不同預處理方法對啤酒糟產糖產酸特性的影響

張書源， 趙鳴峰， 唐 永，吳 瑋， 許曉毅

（1.蘇州科技大學 環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009；2.昆山市污水處理有限公司，江蘇 蘇州 215300；3.青島啤酒（昆山）有限公司，江蘇 蘇州 215300）

啤酒糟（又稱麥糟）為麥芽和輔料在糖化工藝單元的殘渣，由麥芽的種皮、外殼和少量未完全溶解的淀粉胚乳顆粒等組成，占啤酒生產過程總副產物的85%左右[1]。 我國是啤酒生產與消費大國，啤酒糟現狀年產生量超1 000 萬t，通常用作畜禽養殖飼料，但市場需求有限且不易儲存[2]。 碳雙減戰略目標下啤酒糟中生物質提取轉化成為啤酒工業副產品資源化利用的重要研究方向。 啤酒糟屬于木質纖維素類生物質材料的一種，由纖維素、半纖維素與少量木質素組成，適宜的預處理方法可破壞啤酒糟頑固的木質纖維素結構，提升后續生化反應中酶與微生物的可及性，從而提升原料酶解或厭氧發酵過程的產糖、產酸效能。 已有報道的木質纖維素類生物質預處理方法包括物理、化學、生物法等[3]。 研究已經證明了酸、堿處理在半纖維素增溶或木質素脫除方面的可行性和經濟性[4]。 堿處理主要通過對木質素的選擇性溶解實現后續酶解效果的提升[5]，稀酸處理主要通過水解半纖維素獲得富含木糖的上清液實現糖的回收，同時通過促進固體殘渣孔隙率的增加，實現后續酶解產糖量或厭氧發酵產酸的良好促進。 超聲波技術能夠對含水物質產生空化作用，有助于打破木質纖維素的復雜結構并增加溶劑的滲透性，也被用于稻桿、甘蔗渣等生物質酸、堿預處理產糖過程的輔助[6-8]。

目前，關于預處理方法對啤酒糟產糖、產酸特性的研究成果仍較為有限，制約了啤酒糟作為生物質能源的資源化利用。 有研究表明啤酒糟經稀酸處理后可獲得較高的產糖量[9]，其預處理產物進行厭氧發酵所產生的揮發性脂肪酸產量也較為可觀[10]。 啤酒糟經熱堿處理后發酵可實現70%理論乙醇產量[11]，熱堿處理對其他生物質的優良酶解效果已有較多報道。 超聲處理啤酒糟能促進表面侵蝕、增加孔徑[12]，已有相關研究表明超聲-酸/堿處理利于生物質的酶促糖化[13-14]，能有效提高生物乙醇或揮發性脂肪酸的產量[13，15]。不同預處理方法對固體回收率、產糖率及產物組分變化等影響也有待深入討論。 考慮啤酒糟生物質組分特征與底物效應的差異，本文主要針對啤酒生產企業實際的啤酒糟，選用稀酸處理、熱堿處理、超聲-酸處理及超聲-堿處理為預處理方法，對啤酒糟進行預處理及酶解產糖量、厭氧發酵產酸量及過程特性的比較，以期為探尋技術可行的啤酒糟生物質能源回收提供理論與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

啤酒糟取自蘇州市某大型啤酒生產企業，60 ℃烘干后粉碎過50 目篩備用。 用于酶解反應的纖維素酶（纖維素酶活1×105U/g）購于上海麥克林生化科技有限公司。3，5-二硝基水楊酸、硫酸、氫氧化鈉等實驗試劑均為分析純。 厭氧發酵所用的顆粒污泥購于諸城市益清環保材料有限公司，為減少產甲烷菌消耗VFAs，顆粒污泥在使用前用破壁機攪碎，倒入1 L 燒杯置于105 ℃的烘箱中加熱1 h，室溫冷卻后裝至塑料瓶中，置于4 ℃的冰箱中密封儲存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 預處理方法

