DNA條形碼在浙江省蜉蝣目稚蟲昆蟲多樣性中的應用

高亞杰, 張立華, 陳 敏, 樂傅凱麗, 張加勇

(1.阿克蘇職業技術學院, 新疆 阿克蘇 843000; 2.泰順縣自然資源和規劃局, 浙江 溫州 325500; 3.永康市野生動植物保護管理站, 浙江 永康 321300; 4.浙江師范大學 生命科學學院, 浙江 金華 321004)

0 引言

【研究意義】蜉蝣目(Ephemeroptera)隸屬于節肢動物門(Arthropoda)、六足總綱(Hexapoda)、昆蟲綱(Insecta)?，F今世界已報道的蜉蝣目昆蟲有37科376屬3 085種[1-3]。截止2022年10月,中國報道了21科307種蜉蝣,其中,臺灣地區特有的58種,除去臺灣特有種,大陸蜉蝣種類249種。浙江省蜉蝣種共有13科34屬62種,其中,22種蜉蝣只報道了成蟲單一階段[4-17]。蜉蝣目昆蟲是對水質最為敏感的三大水生昆蟲(蜉蝣目、毛翅目、襀翅目)之一[18],同時蜉蝣是公認的可以應用于生態研究與生物監測研究的昆蟲[19],在EPT法和全生物法等監測水質的主要方法中起重要作用。這類昆蟲一般生活于未污染水體中[20],其稚蟲是流動清潔水體的主要底棲昆蟲,對水質中營養鹽、重金屬、溫度、pH和溶解氧等極為敏感[21]。此外,不同種類的蜉蝣對水體耐污值不同,如細蜉科(Caenidae)突唇蜉屬(Clypeocaenis)的蜉蝣耐污值較高;小蜉科(Ephemerellidae)天角蜉屬(Uracanthella)、鱟蜉科(Prosopistomatidae)鱟蜉屬(Prosopistoma)等蜉蝣耐污值較低。在水體質量的生物學評價工作中,蜉蝣目種類和數量的變動能準確反映水質的變化和污染程度,對蜉蝣目生物多樣性的研究有利于水質監控的研究[22]。然而,蜉蝣種類的形態鑒定由于稚蟲和成蟲發育階段差異、雌雄差別等難題,造成蜉蝣分類困難,需要大量的樣本材料并經過專業訓練的人員才能完成分類,從而制約了利用蜉蝣在水質監控中的應用。因此,在蜉蝣目昆蟲多樣性研究中應用分子手段將有積極意義?！厩叭搜芯窟M展】DNA條形碼技術可以作為生物鑒別的一種快速補充工具,有效解決形態學鑒定的難題[23]。在昆蟲分類中,DNA條形碼技術得到廣泛應用[24]。這種以序列為基礎的鑒定方法可使研究者客觀地獲取數據,不受生物體發育階段的影響[25],避免了稚蟲和成蟲形態差異大造成鑒定上的爭議,有效彌補了形態學鑒定方法上的不足[26]。利用DNA條形碼進行物種分類研究時,通常選擇線粒體COI基因[27]。因其具母性遺傳、基因重組率低、遺傳差異高、進化速率快等優點[28-30]。COI基因在確定隱存物種方面也具有較多的應用,如STAHLS等[31]用COI條形碼證明了蜉蝣目中存在的隱存多樣性;張媛等[32]運用COI基因對鞘翅目昆蟲探究了系統發育關系;STIGENBERG[33]通過28S和COI 2個分子標記發現了繭蜂的隱存種;FREY等[34]以COI序列為手段發現入侵物種實蠅中存在隱存復合體;張明等[35]利用COI基因片段結合雄性成蟲尾器形態特征,對雙翅目麻蠅屬54個種30個亞屬進行分類初步探明,各亞屬的分類地位以及系統發育關系;YAAKOP等[36]探討束蛾物種的生命周期時借助COI基因發現束蛾隱存種;FAILLA等[37]綜合運用形態學與COI條形碼的手段,試圖鑒定幾種未知蚊類幼蟲的種類,最終確定這些幼蟲是搖蚊科昆蟲的幼蟲。COI基因已被證明適用于大范圍的生物類群的識別,并在水生昆蟲中大量應用[38],特別在物種多樣性研究中能夠快速準確的鑒定,有效發現隱種?！狙芯壳腥朦c】DNA條形碼技術不受生物體發育階段的影響,使用標準化的分子標記進行物種準確鑒定的技術,利用序列作為標記與物種信息建立對應關系,彌補形態學鑒定的難題?！緮M解決的關鍵問題】利用形態與分子相結合的方法分析浙江省內蜉蝣目稚蟲昆蟲多樣性,并與之前浙江省已報道的蜉蝣目昆蟲進行比較,以系統地了解浙江省蜉蝣目昆蟲資源及其多樣性,為開展利用蜉蝣監控浙江省各地水質狀況奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

