桉蝙蛾幼蟲實時熒光定量PCR內參基因的篩選

陳 曉,邱峙嵩,蘇小燕,許 原,曹麗沙,楊振德,胡 平

(廣西大學林學院,南寧 530004)

桉蝙蛾EndoclitasigniferWalker(鱗翅目Lepidoptera蝙蝠蛾科Hepialidae)是桉樹上的一種重要蛀干性害蟲之一。近年來,隨著我國南方速生桉人工林大面積的規?；N植,桉蝙蛾危害范圍逐漸擴大,已成為影響桉樹產業發展的主要鉆蛀性害蟲(楊秀好等, 2021)。桉蝙蛾雌蟲交配后,多將卵隨機散產于1～3年生的桉樹幼林內;幼蟲3齡以前,營地棲生活,3～5齡幼蟲上樹蛀干,此后營樹棲生活,直至12齡末期于所蛀孔洞內化蛹(于永輝, 2012)。受桉蝙蛾危害的桉樹生長發育減緩,材積減少、材質下降,且易風折、枯死(楊秀好, 2013)。目前,針對桉蝙蛾的研究主要集中在生物生態學特性(曹書閣等, 2011; 楊秀好等, 2012;Yangetal., 2013; Zhengetal., 2016; 胡平等, 2021)、生物防治(藍霞等, 2014; 鄒東霞等, 2016)以及遺傳與生理學(Yangetal., 2016; Zhangetal., 2021)等方面,而對桉蝙蛾幼蟲內參基因的研究尚未見報道。

實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)是檢測生物體中基因表達差異常用的核酸定量檢測技術之一,而RT-qPCR結果的可靠與否,依賴于內參基因這一重要因素。常用的內參基因包括延伸因子(Elongation factors,EF)、肌動蛋白基因(Actin,ACTIN)、核糖體蛋白基因(Ribosomal protein,RIB)、微管蛋白基因(Tubulin,TUB)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)等基因(Luetal., 2018)。內參基因一般選擇參與細胞基本生命活動、在生物體內的各個部位和不同的實驗處理下均能穩定表達的基因。然而,研究表明內參基因的穩定是相對的,隨著實驗處理的改變,在不同生理狀態下,內參基因的表達存在差異(Zhangetal., 2014; Shakeeletal., 2018)。因此,在利用RT-qPCR進行目的基因表達水平研究時,必須使用合適的內參基因對RT-qPCR數據進行分析校正和標準化處理,以減少樣本之間由RNA提取、cDNA定量、轉錄和擴增所帶來的誤差,從而得出正確的判斷(Gueninetal., 2009)。

本文通過RT-qPCR技術檢測桉蝙蛾幼蟲不同齡期(3齡、5齡、9齡、12齡)、不同體節(頭、胸、腹)和全樣品處理下的候選內參基因表達量,并利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder等計算程序對5個候選內參基因的穩定性進行評估,為桉蝙蛾幼蟲基因表達的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及樣本采集

桉蝙蛾幼蟲于2019年6月-2020年9月采自廣西壯族自治區國有高峰林場(N 22°941′, E 108°336′)的桉樹寄主上。將受害木段鋸下帶回實驗室內,劈開木段后取出幼蟲,于-80℃下冷凍保存。參考王緝健等(2015)的齡期劃分方法,取3齡和5齡(地棲或初轉樹棲,低齡幼蟲)、9齡(樹棲,中齡幼蟲)、12齡(越冬,老齡幼蟲)桉蝙蛾幼蟲,用解剖手術剪沿腹部中線剪開幼蟲胸腹部表皮,清除脂肪和腸道后,分別剪下頭、胸、腹,作為不同體節與不同齡期的樣品,所有樣品作為全樣品處理。每個齡期和體節各重復3次。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

采用RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒(No.74134; Qiagen, Hilden, Germany)提取所有樣本總RNA,具體步驟參照RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒說明書。取1 μL RNA樣品,使用NanoDrop 8000(Thermo, Waltham, MA, USA)測定OD260/OD280與OD260/OD230,當各自的比值在1.8～2.1之間,且通過瓊脂糖凝膠電泳檢測能獲得清晰條帶的樣品用于cDNA合成。取1 μL RNA的量,按照反轉錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TranGen Biotech)的步驟合成cDNA。

1.3 內參基因選擇及RT-qPCR引物設計

參考其他昆蟲常用的內參基因,選取桉蝙蛾幼蟲轉錄組(Zhangetal., 2021)中鑒定的ACTIN、GAPDH、TUB、RIB、EF作為候選內參基因(表1)。利用引物設計工具Primer 3(https:// primer3.ut.ee/)設計RT-qPCR引物(表1)。引物由北京TSINGKE公司合成。

