非梗阻性無精子癥的遺傳學病因及治療研究進展

謝金龍

(濰坊市人民醫院生殖醫學中心,山東濰坊 261000)

不孕不育癥嚴重影響著人類的生殖健康[1],發病率高達15%～20%,其中男性因素占到50%[2]。無精子癥是男性不育的嚴重類型,分為梗阻性無精子癥(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性無精子癥(nonobstructive azoospermia,NOA)2大類,其中OA約占40%、NOA約占60%。NOA主要是由精子發生或者成熟障礙引起,其病因復雜,包括隱睪、腮腺炎引起的睪丸炎后遺癥等繼發性睪丸損傷、Klinefelter綜合征、Y染色體微缺失、基因突變等。目前缺乏使患者恢復生精功能的治療策略,有研究行術前激素治療[3]、改善睪丸生精微環境[4]、干細胞療法[5]等策略,希望找到精子結合卵胞質內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)獲得遺傳學子代。本文就非梗阻性無精子癥的遺傳學病因及治療研究進展予以綜述。

1 遺傳學病因

1.1 NOA與基因突變NOA常與基因突變有關,目前有超過2 000個基因已被證明與人類精子發生有關[6]?？截悢底儺?copy number variation,CNV)和單核苷酸多態性也是男性不育的危險因素,但是很少有研究提供功能和生物學證據來驗證這些變異為致病基因[7]。越來越多的證據表明,TEX11和TEX15在NOA不育男性中發生突變,導致減數分裂停止[8-9]。WU[10]、YANG等[11]報道TDRD9、FOXP3導致精原干細胞的凋亡,TEX11、SYCE1、PAK1、ADGRG2、TEX14、KASH5導致減數分裂阻滯,SOHLH1、ZMYND15、DMC1、PABPC1、WT1、CFAP65、RNF212等導致NOA。

1.2 NOA與DNA甲基化MCSWIGGIN等[12]研究表明DNA甲基化異?？赡軐е履行圆挥?。雄性生殖細胞的DNA甲基化從有絲分裂和減數分裂的生殖細胞開始,減數分裂粗線期階段完成[13]。精子中異常的DNA甲基化可能導致男性不育并將其遺傳給后代,而后代在以后的生活中可能更容易患上疾病。吸煙對DNA甲基化也有很大的影響,它通過改變MAPK8IP和TKR基因區域的CpG甲基化模式,導致精子數量減少、活力下降和精子形態缺陷[14]。生殖相關基因Nme2、Trim27、ICR、H19、SNRPN、Sort和Pebp1的低甲基化對小鼠精子發生和精子活力產生了負面影響[15]。SOX30啟動子處的DNA高甲基化有助于其在NOA中的表達沉默,SOX30水平的降低與NOA疾病的嚴重程度有關。SOX30在小鼠體內的缺失會損害生精細胞和阻滯精子發生,導致雄性不育,但是SOX30不影響卵巢發育和女性生育能力[16]。

1.3 NOA與染色體異常和Y染色體微缺失

1.3.1染色體異常 遺傳疾病是無精子癥的主要原因之一,包括染色體異常、單基因疾病、多基因疾病、表觀遺傳疾病等[17]。Klinefelter綜合征是NOA中最常見的染色體異常疾病,而少精子癥在常染色體結構缺陷男性中更為常見[18]。Klinefelter綜合征是導致不育癥的主要原因之一,典型表現為小睪丸、性腺功能減退和認知障礙。Klinefelter綜合征與心血管異常、自身免疫性疾病、代謝紊亂、認知或精神健康問題相關,也可能增加死亡風險[19]。

2 NOA患者的治療策略

2.1 激素優化治療內源性睪酮(intratesticular testosterone,ITT)水平低下、睪酮與雌二醇比例異?？赡芘cNOA的病理生理學有關[25],因此以改善精子發生的激素生精微環境為目的的治療可能有益。王澍弘等[26]報道38例NOA患者應用來曲唑治療后有1例患者精液中發現了精子,37例患者的Johnsen評分較前改善。LAURSEN等[27]報道了8例NOA患者,給予每周2次人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)治療,結果提示促性腺激素治療后改善了生精功能,4例患者睪丸中找到了精子。在一項非隨機多中心研究中,442例男性NOA患者接受了取精手術,激素優化治療組的精子獲取率(57%)優于未行激素優化治療組(34%)[28]。盡管文獻表明激素優化治療可能對NOA患者有益,但現有證據的數量和質量不足以推薦激素優化治療作為標準臨床治療方案。

