玉米大斑病脅迫下球孢白僵菌對玉米植株的影響及定殖規律

隋 麗，路 楊，遲瑞凱，趙 宇，張正坤*，李啟云*

（1.吉林省農業科學院植物保護研究所/吉林省農業微生物重點實驗室/農業農村部東北作物有害生物綜合治理重點實驗室，公主嶺 136100；2.吉林農業大學植物保護學院，長春 130118）

球孢白僵菌Beauveriabassiana是一種重要的蟲生真菌，在自然環境中普遍存在，能夠通過人工培養實現大量增殖，并廣泛用于農林害蟲的生物防治[1]。近年來，大量研究表明，球孢白僵菌具有植物內生性，可以通過接種葉片、種子或土壤處理，在多種單子葉和雙子葉植物中定殖[2,3]。球孢白僵菌可以為植物提供碳、氮等營養元素，對植物生長過程中的多種生理生化指標產生積極影響，包括提高種子發芽率、促進生物量積累和提升產量等[4,5]。球孢白僵菌在植物內定殖，不僅對植物生長有促進作用，還能提高植物對多種植物病害的抗性，主要表現為發病率降低、延緩發病時期和病情指數下降[6,7]。以上研究表明，球孢白僵菌在植株內的分布和宿存對植物生長及抗病性有直接影響，但其作用機制還有待于進一步探討。

前期有研究證明球孢白僵菌在植株內并非呈靜止狀態，而是受到環境影響會不斷發生移動。費泓強等[8]研究發現球孢白僵菌能夠被植物根部吸收，隨著水分運輸向莖、葉中傳導擴散，且球孢白僵菌在植株各部位具有一定的定殖偏好性，葉片比莖部和根部有著更高的定殖率。McKinnon 等[9]研究了非生物因素對球孢白僵菌在植物內定殖規律的影響，發現當玉米葉片受到模擬草食動物機械傷害脅迫時，接種30 d 后球孢白僵菌在根際的定殖率較對照組顯著升高，表明在傷害脅迫下，植物自身的防御反應可能發生了改變，引起球孢白僵菌在根際宿存量增加。以上研究均表明球孢白僵菌在植物組織內是動態存在的，其分布規律會隨自身或外界環境條件發生改變。但目前鮮有關于植物受到病原菌脅迫情況下，球孢白僵菌在植株內分布規律的相關研究的報道。

本研究以球孢白僵菌、玉米和由玉米大斑病菌Exserohilumturcicum引起的玉米主要葉部病害——玉米大斑病為研究對象，利用球孢白僵菌灌根處理玉米幼苗，預期明確球孢白僵菌對玉米植株生長和抗病性的影響，并進一步探討玉米大斑病脅迫下球孢白僵菌在玉米植株內的定殖擴散規律，本研究將為球孢白僵菌內生定殖防治植物病害機理研究奠定理論基礎，也為玉米大斑病生物防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米品種為先玉335，該品種為大斑病易感品種[10]。

本研究使用的球孢白僵菌為BbOFDH1-5 菌株，該菌株是吉林省農業科學院植物保護研究所生防微生物研究與利用團隊于2008 年從吉林省德惠市（44?34′37′′ N，126?18′59′′ E）采集的亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis僵蟲中分離得到的，并保存于中國農業微生物菌種保藏中心，菌種保存號為ACCC No.32726（GenBank 登錄號：PRJNA178080）。

玉米大斑病病原菌B22 菌株由吉林大學植物科學學院植物保護系提供。以上兩種供試的菌株孢子均保存在15%（v/v）甘油溶液中，試驗前需將菌株保存液涂于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中，26 ℃培養5 d 以對菌株進行活化。

1.2 試驗設計

本研究在吉林省農業科學院植物保護研究所人工氣候室（43?30′56′′ N，124?48′26′′ E）中開展，采取隨機區組設計，盆栽控制試驗。本試驗設置4 個處理，分別為對照組（Control）、球孢白僵菌處理組（Bb）、玉米大斑病菌處理組（Et）和球孢白僵菌＋玉米大斑病菌處理組（Bb＋Et）。每個處理10 株玉米，3 次重復，共計120 株。