表1 桉蝙蛾幼蟲樣本中5個候選內參基因的引物序列和擴增子特征

1.4 標準曲線制作和RT-qPCR分析

將樣品cDNA模板梯度稀釋1/10、1/100、1/500、1/1 000、1/1 500進行反應,在冰上進行反應體系的配制,RT-qPCR反應體系(25 μL)如下:Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix(No ROX)(ABclonal Technology)12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,cDNA稀釋液2.0 μL,Nuclease-free H2O 8.5 μL,在Ligh Cycler 480 II(Roche,USA)上進行反應。PCR程序:95℃預變性3 min,95℃變性5 s,60℃退火和延伸共30 s,40個循環;95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s形成熔解曲線。通過熔解曲線與梯度濃度擴增的標準曲線,檢測每對引物的擴增特異性、擴增效率及標準曲線的回歸系數R2(表1)。每個cDNA樣品設置3次技術性重復和3次生物學重復。

1.5 候選內參基因表達穩定性分析

分別利用內參基因評估軟件GeNorm、BestKeeper和NormFinder軟件及RefFinder在線網站(https://www.heartcure.com.au/reffinder)評價候選內參基因在桉蝙蛾幼蟲不同齡期與不同體節中的表達穩定性。在利用GeNorm分析時,表達穩定值M<1.5且數值越小,表示該基因相較其他候選內參基因更能在當前實驗處理下穩定表達;而配對差異值Vn/(n+1)<0.15時則表示最佳的內參基因數目為n個,不需再增加其數量,否則加入新基因,直至Vn/(n+1)<0.15(Vandesompeleetal., 2002)。Normfinder通過計算不同樣本組內和組間的變化來評估候選內參基因表達穩定值(Stability value,SV),該值越小表示基因越穩定(Andersenetal., 2004)。BestKeeper直接使用Ct值進行計算,主要通過標準偏差(Standard deviation,SD)來評估候選內參基因的穩定性,當SD<1且SD數值越小時,認為該基因的表達越是穩定(Pfaffletal., 2004)。最后,通過常用的RefFinder對3種軟件得出的內參基因穩定性進行綜合排名,即加權幾何平均值越小越穩定(Xieetal., 2012)。

2 結果與分析

2.1 引物擴增效率及特異性

所有基因的擴增條帶清晰而單一,且擴增產物長度與預期一致(圖1);同時,基于候選內參基因不同濃度的cDNA獲得的標準曲線具有良好的回歸系數(R2>0.995),PCR擴增效率在99.7%～108.4%之間(表1),表明各候選內參基因的引物設計合理,可用于相應基因的定量檢測。

圖1 引物的PCR擴增條帶Fig.1 PCR amplification bands of primers

2.2 不同候選內參基因在樣品中的表達水平差異

RT-qPCR分析桉蝙蛾5個候選內參基因的表達水平顯示,在所有樣品中,各基因的Ct平均值在24.13～28.84之間,表明所有候選內參基因在各處理中均有較高的表達量,且在不同處理的表達量均存在差異。其中,ACTIN的平均表達豐度最大(24.13)、表達水平差異最小(SD=2.40);而TUB的表達水平差異(SD=6.48)最大,其次為EF(SD=3.30)、GAPDH(SD=3.21)、RIB(SD=2.84)(圖2)。

圖2 不同候選內參基因在桉蝙蛾幼蟲樣本中的表達水平(Ct值)Fig.2 Expression levels of different candidate reference genes in the samples of Endoclita signifer larvae (Ct value)注:點為Ct平均值,中垂線的上下限為標準偏差。Note: The point represent the Ct mean value, and the upper and lower limits of the midline represent the standard deviation.

2.2 候選內參基因在不同處理下的穩定性分析

2.2.1BestKeeper軟件分析

在3齡幼蟲的不同體節中,所有基因的SD值均大于1,均不適于作為內參基因;RIB和EF在5齡幼蟲的不同體節中具有良好的表達穩定性,而ACTIN、GAPDH和TUB的SD值均大于1,顯示較差的穩定性;9齡幼蟲的不同體節中,表達最穩定的基因為EF,其次為GAPDH、RIB,而ACTIN最不穩定;相反,ACTIN在12齡幼蟲的不同體節中的表達最穩定,EF次之,而GAPDH、RIB和TUB不適于作為內參基因(SD>1)。在不同齡期幼蟲的胸部中僅GAPDH能穩定表達(SD=0.688<1),其余4個候選內參基因均不適于作為內參基因(SD>1);所有基因在不同齡期幼蟲的頭部和腹部中的表達均不穩定(SD>1)。沒有任何一個基因能在所有處理中穩定表達。特別是TUB在所有處理中均被認為是不穩定的基因(SD>1)(表2)。