（1）稀酸、熱堿處理

稱取30 g 磨碎的干啤酒糟于500 mL 錐形燒瓶中，加入300 mL 濃度為2.0%（v/v）的H2SO4 溶液或300 mL 濃度為2.0% (w/v)的NaOH 溶液。 混合均勻后置于高壓滅菌鍋在121 ℃下反應30 min 后，冷卻降溫的混合液5 000 rpm 離心10 min 以固液分離。液體部分用于糖的測定。固體殘渣分為兩部分，一部分直接烘干備用，一部分用純水清洗至pH 為中性后烘干粉碎用于酶解。

（2）超聲-酸處理

稱取5 g 經烘干磨碎的啤酒糟于100 mL 燒杯中， 加入50 mL 濃度3%（v/v） 的H2SO4或2% w/v 的NaOH，置于超聲探頭下以600 W 功率反應60 min。反應結束后，在5 000 轉下離心10 min 以固液分離。固體殘渣分為兩部分，一部分直接烘干備用，一部分用純水清洗至pH 為中性后烘干粉碎用于酶解。

（3）超聲-堿處理

稱取5 g 經烘干磨碎的啤酒糟于100 mL 燒杯中，加入50 mL 濃度2% w/v 的NaOH，置于超聲探頭下以600 W 功率反應30 min。 反應結束后，在5 000 轉下離心10 min 以固液分離。 固體殘渣分為兩部分，一部分直接烘干備用，一部分用純水清洗至pH 為中性后烘干粉碎用于酶解。

1.2.2 酶解試驗

預處理后離心回收殘渣洗至中性、烘干磨碎后，取1.0 g 于20 mL 的檸檬酸與檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.8）中，加入0.1 g 纖維素酶粉末后置于溫度為50 ℃的水浴搖床中振蕩24 h。 反應結束后將混合液三角瓶放入沸水中持續3～5 min 滅活，冷卻后在12 000 轉下離心5 min 進行固液分離。

1.2.3 厭氧發酵產酸試驗

對照組以未處理的10 g 啤酒糟作為發酵底物； 實驗組將10 g 啤酒糟分別經不同預處理后的混合產物（包含液體與固體）作為發酵底物。 對照組與實驗組的發酵底物裝入250 mL 發酵瓶中，按底物與接種物揮發性固體濃度（VS）為1∶1 的比例加入接種污泥，加純水至200 mL，調pH 至7.0。 向各發酵瓶中通入氮氣保持5 min，排出氧氣營造厭氧環境，隨后密封發酵瓶。 將發酵瓶置于35 ℃的搖床中，以100 r/min 的震蕩速度運行以進行厭氧發酵。 整個發酵過程維持10 d，每24 h 取發酵液測VFAs。

1.3 分析方法

1.3.1 還原糖測定與產糖率計算

取稀釋一定倍數的預處理液與酶解液抽濾液0.5 mL，用二硝基水楊酸（DNS）法[16]顯色反應，紫外分光光度計540 nm 波長下測定樣品吸光度，計算還原糖含量。 還原糖產率計算方法如下

1.3.2 單糖與副產物濃度的測定

稀釋一定倍數的預處理液經0.22 μm 濾膜過濾后， 使用安捷倫1260 Infinity 高效液相色譜儀測定各單糖與副產物濃度，儀器所用檢測器為Waters 2414 示差折光檢測器，色譜柱型號為BIO-RAD Aminex HPX-87H。

1.3.3 木質纖維素組分分析

啤酒糟原料、預處理殘渣中的纖維素、半纖維素和木質素組分測定采用范氏分析法[17]。固體回收率，纖維素、半纖維素回收率及木質素去除率計算方法如下

1.3.4 形態結構分析

（1）掃描電鏡

取待測樣品表面噴金后用日本Hitachi Regulus 8100 掃描電子顯微鏡(日本)進行掃描拍照，觀察分析啤酒糟在預處理前后的微觀結構形態變化。

（2）紅外光譜

取待測樣品與KBr 混合研磨壓片后，采用Nicolet iS50 型傅里葉紅外光譜儀對供試樣品進行掃描分析，掃描波數范圍為400～4 000 cm-1，繪制紅外譜圖。

