大草蛉對不同時期芳香植物甜羅勒及其主要揮發物質的嗅覺行為反應

楊亞潔,李 姝,方 艷,王 甦,岳艷麗,顧俊杰*

(1. 四川農業大學農學院,成都 611130;2. 北京市農林科學院植物保護研究所,北京 100097)

捕食性天敵昆蟲在控制農林重要害蟲、保證農產品的質量與產量等方面起著不可或缺的作用(陳學新等, 2010; 張帆等, 2015; 段雪瑩等, 2021)。作為我國廣泛分布的重要捕食性天敵,大草蛉Chrysopapallens具有捕食量大、適應性強、年發生世代數多、成蟲壽命長且產卵量大等特點(楊集昆, 1974; 楊星科, 1998; Booetal., 1998)。近年來,越來越多的學者聚焦在大草蛉生物學研究,尤其是通過研究感覺器官、滯育、人工飼料、控害能力等挖掘大草蛉的生防價值(李姝等, 2019)。但由于大草蛉成蟲搜尋擴散能力強而定殖性差,難以使其種群維持發揮持續性控害作用(武鴻鵠等, 2014),這極大限制了大草蛉的田間應用。

新興的保護型生物防治策略是通過功能植物創造有利于天敵昆蟲的生存環境,提高其適合度以增強害蟲防治效果(戈峰, 2020)。其中,芳香植物是一類目前廣泛應用的功能植物(宋備舟等, 2010; 張正群等, 2016)。很多研究表明芳香植物釋放的揮發性氣味對植食性昆蟲具有殺蟲、驅避和拒食作用(沈君輝等, 2007; Contietal., 2010; Dardourietal., 2018)。同時,田間實踐也發現,通過間作芳香植物能調控害蟲和天敵的種群數量,如在果園內種植芳香植物對天敵種群具有吸引作用,顯著增加了主栽作物區的天敵昆蟲多樣性,提高了對目標害蟲的生物防治效果(Songetal., 2017; Lietal., 2019; Hattetal., 2019)。然而,許多芳香植物對天敵昆蟲作用的化學生態學機制并不明確。植物與昆蟲的化學通訊系統中,植物釋放的特定揮發性物質能夠誘導植食性昆蟲定位寄主、選擇適宜的產卵場所或對植物產生逃避行為,也可為天敵定位寄主棲境提供線索(王冰等, 2021)。因此,天敵對芳香植物的嗅覺行為反應是揭示其化學生態學機制的重要基礎。

甜羅勒Ocimumbasilicum為唇形科羅勒屬喜溫的一年生草本芳香植物,原產亞熱帶地區,主產于法國、美國南部、匈牙利、印尼、西班牙等地(黃士誠等, 1989),作為食品、化妝品等經濟價值高(Mouraetal., 2020)。目前已有研究證明羅勒可直接影響害蟲種群增長,例如茶園中間作丁香羅勒Ocimumgratissimum可以降低主要害蟲茶尺蠖Ectropisobliqua種群(張正群等, 2016);蠶豆田Viciafaba間作丁香羅勒或者香薄荷Saturejahortensis可以降低黑豆蚜Aphisfabae種群數量(Basedowetal., 2006);圣羅勒Ocimumsanctum能降低綠豆象Callosobruchuschinensis的產卵量(Kiradoo &Srivastava, 2010)。本研究團隊前期調查芳香植物上節肢動物群落發現,甜羅勒上大草蛉種群數量顯著高于其他植物,那為什么大草蛉更喜趨向甜羅勒植株?是否與甜羅勒植株的揮發性化學物質有關?