睪酮是精子發生過程中的必需激素,它通過對miRNA的調節有助于維持支持細胞和生殖細胞的緊密連接。睪酮的缺失會導致血睪屏障的破壞,發育中的精子生殖細胞從支持細胞過早脫離,并阻止成熟精子從支持細胞釋放以及生殖細胞被吞噬[29]。血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)和睪酮都是促進精子完全發生所必需并且兩種激素對精子發生有協同作用,FSH調節睪丸功能并刺激支持細胞產生雄激素結合球蛋白,這有助于維持較高的ITT濃度[30]。

2.1.1血清激素水平與精子獲取的關系 LI等[31]研究表明術前FSH水平并不能良好預測NOA患者顯微取精手術獲精率。在行顯微取精的患者中,血清FSH水平較高(>15 mU/mL)和FSH水平較低的NOA患者有更高的獲精率。NOA患者中,基礎血清FSH水平與精子發生和精子獲取率無關[32],因此其預測NOA患者對激素治療的反應性欠佳。CAROPPO等[3]通過研究進行分析,指出睪酮水平正常比睪酮水平低下的克氏征患者有更高的精子獲取率。同樣國內安庚教授團隊[33]一項回顧性隊列研究分析,針對395例NOA患者給予顯微取精術前HCG/HCG加高純度尿FSH治療3個月,結果顯示術前促性腺激素治療組和非促性腺激素治療組獲精率的差異具有統計學意義(31.2%vs.19.5%),使用傾向性評分加權-逆處理概率加權法(inverse probability of treatment weighting,IPTW)進行多變量邏輯回歸模型分析顯示術前促性腺激素治療與獲精率之間存在相關性(OR1.59;95%CI：1.02～2.52;P=0.042)。因此,血清FSH水平高或非常高不應阻止使用外源性FSH刺激精子發生。

2.1.2睪丸顯微取精術(microdissection testicular sperm extraction,MD-TESE)術前接受激素治療 研究發現外源性促性腺激素對恢復無精子癥伴促性腺功能減退的男性的精子發生有效。盡管部分NOA患者存在較高的FSH和LH水平,依然術前進行激素治療來改善精子發生的睪丸微環境,使得Leydig細胞對高劑量HCG刺激產生的睪酮產生反應[34]。同時由于睪酮和抑制素B對下丘腦-垂體-性腺軸的負反饋減弱導致促性腺激素脈沖頻率和幅度的改變來保持激素應答,因而可以使用外源性促性腺激素或選擇性雌激素受體調節劑來改變內源性促性腺激素分泌改善生精環境,促進精子生成。有研究表明,與單純HCG刺激相比,FSH加HCG刺激支持細胞雄激素受體(androgen receptor,AR)表達增加[35]。在REIFSNYDER等[36]的研究中,接受激素治療(n=307)和不接受激素治療(n=41)的睪酮水平低下的NOA患者獲精率沒有差異;而在HUSSEIN等[28]的研究中,接受激素治療的男性的獲精率(61.7%,306/496)明顯高于未接受激素治療的男性(33.6%,39/116),10.9%(54/496)的患者在治療后精液中發現了精子。

現有研究的結果雖然表明有希望改善NOA患者獲精率,但不足以推薦每個NOA患者行激素治療[37]。正如美國泌尿外科學會(American Association of Urology,AUA)/美國生殖醫學會(American Society of Reproductive Medicine,ASRM)關于男性不育的診斷和管理指南,NOA患者應該在手術干預前被告知有限的藥理學的數據[38-39]。

2.1.3激素優化治療未來需求及方向 NOA患者的管理在很大程度上是基于循證醫學證據。由于過去20年的文獻提供的證據,大約50%的NOA患者可能成功地獲得他們的睪丸精子,與其他可用的手術技術相比,顯微取精在獲精率方面提供了更好的結果[40]。對睪酮水平正常與低下患者的獲精率的研究表明,在顯微取精治療前,睪酮水平低下的NOA患者行激素優化治療,可能改善獲精率。ITT在睪丸內的濃度比血液循環中的濃度高100～1 000倍,但目前在人和動物身上維持精子發生的合適ITT濃度尚不明確。為了提高我們在這一領域的知識,識別能夠可靠預測ITT水平并用于治療后ITT水平監測的血清生物標志物可能會有所幫助。因此,血清17-OHP和INSL3水平在一定程度上與ITT水平相關,這可能為新的研究方向提供思路。

在NOA患者中,FSH對于促進精原細胞增殖至關重要[41]。盡管許多研究都對FSH治療男性少精子癥的可行性進行了研究,但是很少有研究試圖評估單獨使用FSH提高NOA患者獲精率的效果。事實上,FSH可能獨立于睪酮維持精子產生,這一發現在激活FSHR突變的轉基因雄性小鼠中發現,這可能促使進一步研究高劑量FSH治療男性NOA。