在浙江省各縣市共設102個樣點,含以往采集過蜉蝣的30樣點。于2016年7月至2022年9月,利用踢網法采集蜉蝣。采集的蜉蝣置于85%酒精中保存,并將各蜉蝣樣本的采集地點、采集時間、采集人等詳細信息記錄在冊,并匯總制表。將樣本帶回實驗室后,保存于-20 ℃冰箱內,以便后期鑒定使用。

1.2 方法

1.2.1 形態鑒定 在體視顯微鏡(Nikon SMZ800)下對采集到的各樣本進行觀察、解剖、形態鑒定并拍照。將鑒定后的蜉蝣按地點、科、屬、種等分揀入不同的塑料小瓶中,置于-20 ℃冰箱內保存。

1.2.2 DNA提取 取形態鑒定到種的蜉蝣樣品置于1.5 mL(或2 mL)Eppendorf 管中,使用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司生產]抽提總DNA(具體提取過程參照試劑盒說明書步驟進行),提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 PCR反應及測序 參照引物FY-C1-J-1751:GGDGCYCCHGAYATRGCNT TYCC,FY-C1-N-2329:ACDGTAAAYATR TGRTGDGCYCA[39]。PCR反應體系:10×PCR Buffer 5 μL,dNTP Mixture 5 μL,模板DNA 1 μL,上下游引物各2 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,無菌水補至50 μL。在MJ-Mini PCR儀(BIO-RAD)或Eppendorf PCR儀上進行PCR反應,反應體系:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性50 s,48 ℃/46 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像儀掃描記錄結果。PCR擴增產物委托上海生工切膠純化、雙向測序。對所獲得的核苷酸序列進行密碼子各位點堿基替換偏好性分析,排除核基因組中mtDNA假基因的可能。

1.2.4 遺傳距離分析 將測序結果在DNAstar的SeqMan中進行相應序列校對。采用MAGE5.05對蜉蝣目不同種的COI序列進行比對,計算變異位點數、堿基含量,并以Kimura 2-parameter(K2p)為模型[40],計算各個已測序蜉蝣目樣本間遺傳距離。結合形態與分子的鑒定結果,統計浙江省蜉蝣的遺傳多樣性,分析形態學上鑒定的種類與分子(遺傳距離)上鑒定種類是否存在差別以及產生這些差別的原因。

1.2.5 系統發生分析 選用石蛃昆蟲作為外群,結合NCBI數據庫已知蜉蝣的COI基因序列,以及在浙江省采集樣本的COI基因序列(以FASTE格式保存),獲得相應的數據集,采用Mega5.05軟件,以Kimura 2-parameter為模型,包含轉換和顛換,Gamma分布,其余默認參數,數據集構建鄰接法(NJ)系統發生樹[41]。