為明確芳香植物甜羅勒對大草蛉的吸引作用機制,本研究(1)使用Y型嗅覺儀測定了大草蛉成蟲對不同時期甜羅勒植株的嗅覺行為反應;(2)采用頂空固相微萃取方法收集并用氣相色譜質譜分析了甜羅勒植株營養期的葉、開花期的葉和花的揮發性物質成分;(3)測定了大草蛉成蟲對不同濃度下主要揮發物質標準品的嗅覺行為反應。本研究結果為探究大草蛉對芳香植物識別機理和反應機制提供基礎行為學證據,亦可為進一步開發甜羅勒作為天敵的吸引定殖功能植物提供支撐數據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源:大草蛉來自北京市農林科學院植物保護研究所室內繁育種群。在盆栽蠶豆苗上擴繁豌豆修尾蚜種群,待擴繁到適宜的密度時將大草蛉放入養蟲籠(50 cm×45 cm×45 cm,尼龍網120目)中進行試驗種群擴繁。所有種群在恒定條件下(溫度25℃±1℃,相對濕度70%±5%,光周期L∶ D=16 h∶8 h)飼養。

供試植物:甜羅勒種子購自于北京花兒朵朵仙子農業有限公司。待種子萌發長至3～4片真葉時,移栽到塑料花盆中(高為20 cm,直徑為13 cm),盆栽所用基質成分為蛭石、珍珠巖、泥炭土按1∶1∶4比例混合,每盆移栽一株幼苗,底部吸水至土壤微濕,培養環境條件同上。待植株長至30 cm時開始試驗。

供試試劑:芳樟醇、羅勒烯、萜品油烯、丁香酚標準品購于Sigma-Aldrich公司,樟腦、β-欖香烯購于上海源葉生物有限公司,純度均在95%以上。以上6種標準品分別以石蠟油稀釋至0.1 μg/L、0.01 μg/L,充分混勻后密封,放置于4℃冰箱內儲存備用。

供試儀器:頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用儀(HS-SPME-GC-MS)(Agilent 6890N-5975)?！癥”型嗅覺儀的主臂內徑為3 cm,長為15 cm,兩個側臂長為15 cm,夾角為60°,用Teflon管分別連接芳香植物植株和對照(潔凈空氣或石蠟油)后再連接LS-2800型氣泵(北京勞動儀器研究所)。氣泵推動空氣進入系統,氣流經活性炭、蒸餾水凈化加濕、氣味源后通過玻璃轉子流量計進入Y形管兩側。

1.2 大草蛉對不同時期甜羅勒植株的嗅覺行為反應

Y型嗅覺儀放置在100 cm×100 cm×60 cm的試驗箱中(25℃±1℃,RH 60%±5%)。用照度計測試兩臂光照強度,并調整位置,保證“Y”型嗅覺儀各部位受光一致。接通抽氣泵電源開始抽氣,調節流速計使兩邊的氣流速度相同,控制氣體流速在400 mL/min左右。試驗前先行通氣10 min,使氣味充滿管道,以保證測試結果。試驗前將5～7日齡的大草蛉成蟲饑餓12 h。試驗時,將饑餓后的大草蛉成蟲逐頭引入嗅覺儀的主臂內,觀察大草蛉在5 min內的行為反應,大草蛉爬行超過某氣味源試管臂的1/2處記為選擇,在5 min內仍未到達某氣味源試管臂1/2處,記為無選擇。每測試5頭大草蛉結束后,用95%乙醇擦洗管的內、外壁,烘干后調換Y型管的氣味源與對照源的方向,以消除誤差。

用一次性無味透明塑料袋分別套住健康的甜羅勒植株,下部進氣,上部出氣,作為氣味源,另一位置使用相同空氣塑料袋為空白對照。每頭試蟲僅測試一次,每測試5頭更換氣味源。大草蛉雌、雄成蟲對營養期和開花期的甜羅勒植株分別測試50頭,共計200頭。

1.3 不同發育階段甜羅勒的揮發物質收集與鑒定

采用頂空固相微萃取方法對甜羅勒營養期的葉、開花期的葉和花的揮發物質進行收集測定分析。將不同時期健康的甜羅勒營養期的葉、開花期的葉和花放入玻璃瓶(45 mL,Cleman),利用固相微萃取針SPME纖維中(DVB/CAR/PDMS, 50/30 μm)萃取揮發物質30 min。