激素治療是否有助于提高NOA患者的生殖潛能,研究時設計大樣本量、嚴格的入組標準和評價指標至關重要。目前證據不足以支持NOA患者術前不加選擇地使用激素治療。

2.2 生精微環境改善治療NOA深入研究生理狀態下生精微環境的建立和成熟過程,是理解NOA患者發病原因和病程的重要理論基礎。ZHAO等[42]發現支持細胞的成熟是生精微環境功能形成過程中的關鍵事件。未成熟的支持細胞處于以氧化磷酸化為主的活躍代謝狀態,成熟的支持細胞主要通過糖酵解途徑進行低水平的能量代謝。該團隊以正常發育圖譜作為標尺,通過對比3類最常見的NOA(克氏綜合征、Y染色體微缺失和特發性NOA)睪丸組織單細胞測序結果,發現特發性NOA支持細胞表現為發育過程的譜系退化;而同樣缺乏生殖細胞的Y染色體微缺失和克氏綜合征患者,其支持細胞表現為細胞凋亡、異常免疫反應和激素代謝紊亂等病理性變化。該團隊分析發現Wnt/β-catenin信號通路的激活是幼稚型支持細胞和特發性NOA支持細胞共有的典型特征,提示其在調控支持細胞成熟中的重要作用。雖然Wnt/β-catenin通路在所有患者中都被激活,但Wnt/βcatenin通路的負調控因子HOPX在Stage_a支持細胞中不表達,而在Stage_c細胞中高表達。HOPX被認為是通過抑制Wnt信號通路來促進干細胞成熟的。通過抑制Wnt信號的抑制劑處理細胞,成功地促進了支持細胞的部分成熟,其可以維持精原性干細胞的增殖,提示其支持、營養生殖細胞功能的改善[43]。

在NOA患者中,支持細胞具有明顯不成熟和異質性。生殖細胞本身也會影響微環境中的細胞,恢復成熟的微環境可能激活局部的生精灶。

2.3 干細胞治療NOA干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細胞。根據來源可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)及成體干細胞(adult stem cells,ASCs)。ESCs指早期胚胎中的全能干細胞,ASCs指組織中可定向分化為特異組織的干細胞,如精原干細胞(spermatogonia stem cells,SSCs)、間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 等。

ZHOU等[44]報道了來自小鼠ESCs在體外誘導成原始生殖細胞樣細胞(primordial germ cell like cells,PGCLCs),PGCLCs與KITW/KITW-V小鼠出生早期睪丸細胞共培養,實現了體外完整的減數分裂產生,獲得單倍體精子樣細胞,ICSI后產生可育的后代。人成纖維細胞來源的重編程hiPS在BMP4、BMP8等細胞因子誘導下可以形成PGCLCs、減數分裂前的生殖細胞、減數分裂細胞、單倍體配子樣細胞,但尚未能形成成熟精子并產生胚胎。但倫理問題、成瘤性及免疫排斥反應制約了ESCs 的臨床應用。

人SSCs和支持細胞在體外共培養產生圓形精子,注射到人卵子可受精并形成囊胚,但胚胎并不能夠達到桑葚胚階段,且伴有染色體異常。目前,人SSCs體外增殖培養雖然已經實現,但是培養難度大,長期培養SSCs會發生表型改變,且尚未實現人SSCs 體外誘導分化形成精子,距離臨床應用也有距離[45]。SLCs是一類睪丸間質細胞,可分泌睪酮影響睪丸微環境,可增殖并定向分化為間質細胞。ZANG等[46]通過移植CD51+、Nestin+的SLCs能夠使小鼠雄激素水平升高,通過調節睪丸生精微環境改善生精功能,恢復生育力。

3 總結與展望

隨著arrays-CGH、GWAS、WGS、NGS等新型高通量方法的快速發展,越來越多的潛在致病基因和與不育癥相關的新基因被發現,為明確NOA的遺傳學病因提供了參考依據,從而為尋求NOA治療靶點提供研究思路。NOA患者雖然經過激素治療、干細胞療法、改善生精微環境、睪丸顯微取精等手段,約50%患者可以獲取到精子通過ICSI獲取子代,滿足患者的生育需求,但是仍有很大比例的NOA患者無法獲得精子,只能通過供精來生育子代,帶來了許多倫理與社會問題。因此未來仍需要通過大樣本、高質量的研究來評估改善生精功能,明確預測指標、如何提高獲精率將是下一步工作的重點。