表2 不同處理下候選內參基因的表達穩定性

2.2.2GeNorm軟件分析

在3齡、5齡、9齡和12齡幼蟲的不同體節中,最穩定的一對基因分別為ACTIN/RIB、RIB/EF、GAPDH/EF和GAPDH/RIB,其中ACTIN在9齡幼蟲的不同體節中表達最不穩定,TUB在3齡、5齡和12齡幼蟲的不同體節中均被認為是最不穩定的基因;在不同齡期幼蟲的頭部中僅RIB和EF能穩定表達,而在不同齡期幼蟲的胸部、腹部和全樣品處理中,所有基因的M值均大于1.5,認為在這3個處理中無任一基因可作為內參基因(表2)。

2.2.3NormFinder軟件分析

3齡幼蟲的不同體節中的基因穩定性排序為RIB>ACTIN>GAPDH>EF>TUB,RIB、TUB分別為最穩定、最不穩定的基因。5齡和9齡幼蟲的不同體節中,穩定性較高的前3個基因同為GAPDH>EF>RIB,而ACTIN和TUB被認為穩定性較低;ACTIN在12齡幼蟲的不同體節中穩定性最高,TUB仍是穩定性最低的基因;EF是不同齡期幼蟲的頭部中表達最穩定的基因,而RIB是不同齡期幼蟲的胸部、腹部及全樣品處理中表達最穩定的基因。同樣地,所有樣本中最不穩定的基因均為TUB,這與BestKeeper的結果一致(表2)。

2.2.4RefFinder綜合分析

3齡和12齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的胸部以及全樣品中,RIB、ACTIN和GAPDH是穩定性排序前3的基因,排序分別為RIB>ACTIN>GAPDH和ACTIN>RIB>GAPDH、RIB>GAPDH>ACTIN以及RIB>ACTIN>GAPDH;而EF和TUB

為穩定性較低的一對基因,其中TUB在這些處理中均為最不穩定的基因。5齡和9齡幼蟲的不同體節中,排列前3的基因同為EF、RIB、GAPDH,排序分別為EF>RIB>GAPDH、GAPDH>EF>RIB;而ACTIN和TUB的穩定性較差,5齡、9齡幼蟲的不同體節中最不穩定的基因分別為TUB、ACTIN。不同齡期幼蟲的頭部和胸部中穩定性排序均為EF>RIB>ACTIN>GAPDH>TUB(圖3)。

圖3 基于RefFinder軟件分析候選內參基因的表達穩定性Fig.3 Expression stability of the candidate reference genes was analyzed by RefFinder software注:A.、B、C、D分別為3齡、5齡、9齡、12齡幼蟲的不同體節;E、F、G分別為不同齡期幼蟲的頭部、胸部、腹部;H為全樣品。Note: A, B, C and D represented the different segments of the 3rd, 5th, 9th and 12th instar larvae, respectively; E, F and G represented the head, thorax and abdomen of different instars; H was for all samples.

2.2.5最適內參基因的確定

在8種處理中,各處理的Vn/(n+1)值均大于0.15(圖4),說明通過配對變異值不能完全確定內參基因的最佳數目,但可根據Vn/(n+1)值的變化趨勢,選擇表達穩定性最好的2～3個基因作為最適內參基因。在5齡和9齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的頭部和胸部中,加入第3個內參基因會使得Vn/(n+1)值增大,故這4個處理的內參基因最佳數目均為2個;相反,在3齡和12齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的腹部及全樣品處理中,引入第3個內參基因會減小Vn/(n+1)值,因此這3個處理中的內參基因最佳數目均為3個。

圖4 基于GeNorm軟件分析不同處理下所需內參基因的最適數目Fig.4 Optimal number of reference genes under different conditions was analyzed based on GeNorm software

結合RefFinder綜合排序的分析(圖3),3齡、12齡幼蟲的不同體節及全樣本中最穩定的內參基因組合為ACTIN+RIB+GAPDH;5齡幼蟲的不同體節和不同齡期幼蟲的頭部中,EF+RIB為最穩定的內參基因組合;在9齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的胸部和腹部中,可分別選擇GAPDH+EF、RIB+GAPDH和EF+RIB+ACTIN作為最穩定的內參基因組合(表3)。