采用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)進行揮發物質成分檢測。質譜柱為HP-5和DBWAX(30 m×250 μm×0.25 μm),氦氣用作載氣流速為1.7 mL/min,GC進樣口設置為不分流模式。柱初始溫度60℃,保持2 min,以10℃/min程序升溫至250℃,保持10 min,再以20℃/min升溫至320℃,保持3 min;氦氣流速為3.0 mL/min;離子源EI為70eV、350V;掃描質量為30～600 amu;進樣口溫度250℃,接口溫度280℃。每個試驗重復3次。

1.4 大草蛉對不同濃度下標準品的嗅覺行為反應

測試大草蛉對不同濃度下主要揮發物質標準品嗅覺行為的方法同1.2.1。將10μL的標準品滴在一張3 cm×0.5 cm的濾紙條上放進氣味瓶內作為處理氣味源,以石蠟油作為對照氣味源。分別測試大草蛉雌成蟲對0.01 μg/ L和0.1 μg/L濃度的6種標準品試驗,每個重復90頭,共計1 080頭大草蛉雌成蟲成功選擇測試。

1.5 數據分析

試驗所得數據Excel 2019進行整理,然后使用SPSS Statistics 22.0軟件進行統計分析。采用χ2檢驗分析大草蛉雌/雄成蟲對處理組與對照組選擇差異顯著性。選擇率(%)=選擇處理組蟲數/總頭數×100。若值為正,為誘集率,若值為負,則為驅避率;采用NIST05 標準譜庫對揮發物質進行定性,用揮發物質的峰面積進行相對含量定量比較及分析。

2 結果與分析

2.1 大草蛉對不同時期甜羅勒植株嗅覺行為選擇

甜羅勒營養期和開花期的植株對大草蛉雌、雄成蟲對吸引作用不同(圖1)。開花期的甜羅勒植株對大草蛉雌成蟲具有極顯著吸引作用,對雄蟲也有一定的吸引作用,但與對照相比無顯著差異(雌開花期:χ2=9.680,P<0.05;雄開花期:χ2=0.720,P=0.396)。營養期的甜羅勒植株對大草蛉雌、雄成蟲均無吸引作用,且顯著性差異相差較小(雌營養期:χ2=0.720,P=0.396;雄營養期:χ2=0.320,P=0.572)。

圖1 大草蛉對不同時期甜羅勒植株的嗅覺反應Fig.1 Olfactory response of Chrysopa pallens to Ocimum basilicum plants at different stages

2.2 甜羅勒不同發育階段葉片和花揮發物質成分

不同時期甜羅勒葉片和花揮發物質成分大致相同,相對含量在0.5%以上的共鑒定出28種揮發化合物(表1),甜羅勒營養期的葉有19種、開花期的葉和花分別有21、22種化合物。其中共有的化合物組分包含13種,主要為芳樟醇、丁香酚、α-香柑油烯、桉油素、β-欖香烯等。這些揮發物化學成分屬性為醇類、萜烯類、酯類等化合物。兩個不同時期甜羅勒葉片揮發物化學組分中,含量依次為芳樟醇(22.64%～30.64%)、α-香柑油烯(9.05%～15.1%)、丁香酚(3.41%～13.23%)、β-欖香烯,僅這四種物質相對含量就占總含量37.92%～63.28%。葉片中芳樟醇、丁香酚從營養期到開花期的相對含量逐漸下降;萜品油烯、β-月桂烯、羅勒烯相對含量逐漸上升。其中,有些揮發性組分僅在某一階段出現,如樟腦、γ-衣蘭油烯只在花中被檢測到;β-水芹烯、乙酸龍腦酯僅在花期葉片中被檢測到;檜烯只在營養期葉片中出現。