1.3 玉米植株的培養

玉米種植采用的花盆尺寸為直徑14 cm，高16 cm，底部有直徑1 cm 的通氣孔，每盆裝入泥炭土450 g（Pindstrup，丹麥），澆入200 mL 無菌水使盆中泥炭土充分潤濕。選取1000 粒大小均一、籽粒飽滿的玉米種子，按照Sui 等[11]描述的方法對其進行表面消毒。將經表面消毒處理的種子放入無菌培養皿中，加入無菌水在26 ℃培養箱中進行催芽處理，共3 d，期間每天更換一次無菌水。選取發芽程度均一的玉米種子進行播種，每盆播種3 粒。各處理隨機排列，定期澆水，出苗后每盆留苗兩株。培養條件為（25±2）℃，濕度為（70±5）%，光周期為16 L : 8 D。

1.4 球孢白僵菌接種方法及定殖率檢測

采用無菌藥匙將球孢白僵菌氣生孢子從PDA 平板中刮下，將適量球孢白僵菌孢子加入0.1%（v/v）吐溫-80 溶液中配制濃度為1×108個孢子/mL 的球孢白僵菌孢子懸液。待玉米苗生長至4～5 葉期時，采用灌根法將配制的球孢白僵菌孢子懸液接種到玉米植株中，接種量為20 mL/株，每隔24 h 灌根1 次，共灌根3 次。

按照Sui 等[11]描述的方法對球孢白僵菌處理的玉米葉片進行定殖檢測。在最后一次灌根處理48 h 后選取第3 個完全展開的葉片。白僵菌在玉米葉片定殖率的計算公式如下：

定殖率（%）＝白僵菌定殖的玉米株數/處理組總株數×100。

1.5 玉米大斑病菌接種方法

采用無菌藥匙將玉米大斑病菌孢子從PDA 平板中刮下，加入到0.1%（v/v）吐溫-80 溶液中配制濃度為1×105個孢子/mL 的玉米大斑病菌孢子懸液。在球孢白僵菌接種后24 h，將配制的玉米大斑病菌孢子懸液接種至玉米葉心，每株玉米接種玉米大斑病菌分生孢子懸浮液200 μL[12]。

1.6 球孢白僵菌對玉米植株生長、生理指標的測定

在進行球孢白僵菌處理后的第7 d、14 d、21 d 分別測定植株葉片葉綠素、氮含量及株高。玉米株高為栽培基質表面至植株葉片最頂端之間的長度；玉米葉片葉綠素和氮含量利用手持TYS-B 型葉綠素測量儀（浙江托普云農科技股份有限公司）進行測定，測量部位為完全展開的第3 片葉片中心位置。

1.7 玉米大斑病發病率統計

在玉米大斑病菌孢子懸浮液接種后約4～5 d，玉米葉片開始出現邊緣暗褐色、中央淡褐色的斑塊時，此后每隔7 d 觀察記錄每個處理組中玉米葉片的發病情況，玉米大斑病發病率的計算公式如下：

玉米大斑病發病率（%）＝每個處理玉米植株發病總數/調查玉米植株總數×100。

1.8 玉米葉片及玉米根際土壤取樣方法

玉米大斑病發病3 d 后取樣，每隔7 d 取一次樣品，共取樣3 次。葉片的取樣部位為完全展開的第三片葉片，每株截取相同長度葉片中心部位，用錫紙包裹后迅速放入液氮速凍后-80 ℃保存。同時采集玉米根際土樣品，每個處理隨機選取5 株玉米，獲取每株玉米取根際土壤，-80 ℃保存。

1.9 玉米植株根際土壤球孢白僵菌分離及鑒定

將不同處理的根際土壤樣品分別混合，每個處理取1 g 根際土壤樣品，裝入盛有20 顆直徑3 mm 95%氧化鋯珠和10 mL 0.05%（v/v）吐溫-80 溶液的錐形瓶，每個處理5 次重復，共20 瓶。160 r/min 震蕩1 h，將土壤溶液稀釋100 倍，取100 μL 土壤懸浮液均勻涂在PDA 平板上，2 d 后統計球孢白僵菌的菌落數量。