（3）X 射線衍射光譜

采用日本理學株式會社的Ultima IV 型X 射線衍射儀對樣品進行分析，Cu 靶掃描角度范圍為5°～40°，掃描速率為2°/min。 根據衍射圖譜強度，采用Segal 法計算相對結晶度（CrI），其計算公式為

式中，I002為2θ=22.5°時結晶部分的強度；Iam為2θ=18°時無定形區部分的強度。

1.3.5 揮發性脂肪酸測定

從發酵瓶中抽取一定量的發酵液在10 000 r/min 下離心10 min， 經0.22 μm 濾頭膜過濾以去除其中的雜質后，隨后用純水稀釋確保其VFAs 濃度在標線范圍內，最后將其取至氣相色譜瓶內，使用3%的H3PO4調節pH 至3.0 以下，置于安捷倫GC 8860 型氣相色譜儀中進行檢測。

1.4 數據統計與分析

各批次實驗均設置平行實驗組（n=3）。 數據處理以及圖形繪制使用Excel 2016，OriginPro 2018c 進行。

2 結果與討論

2.1 不同預處理方法的化學組分特性

圖1 為預處理前后啤酒糟固體的化學組分變化，表1 列出了啤酒糟預處理后各組分回收/去除情況。 未處理的啤酒糟半纖維素是其主要組分，占比為45.97%，纖維素、木質素組分的占比分別為14.41%、4.68%。

表1 預處理后啤酒糟固體組分去除/回收率 %

圖1 預處理前后啤酒糟的化學組分

由表1 可知，稀酸處理與熱堿處理固體回收率分別為37.82%、53.87%，而超聲-酸/堿的固體回收率分別為65.43%、79.75%，超聲預處理具有更高的固體回收率。半纖維素的降解與木質素的去除是導致固體損失的主要原因。 半纖維素是一種多種單糖的復合結構，酸處理可破壞半纖維素和纖維素聚合鏈中糖單體之間的雜環醚鍵，導致半纖維素的解聚，從而能降低纖維素酶解的難度[18]。經稀酸預處理、超聲-酸預處理后，啤酒糟中半纖維素含量占比降低最為明顯，由處理前的45.97%分別降至2.01%和15.76%。 Chen[19]通過稀酸預處理去除了玉米秸稈中大量的半纖維素（占比從19.7%降至9.28%），并證明有益于酶解。 其中稀酸處理對啤酒糟中的半纖維素具有更高效的水解能力。Flávia[20]在其研究中也有相似的發現：相比于超聲酸處理，麥皮和燕麥皮在121 ℃下糖的釋放更充分，木質纖維組分的變化也更為顯著。 有報道認為超聲-酸處理過程中較低的溫度是半纖維素降解效果相對較弱的原因[21]。

木質素是一種無定形酚類大分子，通過4-羥基苯丙烷偶聯而具有高度異質性。 堿處理能破壞生物質木質素中的醚鍵，實現木質素的優良選擇性去除。 熱堿處理與超聲-堿處理對木質素組分占比的降低相對較為顯著，木質素含量由4.68%分別降低至1.74%與2.44%。 同時，熱堿處理對樣品中木質素去除率最高，約為79.97%，與其他類似研究中堿處理所表現出的良好木質素脫除效果較為一致；然而啤酒糟經超聲-堿預處理后，木質素組分占比為2.44%，但去除率僅為58.42%，可能與該預處理途徑的固體回收率較高有關。 超聲波能可產生氧化劑促進木質素分解，也可形成空化作用，并提高堿性溶液對生物質原料的滲透能力[22]。

各種預處理方法導致啤酒糟纖維素組分含量均有不同程度上升。 由于半纖維素的大量去除，經稀酸處理后的啤酒糟固體殘渣中纖維素含量上升至22.93%。 熱堿處理后的啤酒糟纖維素含量最高，為24.09%；超聲-酸、超聲-堿處理后的啤酒糟纖維素含量分別為15.35%和17.16%。