表3 不同處理下最佳的內參基因組合

3 結論與討論

RT-qPCR技術是基因表達與轉錄分析中最常用的技術手段之一,其中內參基因的穩定性直接影響著RT-qPCR的實驗結果,選擇合適的內參基因是保證RT-qPCR結果可靠性的重要基礎(Dundas and Ling, 2012)。迄今為止,沒有任何一個內參基因在所有實驗處理下保持恒定的表達水平,因此在進行RT-qPCR前,有必要進行內參基因的篩選(Shi and Zhang, 2016)。

候選內參基因的穩定性評價常采用多個方法依據相關參數進行綜合分析,并根據候選內參基因的穩定性高低進行排序。在單獨采用3種方法進行排序的情況下,發現在桉蝙蛾幼蟲不同齡期和不同體節中通過3種方法給出的最穩定內參基因及其排序并不完全一致。如在桉蝙蛾12齡幼蟲的不同體節中,BestKeeper認為ACTIN是最穩定的基因,其次為EF、RIB,GeNorm認為穩定性排序為RIB=GAPDH>ACTIN>EF>TUB,而NormFinder則認為ACTIN是最穩定的基因,其次為RIB、GAPDH(表2)。在其他昆蟲的內參基因篩選中也存在類似情況(陳立華等, 2014; Yangetal., 2017),這可能與3種方法的計算方法及評價指標不同有關。因此,最終使用RefFinder對各候選內參基因的穩定性進行綜合排序,以減少各軟件間的結果差異。

通常以GeNorm軟件給出的基因配對變異值Vn/(n+1)<0.15為參考,來確定所需內參基因的數目。但在桉蝙蛾幼蟲不同齡期與不同體節中,各處理的所有配對變異值Vn/(n+1)>0.15(圖4)。這種情況在許多研究中也有出現,如在二化螟Chilosuppressalis的不同齡期、不同組織和混合樣品中(Xuetal., 2019),在柑橘大實蠅Bactroceraminax的不同蟲體、成蟲不同組織中(王佳等, 2014),在小菜蛾Plutellaxylostella的Bt毒素誘導處理中(符偉等, 2012)等。針對這種現象,GeNorm使用說明中建議,當配對變異值Vn/(n+1)>0.15時,可根據配對變異值趨勢變化,選擇2～3個最穩定的內參基因(Vandesompeleetal., 2002);同時,過多地引入內參基因會導致更多的不穩定因素,因此最適內參基因的數目不應超過3個(Zhuetal., 2014)。據此,在桉蝙蛾5齡和9齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的頭部和胸部中不應引入第3個基因使得配對變異值Vn/(n+1)增大,故內參基因的最佳數目為2;而在3齡和12齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的腹部及全樣本中,第3個內參基因的引入能使Vn/(n+1)值減小,故內參基因的最佳數目為3(圖4)。

桉蝙蛾3齡、12齡幼蟲的不同體節及全樣品處理中,RIB顯示出較好的穩定性(表3)。RIB是調控細胞核糖體的合成、參與細胞翻譯過程的重要管家基因。與核糖體調控相關的基因在許多研究中被認為是最穩定的內參基因,如桃蛀螟Conogethespunctiferails中,RP49在不同發育時期和不同組織中最穩定(楊苓等, 2017);粘蟲Mythimnaseparata幼蟲不同組織中最穩定的基因為RPL12(Lietal., 2018);RPS15和RPL13可作為棉鈴蟲Helicoverpaarmigera幼蟲不同組織中的一組內參基因(Zhangetal., 2015)。在桉蝙蛾5齡幼蟲不同體節和不同齡期幼蟲的頭部、腹部中,EF有良好的表達穩定性(表3)。EF在蟲草鉤蝠蛾Thitarodesarmoricanus幼蟲(Liuetal., 2016)和羽衣袖蝶Heliconiusnumata的不同組織與不同發育階段中也均可作為最穩定的內參基因(Panetal., 2015),顯示EF對這些昆蟲發育階段和組織的變化可能不敏感。在桉蝙蛾9齡幼蟲的不同體節中,最穩定的內參基因為GAPDH(表3)。GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)是調控糖酵解、糖異生等能量代謝過程中的一種關鍵酶。在大螟Sesamiainferens、甜菜夜蛾Spodopteraexigua和斜紋夜蛾Spodopteralitura的不同發育階段中(Luetal., 2013; Zhuetal., 2014; Luetal., 2015),GAPDH是最穩定的內參基因。同樣地,GAPDH在桉蝙蛾不同齡期幼蟲的腹部中具有較高的穩定性,表明同一基因在不同昆蟲同一實驗處理下的研究結果具有一定的參考價值。在桉蝙蛾12齡幼蟲的不同體節中,最佳的內參基因是ACTIN(表3)。ACTIN(β-Actin)參與細胞分裂、染色體運動、細胞器運動、胞質流動等幾乎所有的真核細胞生理過程,是常用的內參基因(Chapman and Waldenstrom, 2015)。但是,ACTIN在桉蝙蛾幼蟲3齡和9齡的不同體節中呈現不穩定的基因表達,這與草原毛蟲屬Gynaephora種群在不同海拔處理(Zhangetal., 2017)、美國白蛾Hyphantriacunea在不同溫度處理(陶蓉等, 2019)下得出的結果一致,說明內參基因的使用率與內參基因的穩定性之間沒有絕對的因果關系,突出針對特定昆蟲與具體的實驗處理進行內參基因篩選的必要性。

