組、病例組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平比較 表2 可見，與對照組比較，病例組腸黏膜、外周血HtrA1mRNA 表達水平升高（P＜0.05）。

表2 對照組、病例組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平比較

2.3 輕度組、中度組、重度組腸黏膜、外周血HtrA1表達水平比較 表3 可見，與輕度組比較，中度組、重度組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平升高，隨著潰瘍性結腸炎患者病情嚴重程度的增加，腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平逐漸升高（P<0.05）。

2.4 不同預后組HtrA1 表達水平比較 表4 可見，與預后良好組比較，預后不良組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平升高（P<0.05）。

表4 不同預后組HtrA1 表達水平比較

2.5 HtrA1 與各指標的相關性分析 表5 可見，腸黏膜、外周血HtrA1 mRNA 與TBIL、PT、PTA 正相關，與PTA、ALB、ESR 負相關（P<0.05）。

表5 HtrA1 與各指標的相關性分析

2.6 潰瘍性結腸炎患者預后多因素Logistic 回歸分析 表6 可見，以潰瘍性結腸炎預后為應變量（預后不良=1，預后良好=0），單因素分析有意義的因素為自變量進行多因素Logistic 逐步回歸分析，結果發現高水平腸黏膜HtrA1 mRNA、外周HtrA1 mRNA 均為潰瘍性結腸炎預后的危險因素（P<0.05）。

表6 潰瘍性結腸炎患者預后多因素Logistic 回歸分析

3 討論

UC 的病因和發病機制非常復雜，由環境、免疫和遺傳等多種因素引起的黏膜免疫系統異常引起的炎癥過程在UC 的發病中發揮著重要作用。近年來，UC 的發病率呈上升趨勢，重癥患者的報告病例也較多。臨床研究表明，UC 是一種慢性炎癥性腸病,其特征是黏膜免疫反應失調，微血管炎癥引起的腸道多灶性梗死已成為UC 發病的重要機制。持續的高凝狀態可能與UC 的臨床進展有關并具有促進炎癥發生發展的作用。本研究通過檢測UC 組織中分子生物標志物HtrA1 的表達，為闡明UC 的發病機制提供進一步的信息。

HtrA1 是一種具有236 個氨基酸的蛋白質，包含一個胞外域、一個跨膜域和一個胞質域。細胞外結構域對于與FVII 的結合和外源性凝血途徑的啟動至關重要，并且具有促凝血活性和蛋白水解功能[9-10]。胞質結構域末端3 個絲氨酸殘基的磷酸化可介導細胞內信號轉導,促進血管內皮生長因子(VEGF)的轉錄和合成[13]。HtrA1 引發的凝血過程是通過外源性凝血途徑，這是凝血的啟動階段，HtrA1 在生理止血和病理性血栓形成中具有重要意義，并參與炎癥反應?？缒そY構域也可能在信號轉導中發揮作用，但胞內結構域的功能是近年來HtrA1 研究的熱點[11-12]。在人肺成纖維細胞中，HtrA1依賴的VEGF 表達需要FVII 與HtrA 結合，而FVII 與失活的活性位點和HtrA1 結合可抑制VEGF 的產生，VEGF 參與了UC 的發病機制,并與疾病的嚴重程度有關[14]。HtrA1 與其受體FVIIa 結合觸發細胞內信號轉導機制并誘導基質金屬蛋白酶（MMPs）的上調，其參與組織修復并且在炎癥性疾病中具有非常重要的意義[15]。大量研究證實，MMPs 參與UC 患者的基底炎癥組織修復、血管生成和白細胞趨化,且MMPs 在UC 組織中高表達，并隨著炎癥的加重而增強。本研究結果顯示，與對照組比較，病例組腸黏膜、外周血HtrA1 mRNA 表達降低（P<0.05）。隨著潰瘍性結腸炎患者病情嚴重程度的增加，腸黏膜、外周血HtrA1 表達逐漸降低（P<0.05）。這表明UC 組織和正常結腸組織之間HtrA1 的表達水平不同，提示HtrA1 可能與UC 的發生有關，高凝狀態和腸道微血栓形成可能介導了HtrA 在UC 中的作用。

近期研究發現，HtrA1 主要由TH2 細胞表達，HtrA1 負向調節IL-12 到STAT4Th1 通路，是介導TH2 反應所必需的。HtrA1 表達與哮喘和特應性皮炎、眾所周知的TH2 型疾病的病理以及過敏人類患者血清IgE 水平之間的強相關性；HtrA1 轉基因小鼠在氣道高反應模型系統中增加了TH2 反應。因此，HtrA1 在調節TH2 介導的免疫疾病的發生和維持中具有重要作用[16]。最近有報道通過腺病毒HtrA1 基因轉移在肺中過表達HtrA1 增強了IgG免疫復合物誘導的肺損傷。因此，在有炎癥的粘膜中高水平表達的HtrA1 可能在UC 中具有病理作用[17-18]。此外，腸黏膜、外周血HtrA1 mRNA 與TBIL、PT、PTA 正相關，與PTA、ALB、ESR 負相關（P<0.05）。這說明HtrA1 作為間接炎癥介質刺激其他炎癥介質釋放并誘發炎癥反應，可能參與了這一過程，表明HtrA1 與UC 疾病炎癥特征相關。在小鼠模型中，HtrA1 mRNA 主要在DSS 處理的結腸炎的增生上皮細胞和固有層單核細胞中表達，同時，HtrA1 蛋白增加并主要定位于固有層淋巴細胞，在結腸炎小鼠模型的隱窩上皮細胞中表達水平較高。本實驗研究數據顯示，HtrA1 mRNA 的表達與組織學炎癥的程度密切相關。因此，炎性固有層免疫細胞的積累可能是HtrA1 mRNA 增加的主要來源之一。HtrA 表達與UC 嚴重程度之間的相關性提出了一種可能性，即患者中HtrA1 高表達可能歸因于TH2 細胞在固有層中的積累，導致粘膜炎癥的惡化，這需要進一步研究HtrA1 在細胞中的定位。

此外，本研究也發現，預后不良組腸黏膜、外周血中HtrA1 表達水平升高（P<0.05）；高水平腸黏膜HtrA1 mRNA、外周HtrA1 mRNA 均為潰瘍性結腸炎預后的危險因素（P<0.05），這說明HtrA1 是影響UC 預后的因素。

綜上所述，HtrA1 在潰瘍性結腸炎患者腸黏膜和外周血中的表達升高，HtrA1 是影響UC 病情及預后不良的影響因素之一。