采用平板菌落計數法[13]，計算球孢白僵菌菌落數量，公式如下：菌落數量（cfu/g）＝MD/W，其中M為菌落平均數；D 為稀釋倍數；W 為土壤烘干質量（g）。

為驗證所計算菌落是否為球孢白僵菌，每個處理隨機選取疑似球孢白僵菌菌落，利用光學顯微鏡進行形態學鑒定，并進行PDA 平板培養，在26 ℃暗培養條件下培養14 d，刮取分生孢子，提取總DNA，利用真菌通用ITS 引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′進行分子鑒定。

1.10 玉米葉片中球孢白僵菌與大斑病菌的熒光定量檢測

將不同處理的各重復收集的玉米葉片樣品分別混合，利用CTAB 法提取基因組DNA。將提取的基因組DNA 通過Nanodrop Lite （ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）進行濃度測定后，將所有玉米葉片基因組DNA 稀釋至濃度為1000 ng/μL 作為qPCR 反應的模板。以球孢白僵菌18S rDNA[14]、玉米大斑病菌管家基因EF-1ɑ[15]和玉米管家基因Etcpr1作為相對定量參考基因設計特異性引物（表1）。

反應體系為：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，引物各0.5 μL，總DNA 1 μL，ddH2O 補足20 μL，利用QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR 儀（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）進行檢測。PCR 程序設置為95 ℃預變性反應30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個反應循環；熔解曲線為賽默飛世爾科技QuantStudio 6 默認采集程序。采用2-ΔΔCT相對定量法[16]分別檢測玉米大斑病菌EF-1ɑ、球孢白僵菌18S rDNA 基因在樣品中的表達情況。

1.11 數據統計與分析

采用SPSS 26 軟件（IBM，USA）對數據進行描述性統計及方差齊性檢測，并通過Duncan’s 方法進行多重比較及顯著性分析，利用GraphPad 8.0.2 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌在玉米中定殖情況

將球孢白僵菌處理后的玉米葉片樣品進行表面消毒，然后放置在PDA 培養基中檢測葉片中球孢白僵菌內生定殖率。培養第5 d 時，玉米葉片邊緣由內而外長出白色可見的球孢白僵菌菌絲；培養第7 d，玉米葉片周邊已形成明顯的球孢白僵菌菌落（圖1）。結果表明，采用灌根方式接種的球孢白僵菌能夠成功定殖到玉米植株中并從玉米葉片中分離出來，定殖率達到68.18%。

圖1 球孢白僵菌在玉米葉片內生定殖的代表性結果Fig.1 Representative results of endophytic colonization of maize leaves by B.bassiana

2.2 球孢白僵菌和玉米大斑病菌在玉米植株內的分布規律

玉米根際土壤中球孢白僵菌分離鑒定結果表明，PDA 選擇培養基篩選到的菌落為球孢白僵菌（圖2）。隨機選取PDA 平板上長出的球孢白僵菌菌落，通過光學顯微鏡觀察發現，菌落孢子形態為卵圓形，直徑3～5 μm，與球孢白僵菌氣生孢子一致（圖2a）；1%瓊脂糖凝膠電泳顯示菌液PCR 結果為單一的目的條帶，經測序顯示與球孢白僵菌菌株ITS 序列同源性為100%，確定為球孢白僵菌（圖2b）。

圖2 玉米根際土壤球孢白僵菌鑒定Fig.2 Identification of B.bassiana in maize rhizosphere soil

球孢白僵菌灌根和接種大斑病菌對玉米植株根際土壤中球孢白僵菌含量具有顯著影響（圖3）。玉米大斑病發病第7 d、第14 d 和第21 d，Bb 處理組中玉米植株根際土壤球孢白僵菌含量均顯著高于Control 處理組；同時，Bb＋Et 處理組中玉米植株根際土壤球孢白僵菌含量均顯著低于Bb 處理組，且隨著時間增加Bb＋Et 處理組中球孢白僵菌含量逐漸減少，分別降低17.44%、75.96%和94.92%。結果顯示當植株受到病害脅迫時，根際土壤中球孢白僵菌含量呈逐漸降低的趨勢。