TUB(Tubulin)編碼的微管蛋白參與包括構建和維持細胞形態、胞內運輸、染色體運動與細胞分裂等許多生理過程,也常被認為是最穩定的內參基因之一。如在舞毒蛾Lymantriadispar的不同發育階段(Yinetal., 2020)、二化螟Chilosuppressalis幼蟲(Xuetal., 2019)和朱紅毛斑蛾Phaudaflammans(陳煉等, 2021)的不同組織中,TUB均是最穩定的內參基因。特別地,在桉蝙蛾幼蟲不同齡期和不同體節中,TUB均被認為是不穩定的基因(表3),這支持在所有實驗處理中任一內參基因均不能恒定表達的觀點。

從桉蝙蛾幼蟲不同齡期與不同體節中,即使在同一昆蟲個體內,5個基因的表達穩定性都隨著蟲齡和體節的變化而變化(表2、圖3),并不存在絕對穩定表達的內參基因。全樣品處理中的結果表明,當綜合考慮桉蝙蛾幼蟲的齡期與取樣部位2個因素的影響時,可選擇RIB和ACTIN作為內參基因。

在同一齡期不同體節中,ACTIN在12齡幼蟲的不同體節中表達最穩定,但在5齡和9齡幼蟲的不同體節中卻不穩定;同樣地,EF在不同齡期幼蟲的腹部中表達不穩定,但在不同齡期幼蟲的頭部和腹部中表達最穩定(圖3)。這表明幼蟲蟲齡與取樣組織對內參基因篩選的結果具有較大影響,須針對特定齡期和取樣組織選擇合適的內參基因。桉蝙蛾幼蟲的齡級較多(1～12齡),各齡期幼蟲體型差異巨大,且生活史復雜,存在地棲(1～3齡或5齡,低齡幼蟲)與樹棲(5～12齡,中、老齡幼蟲)兩個截然不同的生長發育階段,并以幼蟲形態(12齡,老熟幼蟲)越冬(王緝健等, 2015),推測桉蝙蛾不同齡期幼蟲之間、不同幼蟲體節之間的基因表達存在著較大差異,需區分特定的幼蟲齡期與體節進行研究,而本研究的結果也證明了其必要性。

當然,本研究推薦了在桉蝙蛾幼蟲不同齡期(3齡、5齡、9齡、12齡)與不同體節(頭、胸、腹)中適用的內參基因組合,可為相似實驗處理下桉蝙蛾幼蟲基因表達的研究提供參考,但更多不同的實驗處理未必符合這些設定,故仍需針對具體的實驗處理進行最適內參基因的篩選;同時,雖然在本研究中針對多種處理而篩選出了多組內參基因,但也局限了各內參基因的應用范圍,后續可進一步發掘在桉蝙蛾幼蟲基因表達研究中更為廣譜的內參基因。

本研究結果表明,桉蝙蛾5齡和9齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的頭部和胸部中選擇 2個穩定表達的內參基因較為合適,而3齡和12齡幼蟲的不同體節、不同齡期幼蟲的腹部及全樣本中需選擇3個穩定表達的基因作為內參。在3齡、5齡、9齡和12齡幼蟲的不同體節中,可選擇ACTIN+RIB+GAPDH、EF+RIB、GAPDH+EF和ACTIN+RIB+GAPDH作為內參;不同齡期幼蟲頭部、胸部和腹部推薦的內參基因組合分別為EF+RIB、RIB+GAPDH和EF+GAPDH+ACTIN;同時考慮桉蝙蛾幼蟲不同齡期與不同體節的因素時,推薦RIB、ACTIN和GAPDH作為內參基因。