高溫對川硬皮腫腿蜂發育及Wolbachia攜帶的影響

唐艷龍，康 奎，陳思琪，王麗娜，車華濤，王小藝，魏 可*

（1.遵義師范學院生物與農業科技學院/貴州省赤水河流域動物資源保護與應用研究重點實驗室，遵義 563002；2.中國林業科學研究院森林生態環境與自然保護研究所/國家林業和草原局森林保護學重點實驗室 北京 100091）

川硬皮腫腿蜂Sclerodermussichuanensis是我國繼管氏腫腿蜂S.guaui之后于1994 年在四川瀘縣發現的一種寄生于粗鞘雙條杉天牛Semanotussionanster幼蟲的硬皮腫腿蜂屬天敵昆蟲[1]。川硬皮腫腿蜂寄主搜索能力強、寄主譜廣、繁殖能力強，目前已廣泛應用于松褐天牛Monochamusalternatus、星天牛Anoplophora chinensis、雙條杉天牛S.bifasciatus、花椒虎天牛Clytusvalidus等林木蛀干害蟲的防治[2,3]。

溫度是影響寄生蜂繁殖力和發育速率的關鍵環境因子之一。前期研究發現管氏腫腿蜂在27 ℃下產卵量最高[4]；當溫度在21～33 ℃時，松褐天牛腫腿蜂S.alternatusi各蟲態發育歷期隨著溫度的升高而縮短，且子代數量在27 ℃時最多[5]；白蠟吉丁腫腿蜂S.pupariae幼期發育速率同樣隨溫度的升高而加快，單雌子代數從21 ℃時的58 頭提升至30 ℃時的91 頭[6]。前期研究中有關川硬皮腫腿蜂發育與溫度的關系，發現世代周期隨溫度增加（22～28 ℃）而縮短[1]；川硬皮腫腿蜂適宜貯存在6～15 ℃低溫條件下，12 ℃是其最適貯存溫度[7]。有關該寄生蜂在高溫環境下的生殖和發育特征還未見報道。

沃爾巴克氏體Wolbachia是廣泛存在于節肢動物及線蟲體內的一類胞內共生菌，其可通過胞質不親和、雌性化、殺雄作用、孤雌生殖等方式來調控宿主的生殖方式[8]。近年來應用Wolbachia改變害蟲生殖遺傳特征進而達到種群控制目的已引起廣泛的關注[9,10]。多種寄生蜂中也存在Wolbachia，且它們大多數均與寄生蜂的雌性化和孤雌生殖特征有關[8]。顯然，龐大的雌性種群是生物防治實踐中可采取天敵淹沒式釋放的基礎。利用Wolbachia誘導寄生蜂種群雌性化或產雌孤雌生殖，對寄生蜂的工廠化生產和生防效能提升均有重大意義。相關技術已在松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi中得到應用[11-13]。

Wolbachia有強烈的環境溫度依賴特征，其表達與宿主生存的環境溫度密切相關。對卷蛾赤眼蜂T.cacoeciae、松毛蟲赤眼蜂、食胚赤眼蜂T.embryophagum和麗蚜小蜂Encarsiaformosa的研究發現，宿主在高溫條件下繁育會抑制體內Wolbachia的活性，甚至引起全部Wolbachia失活，并且均有顯著的世代累積效應[14-17]。麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis經30 ℃的熱處理后，體內沃爾巴克氏體密度下降可達74%[18]。前期研究已經發現管氏腫腿蜂體內存在Wolbachia[19]。我們對實驗室繁育的川硬皮腫腿蜂、白蠟吉丁腫腿蜂、松褐天牛腫腿蜂進行分子檢測發現其均攜帶Wolbachia。在腫腿蜂工廠化繁殖中，為了能夠在短時間內獲得更多的天敵產品，往往會采取提高溫度進而縮短腫腿蜂繁殖周期的辦法。那么，在高溫條件下繁育的腫腿蜂，其體內Wolbachia是否受到影響，或者什么樣的溫度條件會影響到腫腿蜂的Wolbachia攜帶率值得探索。另外，腫腿蜂是一類具有高度偏雌性比的寄生蜂，偏雌性比的形成機制目前還未得到解釋。如果在高溫條件下繁育的腫腿蜂其Wolbachia攜帶率下降，是否會引起偏雌性比特征的改變，一樣值得我們研究?；谝陨夏康?，本研究以川硬皮腫腿蜂為研究對象，通過設置不同的溫度進行續代繁育，研究高溫對川硬皮腫腿蜂生殖適合度的影響，同時評價高溫對其體內Wolbachia攜帶率的影響。研究結果可為川硬皮腫腿蜂的繁育和利用提供參考，同時以期為揭示環境溫度依賴的Wolbachia對寄生蜂生殖調控的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