表1 不同時期甜羅勒葉和花的化學成分

甜羅勒在營養期和花期釋放的揮發性有機成分及相對含量動態變化發現,花期的甜羅勒含量較高的揮發物為烯萜類,其中單萜和倍半萜相對含量之和達95.5%。其中芳樟醇含量最高,相對百分比含量為30.64%。隨著甜羅勒植株的生長發育,單萜類物質的在營養期到開花期的葉片中相對含量逐漸升高,在花中達到峰值74.86%。倍半萜類物質含量的相對含量僅升高了4.71%,其中愈創烯從營養期到開花期相對含量就升高了4.56%。丁香酚在葉中從營養期到開花期的相對含量升高4%左右,但在花中含量僅是葉中的25.8%。

2.3 大草蛉對不同濃度標準品的嗅覺行為反應

在甜羅勒主要揮發物質中選取6種芳樟醇、羅勒烯、萜品油烯、丁香酚、樟腦、β-欖香烯標準品,測定了不同濃度時對大草蛉雌蟲的嗅覺行為選擇。結果表明,0.1 μg/L濃度的芳樟醇對大草蛉具有顯著的吸引作用(P<0.05);0.01 μg/L濃度的β-欖香烯對大草蛉具有極顯著地吸引作用(P<0.01)。大草蛉對0.1 μg/L、0.01 μg/L濃度的萜品油烯和0.01 μg/L濃度的樟腦、丁香酚、芳樟醇、羅勒烯等揮發物不顯著的趨向選擇(圖2)。

圖2 大草蛉對不同濃度主要揮發物質標準品的嗅覺行為選擇Fig.2 Selection of olfactory behavior of Chrysopa pallens to different concentrations of volatile odors

3 結論與討論

植物在不同生長發育時期會產生多種揮發物質,其組成和豐度的差異與植物生長發育代謝有關(付國需等, 2008; Desurmontetal., 2015),本研究發現了芳香植物甜羅勒不同發育階段葉和花的揮發性物質相對含量動態變化情況。植物揮發氣味物質可能不會影響植株本身的生長發育,但卻是植物與昆蟲之間聯系的信號物質(蘇建偉等, 2020)。本研究關注了不同時期甜羅勒植株不同組織的揮發物質對天敵昆蟲大草蛉的嗅覺行為影響。開花期的甜羅勒植株可顯著引誘大草蛉雌蟲,而對雄蟲也有引誘作用但不顯著。這可能與大草蛉雌雄觸角上氣味結合蛋白,ORs基因特異性表達不同有關(王娟, 2016)。天敵昆蟲利用植物揮發物進行搜尋、產卵、逃避、取食、聚集等行為,依靠靈敏的嗅覺識別機制可簡化復雜的氣味環境并做出反應(盛子耀等, 2019; 王冰等, 2021)。由此推測,大草蛉對甜羅勒偏好性可能與不同時期揮發物質不同有關,這可能有助于大草蛉取食、遮蔽或產卵等行為。