2 結果與分析

2.1 浙江省蜉蝣形態種類

基于形態鑒定后確立的蜉蝣種類44種(2個蜉蝣種由于分子數據不全,未統計),包括: 1)細裳蜉科:寬基蜉屬(宜興寬基蜉、安徽寬基蜉、面寬基蜉),柔裳蜉屬(紫金柔裳蜉);2)四節蜉科:四節蜉屬(紅柱四節蜉、小刺四節蜉、黑斑四節蜉),麗翅蜉屬(逸仙麗翅蜉、納氏麗翅蜉);花翅蜉屬(三刺花翅蜉)、假二翅蜉屬(黑脈假二翅蜉、紫假二翅蜉),黑四節蜉屬(紫眼黑四節蜉); 3)扁蜉科:扁蜉屬(紅背扁蜉、黑扁蜉),似動蜉屬(斜紋似動蜉、紅斑似動蜉、叉似動蜉、宜興似動蜉),高翔蜉屬(擬高翔蜉、何氏高翔蜉、大庸高翔蜉),贊蜉屬(桶形贊蜉),扁蚴蜉屬(皮氏扁蚴蜉),擬亞非蜉屬(尤氏擬亞非蜉);4)小蜉科:小蜉屬(天目山銳利蜉),鋸形蜉屬(景洪鋸形蜉),大鰓蜉屬(膨鋏大鰓蜉、大莖大鰓蜉);5)越南蜉科:越南蜉屬(大別山越南蜉、中華越南蜉、慶元越南蜉);6)等蜉科:等蜉屬(江西等蜉);7)蜉蝣科:蜉蝣屬(絹蜉、洪江蜉、長莖蜉、黑翅蜉);8)細蜉科:細蜉屬(黑點細蜉、中華細蜉);寬基蜉屬(粗鋏寬基蜉);9)新蜉科:小河蜉屬(埃氏小河蜉);10)古絲蜉科:古絲蜉屬(中國古絲蜉);11)河花蜉科:河花蜉屬(廣西河花蜉、長脛河花蜉)。其中,小刺四節蜉、黑脈假二翅蜉、紫假二翅蜉、紅背扁蜉、叉似動蜉、擬高翔蜉、皮氏扁蚴蜉、天目山銳利蜉、洪江蜉、長莖蜉、大庸高翔蜉、大莖大鰓蜉、黑翅蜉等13種蜉蝣是研究首次采集稚蟲,國內未曾報道,有待后期補充相應的稚蟲特征描述。

2.2 蜉蝣COI基因序列遺傳距離

利用FY-J-1751和FY-N-2329通用引物PCR擴增并測序,共獲得187條COI基因序列。剪去引物端序列,序列最終長度為600 bp,序列變異位點238個,簡約信息位點230個。蜉蝣種內和種間遺傳距離,去除大別山越南蜉和中華越南蜉蝣種間遺傳距離為1.1%,小于10%外,其余種間遺傳距離最小值為10.9%(長脛河花蜉和廣西河花蜉之間),最大值為29.1%(紅背扁蜉和紫眼黑四節蜉之間)。紫眼黑四節蜉的種內遺傳分歧為9.8%,紅柱四節蜉種內為11.0%,逸仙麗翅蜉種內為12.0%,其余種內的遺傳距離平均值在0%～5.6%,其中,宜興寬基蜉、黑扁蜉、斜紋似動蜉、斜紋似動蜉、紅斑似動蜉、叉似動蜉、宜興似動蜉、擬高翔蜉、何氏高翔蜉、大庸高翔蜉、尤氏擬亞非蜉、桶形贊蜉、景洪鋸形蜉、大莖大鰓蜉、天目山銳利蜉、大別山越南蜉、江西等蜉、洪江蜉、長莖蜉、中華細蜉、長脛河花蜉、廣西河花蜉的種內遺傳分歧較小,為0%～3%;膨鋏大鰓蜉、紅背扁蜉、面寬基蜉的種內遺傳分歧較大,為3.5%～5.6%。

2.3 蜉蝣基于COI基因序列構建系統發生樹

如圖1所示,在NJ系統發生樹中,除逸仙麗翅蜉、紫眼黑四節蜉和紅柱四節蜉之外的所有物種均為單系群,其中,中華越南蜉和大別山越南蜉具為一支系后再與慶元越南蜉形成姐妹群關系,而逸仙麗翅蜉、紫眼黑四節蜉和紅柱四節蜉并不是單系性。逸仙麗翅蜉存在3個支系,紫眼黑四節蜉存在2個支系,紫眼黑四節蜉存在3個支系,表明3種蜉蝣存在隱種,其中,逸仙麗翅蜉存在2個隱存種,紫眼黑四節蜉存在1個隱有種,紅柱四節蜉存在2個隱存種。