川硬皮腫腿蜂由國家林業和草原局生物防治工程中心提供，實驗室種群由麻天牛Thyestillagebleri幼蟲作寄主續代繁殖得到，繁殖條件為25 ℃，RH 60%～70%，光周期8L:16D。經充分交配后的3 日齡雌蜂為本研究的供試蜂，供試寄主為體質量在200.0～250.0 mg 的麻天牛幼蟲。

1.2 川硬皮腫腿蜂接種

將寄主單頭裝入玻璃指形管內（直徑1.0 cm，高度5.0 cm）。在供試腫腿蜂中挑選個體大小相近的雌蜂，單頭接入盛有寄主的指形管內并用脫脂棉塞緊管口。設置繁蜂溫度為27 ℃、30 ℃和33 ℃，不同溫度條件下濕度和光周期保持一致（RH 60%～70%，光周期8L:16D），每個溫度條件下接種30 管。首次羽化得到的川硬皮腫腿蜂子代記為F1，在此種群中隨機挑選個體大小相近的3 日齡雌蜂繼續接種繁殖，羽化得到的子代記為F2，每個溫度下仍接種30 管。重復上述接種過程，得到在不同溫度條件下續代繁殖的F4腫腿蜂種群。參考項宇等[14]對卷蛾赤眼蜂的研究結果，發現在30 ℃條件下連續繁育5 代后即完全檢測不到卷蛾赤眼蜂體內的Wolbachia。因此，本研究在獲得不同溫度下繁育得到的F4腫腿蜂種群后，用此種群做測定對象，用于對比研究其生殖適合度及Wolbachia攜帶率。

1.3 不同繁育溫度下川硬皮腫腿蜂的生殖適合度

在27 ℃、30 ℃和33 ℃溫度條件下繁育得到的F4中各隨機選取30 頭個體大小相近的3 日齡雌蜂，單頭接種至1 頭麻天牛幼蟲，繼續在3 組溫度條件下繁育。記錄母蜂對寄主的寄生能力差異，包括寄生率和子代羽化率，其中寄生率為被寄生的寄主數量占供試寄主總數的比例，子代羽化率為有子代蜂羽化的寄主數量占供試寄主總數的比例。記錄母蜂產卵前期、子代蜂的發育歷期和數量。產卵前期為接蜂至觀察到第1 粒卵被產出的間隔期。子代蜂發育歷期包括卵歷期、幼蟲歷期、蛹歷期和幼期歷期。其中，卵歷期為第1 粒卵產出至第1 頭幼蟲孵化的間隔期；幼蟲歷期為第1 頭幼蟲孵化至第1 個繭出現的間隔期；蛹歷期為第1 個繭出現至第1 頭成蜂羽化的間隔期；幼期歷期為第1 粒卵產出至第1 頭成蜂羽化的間隔時間。子代蜂發育歷期均是每個接種的指形管內記錄1 次數據，用于代表子代群體的發育進度。子代蜂完全羽化后，統計每頭寄主上育得的雌蜂、雄蜂數量和雄性比。雄性比為1 頭寄主上育得的雄蜂占子代總數的比例。以上均每日記錄1 次。

1.4 Wolbachia 檢測

在不同溫度下繁育得到的F4中各隨機選取30 頭雌蜂（每管1～2 頭），單頭檢測其是否攜帶Wolbachia。腫腿蜂基因組DNA 為單頭提取，方法參照DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）試劑盒說明書。目標檢測基因為wsp基因，通用引物為81F/691R[20]。PCR 擴增使用GoTaq? Green Master Mix（Promega）試劑，反應體系（25 μL）：GoTaq?Green Master Mix 2×為12.5 μL，正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，Nuclease-Free Water 為9.5 μL。反應程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，30 個循環；72 ℃再延伸7 min。PCR 產物通過1%瓊脂糖凝膠（含0.1‰的10×gel red）電泳分離后，凝膠成像系統檢測是否有目標條帶。每頭待檢川硬皮腫腿蜂的DNA 作模板，重復擴增3 次，均無條帶視為不攜帶Wolbachia。統計不同溫度下繁殖的腫腿蜂雌蜂的Wolbachia攜帶率差異。