2.2 不同預處理方法的形態結構表征

2.2.1 掃描電鏡分析

原酒糟材料和預處理后殘渣掃描電子顯微鏡圖像（5 000 倍）如圖2 所示。預處理前啤酒糟（如圖2（a）所示）呈現了典型木質纖維材料的致密結構，木質素和半纖維素在纖維素之間形成表面堅硬、光滑的片層結構，對微生物與酶的附著與分解存在較大阻礙效應。 經稀酸處理后（如圖2（b）所示），材料表面形態發生纖維扭曲、斷裂且形成孔洞或裂縫并增加了表面的粗糙度，材料比表面積和孔體積增加，可能由半纖維素的溶解所導致。超聲-酸處理（如圖2（d）所示）材料表面具有更加豐富的孔洞，主要由于超聲作用產生稀酸微泡的高分散性和傳質強化，有效促進了材料半纖維素水解及酶的附著，這也是超聲-酸預處理殘渣的酶解產糖量更高的原因。 經熱堿處理后（如圖2（c）所示），表面沒有明顯纖維斷裂但出現結構膨脹現象，可能是一些木質素或木質素-碳水化合物復合物集結在表面[23]，酶水解的可用表面積明顯增加，與Barman 等人[24]的研究相似。 超聲-堿處理（如圖2（e）所示）后材料表面均出現較多不均勻微小孔洞，表面產生較小的碎片，歸因于超聲作用過程中微泡內爆引起的超聲局部沖擊波對木質素的破碎，這些變化提高了酶的可及性，進而實現超聲-堿預處理殘渣在酶解過程的較高產糖量。

圖2 預處理前后啤酒糟樣品的掃描電鏡圖像

2.2.2 X 射線衍射分析

啤酒糟中有木質素、半纖維素等無定形物質，也有纖維素晶態物質。 結晶態纖維素在木質纖維類生物質中所占比例是影響后續酶解的重要因素。 通過預處理可以破壞纖維素鏈間和鏈內氫鍵來改變其晶體結構，一般地，預處理對木質素和半纖維素整體去除越好，結晶度相對越高[25]。 對各供試樣品的X 射線衍射分析（XRD）圖譜及的結晶度指數（CrI）如圖3 所示。由圖可知，結晶纖維素峰信號較強，非結晶纖維素顯示出更寬和更弱的信號[26]。與原啤酒糟相比，經預處理后啤酒糟的結晶度均有不同程度增加。稀酸處理后，樣品的特征峰最為尖突，結晶度數值最高（27.97%），與前述組分占比和去除效能的結果相匹配，其余3 種預處理方法的結晶度數值范圍為21.24%～25.22%。 熱堿預處理過程在20.3°與21.5°處出現兩峰，說明晶型為纖維素II 型，改變纖維素的異構體可提高后續酶催化的效率。

圖3 啤酒糟預處理前后的X 射線衍射圖譜

2.2.3 紅外光譜分析

圖4 為與處理前后啤酒糟樣品的紅外光譜（FT-IR）圖。根據檢測圖譜分析，各樣品FT-IR 圖譜的峰形總體較為相似，這與它們的結構中存在相似的化學基團有關。 在紅外光譜中1 000～1 200 cm-1處的吸收峰與纖維素和半纖維素的結構特征有關， 1 000～1 100 cm-1吸收峰的增強則表明固體殘渣中纖維素含量增加[27]，與組分分析的結果一致。 1 740 cm-1處的峰代表半纖維素的乙?；吞侨┧狨セ蛘呤悄举|素/半纖維素中的阿魏酸和對香豆酸的羧酸酯鍵，經稀酸處理與超聲-酸處理后該峰消失，可能酸處理在水解半纖維素的過程中對破壞了上述鍵。 1 526 cm-1代表木質素中芳香環的芳香族C=C，經熱堿處理、超聲-堿處理后，該峰的強度明顯減小甚至消失，與組分分析中木質素脫除程度相對應，堿性預處理的木質素脫除作用與該鍵存在關聯。 在2 900 cm-1處觀察到的譜帶對應于-CH2伸展，歸因于木質素和多糖（纖維素和半纖維素）中的脂肪族部分，與原酒糟相比，預處理后樣品吸光度減小，歸因于木質素和半纖維素含量的減少。 所有的光譜都具有一個3 400～3 200 cm-1寬的吸收帶，對應于的O-H 伸展，表明材料的酚類和脂肪族結構中存在氫鍵相互作用和分子間氫鍵，而預處理后的波寬變長表明經處理后的啤酒糟結構更為松散而更易于酶解[28]。