圖3 玉米根際土壤球孢白僵菌含量Fig.3 Content of B.bassiana in maize rhizosphere soil

利用熒光定量PCR 技術采用相對定量的方法，分析了處理組和對照組葉片中球孢白僵菌和玉米大斑病菌的表達量。在玉米大斑病發病第7 d、14 d 和21 d，Bb＋Et 處理組玉米葉片中球孢白僵菌的相對表達量比Bb 處理高（圖4a），同時，Bb＋Et 處理組在7 d、14 d 以及21 d 葉片中玉米大斑病菌的相對表達量比Et 處理組低（圖4b），表明球孢白僵菌在玉米植株內定殖，能夠降低玉米大斑病菌含量，抑制玉米大斑病菌增殖。

圖4 玉米葉片中球孢白僵菌和大斑病菌相對表達量Fig.4 Relative expression level of B.bassiana and E.turcicum in maize leaves

2.3 球孢白僵菌定殖對玉米植株生長指標的影響

玉米植株接種球孢白僵菌后，葉片中葉綠素含量隨著時間變化會發生一定的改變。當接種球孢白僵菌7 d后，經球孢白僵菌灌根處理后玉米植株（Bb）的葉綠素含量顯著高于Control 組（圖5a）；球孢白僵菌接種第14 d，各處理組葉綠素含量變化不顯著（圖5b）；球孢白僵菌接種第21 d，Bb 和Bb＋Et 處理組的葉綠素含量顯著高于Control 組和玉米大斑病菌處理組（Et）（圖5c）。然而各處理組間玉米葉片樣品中氮含量無顯著差異（圖6）。

圖5 球孢白僵菌定殖對玉米葉片中葉綠素含量的影響Fig.5 Effects of B.bassiana on chlorophyll content in maize leaves

圖6 球孢白僵菌定殖對玉米葉片中氮含量的影響Fig.6 Effects of B.bassiana on nitrogen content in maize leaves

球孢白僵菌接種處理后第7 d，Bb 處理組的株高顯著高于其他處理組（圖7a）。球孢白僵菌接種第14 d，Bb 處理的株高顯著高于其他處理組，Et 處理組的植株高度則顯著低于對照組，Bb＋Et 處理組株高比Et 處理組有升高趨勢，升高9.32%（圖7b）。球孢白僵菌接種第21 d，Bb 處理組的植株高度顯著高于其他處理組，Bb＋Et 處理組植株高度顯著高于Et 處理組（圖7c）。

圖7 球孢白僵菌定殖對玉米植株高度的影響Fig.7 Effects of B.bassiana on maize height

2.4 球孢白僵菌定殖對玉米大斑病的影響

球孢白僵菌定殖對玉米大斑病的發病率有顯著影響。玉米植株接種玉米大斑病菌第7 d，Et 處理組發病率為56.67%，Bb＋Et 處理組發病率相對于Et 處理組顯著降低，僅為26.67%（圖8a）；玉米植株接種玉米大斑病菌第14 d 和第21 d，Et 處理組玉米大斑病的發病率均為83.33%，而Bb＋Et 處理組發病率僅為36.67%（圖8b，8c）。3 次調查結果顯示，經過球孢白僵菌定殖處理的玉米植株發病率相比于只接種玉米大斑病菌侵染的玉米植株發病率均顯著降低，接菌7 d 后Bb＋Et 處理組比Et 處理降低30.00%，第14 d 和第21 d 后降低46.67%。結果表明球孢白僵菌內生定殖可有效提高玉米植株對玉米大斑病的抗性。

圖8 球孢白僵菌定殖對玉米大斑病發病率的影響Fig.8 Effects of B.bassiana on the incidence rate of corn leaf blight

3 討論

本研究采用灌根方式將球孢白僵菌接種到玉米植株內，球孢白僵菌定殖能夠對植株生長產生積極影響，同時能顯著降低玉米大斑病菌引起的玉米大斑病的發病率。通過對玉米植株根際白僵菌含量和葉片中白僵菌、大斑病菌含量調查分析，發現了球孢白僵菌在玉米大斑病菌誘導下的動態分布規律，即受到大斑病菌侵染時，玉米植株能夠從根際土壤中“招募”球孢白僵菌，使球孢白僵菌在葉片聚集，進而提高自身對病原微生物的抗性，降低發病率。