1.5 數據統計與分析

Fisher’s 精確檢驗用于檢驗不同溫度下川硬皮腫腿蜂的寄生能力差異，同時也用于檢驗經不同溫度連續繁殖后，川硬皮腫腿蜂雌蜂Wolbachia的攜帶率。在不同溫度下繁殖的川硬皮腫腿蜂的產卵前期、發育歷期、子代數量和雄性比用單因素方差分析檢驗處理間差異，LSD 法進行多重比較。雄性比數據通過反正弦轉化后符合正態分布和方差齊性，轉化后的數據用于差異性檢驗。數據統計用SPSS 20 完成。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下川硬皮腫腿蜂的寄生能力

經不同溫度連續繁育4 代后，川硬皮腫腿蜂寄生能力未發生顯著改變。在27 ℃、30 ℃和33 ℃這3個溫度條件下，雌蜂對麻天牛的寄生率均保持在90%以上，寄生率無顯著差異（χ2＝2.944，df＝2，P＝0.363）。同時，在如上3 個溫度條件下，川硬皮腫腿蜂子代羽化率仍無顯著差異（χ2＝0.328，df＝2，P＝1.000），在27 ℃和33 ℃條件下子代羽化率均為90.00%，在30 ℃下子代羽化率為86.67%（表1）。

表1 不同溫度下川硬皮腫腿蜂的寄生能力Table 1 Parasitism ability of S.sichuanensis rearing in different temperatures

2.2 不同溫度下川硬皮腫腿蜂的產卵前期和子代歷期

結果表明，在不同的繁育溫度下，川硬皮腫腿蜂產卵前期存在顯著差異（F＝5.239，df＝2, 82，P＝0.007）。當環境溫度為27 ℃，平均產卵前期為4.63 d。當環境溫度提升至30 ℃后，平均產卵前期顯著延長，為5.37 d；當環境溫度進一步增加時，其產卵前期無顯著變化（圖1）。由表2 可知，川硬皮腫腿蜂子代歷期隨繁育溫度的升高而縮短。環境溫度為27 ℃時平均卵歷期為4.33 d，溫度提升后卵歷期顯著縮短（F＝20.769，df＝2, 82，P＜0.001）。在27 ℃條件下川硬皮腫腿蜂幼蟲平均需約7 d 才能發育至蛹，當溫度提升到30 ℃時縮短至約6 d，提升至33 ℃時平均僅需約5 d，三者差異極顯著（F＝23.239，df＝2,78，P＜0.001）。三組繁育溫度下川硬皮腫腿蜂蛹歷期均存在顯著差異（F＝74.504，df＝2, 77，P＜0.001），溫度升高至33 ℃時平均蛹歷期較27 ℃下縮短了約3 d?？傮w上，繁育溫度升高顯著縮短了川硬皮腫腿蜂的幼期歷期（F＝151.390，df＝2, 77，P＜0.001），在33 ℃時完成幼期發育較27 ℃和30 ℃分別提前了約5 d 和2 d。

圖1 不同溫度下川硬皮腫腿蜂的產卵前期Fig.1 The pre-oviposition period of S.sichuanensis rearing in different temperatures

表2 不同溫度下川硬皮腫腿蜂的子代歷期Table 2 The progeny developmental period of S.sichuanensis rearing in different temperatures

2.3 不同溫度下川硬皮腫腿蜂的子代數量和雄性比

由表3 可知，繁育溫度對川硬皮腫腿蜂子代雄蜂和雌蜂的數量均有顯著影響，但對其子代總量影響不大。子代雄蜂數隨繁育溫度升高而逐漸增多，在三組溫度下單雌平均產雄數分別為2.11 頭（27 ℃）、3.73頭（30 ℃）和7.63 頭（33 ℃），存在顯著差異（F＝4.837，df＝2,77，P＝0.010）。在30 ℃時川硬皮腫腿蜂單雌產雌數最多，平均為54.31 頭；在33 ℃條件下單雌產雌數顯著減少，平均為38.81 頭（F＝3.384，df＝2,77，P＝0.039）。不同溫度條件下，川硬皮腫腿蜂單雌子代總數分別為49.96 頭（27 ℃）、58.04 頭（30 ℃）和46.44 頭（33 ℃），三者無顯著差異（F＝1.919，df＝2,77，P＝0.154）。不同溫度條件下，子代雄性比差異顯著（F＝4.973，df＝2,77，P＝0.009）（圖2）。子代雄性比隨繁育溫度升高逐漸增加；27 ℃時平均為5.01%，30 ℃增加到7.94%，33 ℃時顯著增加到16.09%。