芳香植物揮發物的類型主要包括烴類、醇、醛、酮、酯、有機酸和萜烯類,其中萜烯類化合物中種類相比其他化合物種類豐富(Songetal., 2017; Hattetal., 2019)。萜烯類化合物在植物-植食性昆蟲-天敵昆蟲三級營養級關系中起著重要作用,一方面在天敵搜尋害蟲過程中常起信號定位作用(James, 2003; 李小龍等, 2014; 陳曉亞等, 2015)。另一方面在天敵棲境選擇、產卵等發揮作用(Zhuetal., 2005)。本研究發現甜羅勒葉在營養期和開花期中含有大量單萜化合物(60.37%～76.55%)。這與Kpoviessietal.(2014)報道的丁香羅勒在營養期和開花期的單萜類揮發物組分相似(56.72%、55.87%)。其中單萜化合物被報道是天敵搜尋害蟲過程中重要的定位信號物質(Fontanaetal., 2011)。本研究發現甜羅勒所有時期葉片和花相對含量最多的單萜化合物-芳樟醇,尤其是在花中高達30.64%。許多研究報道了芳樟醇對多種天敵及傳粉昆蟲具有吸引作用,例如煙草Nicotianatabacum被取食后釋放的芳樟醇吸引天敵攻擊蟲卵從而降低害蟲為害(Kessleretal., 2001);國槐Styphnolobiumjaponicum釋放的芳樟醇對瓢蟲有顯著的引誘作用(薛皎亮等, 2008);茶樹Camelliasinensis中釋放的芳樟醇對中華蜜蜂Apiscerana有顯著引誘作用(吳國火等, 2020)。本研究中發現芳樟醇對大草蛉的引誘效果有濃度差異性,在0.1 μg/L濃度比0.01 μg/L濃度時對大草蛉有顯著的引誘作用。

本研究結果表明0.1 μg/L濃度時萜品油烯、樟腦、β-欖香烯、丁香酚和羅勒烯這5種揮發物對大草蛉具有一定趨避趨勢,但在0.01 μg/L濃度卻表現出吸引趨勢。昆蟲對同一種化合物的反應濃度不同,主要是受自身相關蛋白表達量和敏感性影響(狄貴秋等, 2019)。這也表明捕食性天敵對化合物的選擇是一個復雜的過程。濃度差異可區分不同植物或者植物生理狀態,而昆蟲定位的與化合物濃度有關,在一定化合物濃度范圍中昆蟲才會產生反應,同一種植物揮發物可能具有多種功能,會因濃度不同從而對害蟲及其天敵產生吸引或驅避作用(Altuzaretal., 2010; 蔣娜娜等, 2018)。

此外,芳香植物具有強烈的揮發物質直接影響天敵種群,而且花粉或花蜜也可以為天敵昆蟲提供營養、延長其壽命和提高繁殖力(W?ckers &Rijn., 2012; Parolinetal., 2012)、種群增長(Venzonetal., 2016; Hattetal., 2019)、提供避難所(Venzonetal., 2016)和產卵場所(Laubertieetal., 2012; Andréetal., 2017)等功能,間接降低害蟲的數量,達到控害的效果。比如當缺乏獵物時,開花期甜羅勒植株可顯著吸引草蛉Ceraeochrysacubana雌成蟲,其花粉或花蜜作為補充食物用于草蛉成蟲和幼蟲的生長繁殖(Batistaetal., 2017)。甜羅勒作為儲蓄植物時,對捕食性天敵溫室中矮小長脊盲蝽Macrolophuspygmaeus的種群增長雖沒有顯著影響,但是卻能直接趨避番茄Lycopersiconesculentum上溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum種群數量,以達到較好的控害效果(Parolinetal., 2015),這充分證明了芳香植物在生物防治中的應用中的潛力。本研究發現不同時期甜羅勒對大草蛉的誘集作用差異,也為田間應用甜羅勒使用時期提供了支撐數據。盡管本研究中僅測定了大草蛉對甜羅勒6種主要揮發物質的嗅覺行為,未來隨著化學分析技術的提升,必將推進對大草蛉在化學生態學方面的研究。此外,近年來使用引誘劑來增加作物生態系統中天敵昆蟲的補充和定殖是增強保護性生物防治的新嘗試。例如水楊酸甲酯不僅可以能增加農業生態系統中草蛉種群數量,而且對瓢蟲、食蚜蠅、寄生蜂的種群也有增益效果(Thmingetal., 2021)。因此,未來繼續深入探究具有誘集作用的化合物按不同比例混配成復合引誘劑,可以最大發揮對大草蛉的引誘作用。這些有助于提升功能植物增效天敵生物防治效率,優化可持續控害的生態調控策略。