近年來，國內外已有大量研究證明球孢白僵菌能夠在多種植物中定殖，并且能夠提高植物的多項生長參數[17,18]。例如，Castillo López 和Sword[19]發現球孢白僵菌定殖能夠增加陸地棉Gossypiumhirsutum的植物高度，并能增大果實的尺寸；Sánchez-Rodríguez 等[20]利用浸種法和灌根法將球孢白僵菌接種到小麥中，能夠增加小麥株高、穗重量和根長度；在前期研究中，我們也發現球孢白僵菌在玉米中定殖能夠使玉米植株高度增加并增加玉米葉面積[21]。在本研究中，我們不僅再次驗證了球孢白僵菌定殖能夠促進玉米植物高度增加，還發現白僵菌定殖能夠提高玉米葉片中葉綠素含量，但對氮含量無顯著影響。該結果與Qin 等[22]研究結果類似，他們發現球孢白僵菌內生定殖能夠提高煙草植株的葉綠素含量以及凈光合速率，但對植物氮元素的積累不產生影響。以上研究從植物生長角度證明了球孢白僵菌定殖對植物產生的積極作用。除了促進植物生長，球孢白僵菌定殖還能夠提高宿主植物對生物脅迫（病害、蟲害）的抗性[23,24]。本研究中，我們發現球孢白僵菌在玉米植株中內生定殖，能夠降低玉米大斑病的侵染，即球孢白僵菌的定殖顯著降低了玉米大斑病的發病率。

當植物受到外界因素脅迫時，植物體內與植物共生的微生物群落會產生響應，與植物共同抵御外來侵害。植物不僅利用自身內生定殖的微生物群體來抑制病原體，而且還可以從環境中吸引有益的微生物來應對外界不同的侵染，這被稱為“呼救”策略，這種植物與微生物的相互作用被認為是維持植物健康的關鍵因素[25,26]。本團隊前期研究結果表明，球孢白僵菌在玉米植株內呈現自下而上的定殖擴散規律，并且偏好于定殖在植物葉片[8,21]。本研究中，我們發現玉米大斑病菌能夠對球孢白僵菌在玉米植株內的分布產生影響，作為重要的葉部病害病原菌，玉米大斑病菌侵染后，玉米葉片中球孢白僵菌含量顯著增加，而根際土壤中球孢白僵菌數量則下降，說明玉米植株在受到病原菌脅迫的情況下，球孢白僵菌能夠在寄主植株內定向遷移。這一現象同國外的一些研究相似，例如，微桿菌屬Microbacteriumsp.、假單胞菌屬Pseudomonassp.、寡養單胞菌屬Stenotrophomonassp.和黃單胞菌屬Xanthomonassp.的菌株，經常被發現在植物中受害部位富集，以協助宿主植株抵御不同病原體或者害蟲的侵染[27]。Chang 等[12]研究表明，當球孢白僵菌內生定殖于玉米植株時，會改變玉米葉片細菌和真菌的相對豐度，主要提高了玉米葉片中假單胞菌屬和伯克霍爾德菌屬Burkholderiasp.的相對豐度。已有研究表明，假單胞菌屬和伯克霍爾德菌屬在體外對峙培養中能夠有效抑制玉米大斑病菌菌絲的生長[28]，在本研究中，在玉米大斑病脅迫下，招募球孢白僵菌至發病部位，通過提高對玉米大斑病菌有抑制作用的假單胞菌屬和伯克霍爾德菌，實現抗病作用。此外，有益微生物對病原菌的抑制作用很大程度上取決于二者對宿主植物中有限營養源的獲取和生態位競爭，蟲生真菌成功定殖后就會占據生態位并且從寄主體內獲得養分，引起病原菌可利用的資源不足以維持生長，從而抑制病原菌增殖，使植物病情指數下降，發病率降低[29]。本文中球孢白僵菌和玉米大斑病之間的互作結果也符合這一規律，說明球孢白僵菌通過植株的招募作用，與病原菌產生互作進而降低植株發病率，對植物產生積極影響。

綜上所述，本研究明確了球孢白僵菌定殖能夠促進玉米植株生長并提高其抗病性，證明了在玉米大斑病脅迫下，玉米植株能夠招募球孢白僵菌向發病部位募集，增強自身的防御能力。本研究加深了對蟲生真菌內生定殖提高植物抗病性作用機制的理解，能夠為蟲生真菌的抗病性研究奠定理論基礎。