圖2 川硬皮腫腿蜂在高溫下各組子代雄性比的變化Fig.2 The male proportion of S.sichuanensis rearing in different temperatures

表3 不同溫度下川硬皮腫腿蜂的子代數量Table 3 The progeny number of S.sichuanensis rearing in different temperatures

2.4 不同溫度下川硬皮腫腿蜂雌蜂Wolbachia 攜帶率

在不同溫度下連續繁育4 代后，川硬皮腫腿蜂雌蜂的Wolbachia攜帶率存在顯著差異（χ2＝91.638，df＝3，P＜0.001），溫度與攜帶率呈顯著的負相關關系（表4）。在27 ℃條件下繁育4 代的川硬皮腫腿蜂雌蜂的Wolbachia攜帶率仍為100%；但當溫度提升至30 ℃時，其攜帶率下降至50%。在33 ℃條件下繁育4 代后的川硬皮腫腿蜂雌蜂的Wolbachia攜帶率僅有6.67%。

表4 不同溫度下川硬皮腫腿蜂Wolbachia 攜帶率Table 4 Wolbachia infection rate of S.sichuanensis rearing in different temperatures

3 討論

環境溫度是昆蟲機體表現和生態成功的主要決定因素[21,22]。溫度變化可影響機體的具體生物過程，包括行為、生長和發育速度、生殖力和生理代謝等[23-25]。對寄生蜂而言，其生長和發育過程受溫度的影響往往較植食性昆蟲更大，因為溫度不僅直接影響寄生蜂個體的各項生物過程，還通過影響寄主昆蟲的生長發育而間接影響寄生蜂的發育[26,27]。本研究發現，在27、30 和33 ℃三個溫度條件下，川硬皮腫腿蜂雌蜂的寄生能力未發生顯著改變，表明母蜂的寄生行為在該溫度區間內表現無差異，未出現因高溫致死母蜂情況的產生。同時，在不同溫度條件下，可育出子代蜂的比例也無差異，表明此溫度區間同樣適宜川硬皮腫腿蜂幼期發育。對很多容性寄生蜂（寄生蜂產卵后寄主繼續取食發育）而言，環境溫度提升往往會對子代羽化產生負效應，這一結果主要是因為溫度升高后寄主發育加快，可供寄生蜂繁育的特定寄主蟲期縮短，進而影響子代蜂羽化[25,28]。川硬皮腫腿蜂屬抑性寄生蜂，即母蜂在產卵前通過注射毒素麻痹寄主，在幼蜂發育過程中寄主不食不動。因此，溫度對該寄生蜂的影響主要來自于對寄生蜂的直接作用，通過影響寄主進而間接影響寄生蜂發育的可能性較小。

本研究發現，溫度對川硬皮腫腿蜂發育的直接影響主要體現在影響母蜂產卵前期、子代發育進度和子代數量三個方面。川硬皮寄生蜂是一種卵育型寄生蜂，雌蜂麻痹寄主后需取食寄主血淋巴補充營養，完成卵子發育。不同溫度下產卵前期的長短即代表了該溫度下母蜂卵成熟所需的時間。本研究發現，當溫度為30 ℃或更高時，川硬皮腫腿蜂產卵前期較在27 ℃條件下更長。我們認為，雖然設置的3 組溫度對母蜂寄生能力影響較小，但母蜂在27 ℃更容易完成補充營養和卵子成熟的過程，這可能與環境溫度越高時母蜂自身機體能量消耗更大密切相關。相較于對川硬皮腫腿蜂母蜂寄生過程較小的影響外，溫度顯著地影響了子代幼蜂的發育進度。當環境溫度升高時，子代蜂卵歷期、幼蟲歷期、蛹歷期和世代發育歷期均呈顯著縮短，33 ℃下幼期發育歷期較27 ℃時縮短了約5 d。在升溫條件下，寄生蜂的幼期歷期并不是一味地縮短，如倉蛾圓柄姬蜂Venturiacanescens在15～30 ℃下發育歷期隨溫度升高逐漸縮短，但超過30 ℃后發育歷期反而延長[29]；綠眼賽繭蜂Zelechlorophthalmus隨著溫度升高發育歷期變短，但當溫度升至29 ℃后發育歷期又比25 ℃條件下有所延長[30]。在本研究的試驗溫度范圍內未出現川硬皮腫腿蜂發育歷期隨溫度升高而延長的現象，可能和設置溫度未達到其適宜發育溫度的閾值有關，即33 ℃仍是川硬皮腫腿蜂的適宜發育條件，這一結果與前期發現當溫度需升高至35 ℃時才不利于白蠟吉丁腫腿蜂寄生和發育的研究結論一致[6,31]。