圖1 基于600 bp 序列的COI DNA barcoding的蜉蝣鄰接法(NJ)系統發生樹

3 討論

3.1 形態鑒定與分子數據結合分析鑒定物種的可靠性

在DNA barcoding分子數據上,除大別山越南蜉和中華越南蜉種間遺傳距離為3.5%外,種間遺傳距離為10.9%～29.1%。除逸仙麗翅蜉、紫眼黑四節蜉和紅柱四節蜉外,其余物種內的遺傳距離平均值一般在0%～5.6%。2003年,HEBERT等[27]利用COI基因序列分析遺傳距離時,認為種內遺傳距離一般不大于2%,但也存在一些大于2%的現象,同時發現同屬種間的遺傳距離是該屬種內遺傳距離的10倍左右。紫眼黑四節蜉種內遺傳分歧為9.8%,紅柱四節蜉種內為11.0%,逸仙麗翅蜉種內為12.0%,3種蜉蝣物種的種內遺傳分歧極其接近或大于常規COI基因分歧度的10%,可以推測存在隱種[42-47]。結合系統發生樹,紫眼黑四節蜉、逸仙麗翅蜉和紅柱四節蜉并不是單系群,進一步證實其存在隱種?；贒NA barcoding的分析重新對這3個種類的蜉蝣進行形態鑒定,發現原先被鑒定成逸仙麗翅蜉的蜉蝣中,存在2個隱存種;被鑒定成紅柱四節蜉的蜉蝣中存在2個隱存種;而原先被鑒定成紫眼黑四節蜉的蜉蝣中,存在個1隱存種。該5個隱存種有待從形態特征進行新種描述。大別山越南蜉和中華越南蜉的遺傳分歧為1.1%,小于種間的10%標準[27],結合系統發生關系和對形態特征的重新鑒定后認為大別山越南蜉和中華越南蜉為同一物種,考慮大別山越南蜉的命名遲于中華越南蜉,按照命名法則命名優先權,認為大別山越南蜉為中華越南蜉的同物異名。綜上所述,確定浙江各地采集到的蜉蝣共13個科,24個屬,46種(包括44個已報道種、2個物種為同物異名種)。另外,其中5個物種存在隱種(有待發表)。

3.2 實際采集物種與浙江省已知物種存在差距的原因

在本研究中,通過采集浙江省各縣市的蜉蝣,結合分子與形態鑒定發現,44種浙江省已報道種,其中,5種隱存種,同物異名1種,有18種浙江省已報道中未采集到稚蟲樣本,針對文獻已報道浙江省蜉蝣物種為62種[17],而本研究僅采集到46種,有16種已知物種未采集到,可能原因包括以下幾點:一是由于標本采集時間和采集點限制導致采集物種不全;二是浙江省已報道蜉蝣種多數報道于2001年前,距今時間間隔較久,環境污染可能引起某些蜉蝣物種生境改變,導致該種蜉蝣的存在范圍縮小,導致在原采集地難以采集;三是某些已報道蜉蝣種類的生存環境為水深較深的河流或湖泊底部,而本研究中的蜉蝣采集,由于安全、資金、器械、時間等因素的限制,未到較大河流和湖泊采集,因此可能導致蜉蝣種類不全;四是采集工作主要針對稚蟲采集未考慮用燈誘法采集,而燈誘法可以誘捕到飛翔能力強、活動范圍廣的成蟲,浙江省已報道的蜉蝣種類更多是成蟲。同時本研究發現了5種隱存種,后期需要加大采集樣點,并采用燈誘法,利用不同采集時間對同一樣地進行持續采集,以便采集到更多的蜉蝣物種。另外,發現浙江省蜉蝣昆蟲資源較廣,有待深入對浙江省蜉蝣資源進行調查研究,為后期開展浙江省各地水質監控研究奠定基礎。

4 結論

采自浙江省44種蜉蝣稚蟲的187條COI基因序列測定結果準確,44種蜉蝣目昆蟲的種間、種內遺傳距離及系統發育樹結果說明,采用COI基因序列的DNA條形碼技術能夠對不同的蜉蝣目稚蟲昆蟲進行有效分類,能夠發現隱種,與形態學鑒定結果相互佐證,在水生昆蟲尤其是蜉蝣目昆蟲多樣性調查研究和水質監測中可發揮重要作用。