在本研究的試驗溫度范圍內，川硬皮腫腿蜂子代數量受溫度影響不顯著，但不同溫度條件顯著地影響了子代蜂的雌雄比例。川硬皮腫腿蜂單雌產雄數和子代雄性比隨溫度升高顯著增加，33 ℃下的單雌產雄數和雄性比例較27 ℃時提升了近3 倍。多種硬皮腫腿蜂的自然性比是高度穩定的偏雌性，在母蜂數量、寄主大小和溫度等條件變化時，偏雌性比會產生一定程度的偏移[5,6,32,33]。母蜂數量增大和寄主質量變差時，往往會產生更多的雄性后代。對于前者，其潛在原因可能是當僅有1 頭母蜂時，子代幼蜂之間的資源競爭更弱，母蜂可以更多地產出雌性子代，這樣即可在子一代就增加親代的適合度。當有多頭母蜂時，寄主資源受到限制，母蜂在這種情況下選擇增加雄性后代比例，這些雄性后代可與其他母蜂的雌性后代交配，如此親代適合度可在子二代實現最大化。對于寄主質量變差時子代雄性比例增加的潛在原因也是歸因于上述的子代蜂資源競爭，而一般認為雄性完成發育所需的寄主資源較雌性更少，所以產雄是在寄主資源受限時的一種生殖權衡。

在溫度升高時，腫腿蜂雄性比例為何增加當前還缺乏相關推論和假設?；趯υ诓煌瑴囟认逻B續繁育4 代后的川硬皮腫腿蜂雌蜂的Wolbachia攜帶率的檢測，我們發現溫度與攜帶率存在顯著的負相關關系。在27 ℃條件下繁育4 代的川硬皮腫腿蜂Wolbachia攜帶率仍為100%，在33 ℃條件下繁育4 代后的川硬皮腫腿蜂Wolbachia攜帶率僅有6.67%。Wolbachia可誘導寄生蜂產雌孤雌生殖，且在未出現產雌孤雌生殖的寄生蜂中，Wolbachia侵染會增加寄生蜂的雌性比例[34-36]。本研究中用于測定生殖適合度的母蜂為在不同溫度下續代繁殖4 代后的個體，即代表了它們在完成寄生行為前攜帶Wolbachia的比例不同。環境溫度升高造成母蜂體內Wolbachia豐度降低或完全失活，進而影響了該菌在寄生蜂生殖中殺雄作用，最終造成雄性比例增多，可能是溫度升高時川硬皮腫腿蜂雄性比增大的原因之一。此外，本研究發現在33 ℃下，經連續4 代繁殖，雌性川硬皮腫腿蜂的Wolbachia攜帶率就不足10%。這一結果預示著，高溫作用下的世代累積效應也許可以完全去除其體內的Wolbachia，以此獲得完全不攜帶該菌的種群。這一途徑相較于通過飼喂抗生素來去除Wolbachia是極大的便利，為研究該菌對腫腿蜂生殖方式的調控機制提供了技術基礎。但Wolbachia在腫腿蜂子代性別分配中的作用方式還需進一步研究。

以管氏腫腿蜂、川硬皮腫腿蜂、白蠟吉丁腫腿蜂和松褐天牛腫腿蜂為代表的腫腿蜂屬寄生蜂是我國林業上廣泛應用的天敵昆蟲，每年都需釋放數億頭腫腿蜂防治害蟲[37]。淹沒式天敵釋放需要以強大的工廠化繁殖技術作保障。溫度提升顯然對縮短腫腿蜂的繁殖周期是有利的。然而我們的研究結果表明，溫度升高會引起雄性后代的比例增多，而過多的雄蜂對生物防治是無效的。此外，若寄生蜂的Wolbachia能水平轉移至害蟲種群中，進而誘導害蟲生殖細胞胞質不親和而產生生殖能力缺陷的個體，對害蟲種群的控制也是有益的。綜上，我們認為繁育溫度過高對川硬皮腫腿蜂生殖適合度是不利的，規?；庇郎囟炔灰顺^30 ℃。