圖4 啤酒糟預處理前后紅外光譜圖

2.3 不同預處理后對啤酒糟產糖效果影響

預處理液化學組分見表2， 可知各預處理液還原糖含量存在較大差異其中稀酸處理預處理液還原糖濃度最高，達到了35.6 g/L，主要成分是木糖與阿拉伯糖，而這兩種單糖正是半纖維素的水解產物。 實驗結果（見表1）表明，稀酸處理過程中半纖維素回收率僅為1.65%，這進一步證實了稀酸預處理液中還原糖主要來源于半纖維素的水解。葡萄糖是纖維素酸水解的產物，其濃度僅有3.81 g/L，僅為木糖濃度的17.12%，這表明在稀酸處理過程中纖維素具有更強的穩定性。 超聲-酸預處理液中還原糖含量為18.77 g/L，其來源與稀酸處理相似，是在酸溶劑與超聲產生的熱能的相互作用下導致半纖維素溶解所致。 盡管超聲處理可造成空化作用，但產生的熱量較稀酸處理還有較大差距，因此其產糖量較稀酸處理低。 使用可能是由于超聲-酸處理使用了更高濃度的酸溶液導致更多纖維素轉化，最終葡萄糖濃度比酸處理高18.2%。

表2 啤酒糟預處理液化學組分分析 g·L-1

經熱堿處理與超聲-堿后，預處理液中還原糖濃度分別為4.14 與0.86 g/L，均低于酸法處理。主要歸因為半纖維素在堿性溶液下的增溶作用相對較弱。 與熱堿處理相比，超聲-堿處理預處理液中各糖的濃度更低，這是因為超聲-堿主要依靠超聲波的空化作用增強堿溶液對木質素的脫除， 而不是依靠高溫熱能引起糖的水解，因此其預處理過程還原糖產量最少。

為了綜合比較各預處理方法總產糖率，分別測定了稀酸處理、熱堿處理、超聲-酸處理、超聲-堿處理在優化工況下的預處理產糖率與酶解產糖率，并結合固體回收率等計算出基于啤酒糟原料干重的產糖率，以便進行均一化對比，分析結果如圖5 所示。 由圖可知，酸性預處理與堿性預處理在預處理和酶解兩個階段的產糖率差異較大。熱堿處理與超聲-堿處理在預處理階段產糖率極低，分別為41.00 mg/g 與10.75 mg/g。而稀酸處理與超聲-酸處理二者的預處理產糖率分別為356 mg/g 與234.63 mg/g，遠高于熱堿處理與超聲-堿處理。但熱堿處理與超聲-堿處理在酶解產糖率上更具有優勢，分別為262.69 mg/g 與224.26 mg/g，大于稀酸處理與超聲-酸處理的77.16 mg/g 與98.27 mg/g。綜合計算總產糖率，稀酸處理、熱堿處理、超聲-酸處理、超聲-堿處理聯合酶解的總產糖率分別為433.16 mg/g、306.69 mg/g、332.90 mg/g 和235.00 mg/g。 可發現酸法處理過程總產糖率高于堿法處理，這可能歸因為啤酒糟半纖維素更高，而酸性溶劑對其水解效果更好，因此酸性處理獲得了更高的總產糖率。

圖5 不同預處理方法還原糖產率的對比

2.4 不同預處理對啤酒糟產酸效果影響

圖6（a）為經過不同預處理的啤酒糟在厭氧發酵過程中的VFAs 產量。 在前5 天內，各發酵體系的VFA濃度快速上升，之后緩慢增加直至達到最高值。 類似的趨勢在草類生物質的厭氧發酵中也被觀察到[29]。 經稀酸處理及超聲-酸處理的啤酒糟在前兩天的發酵中VFA 積累迅速，產量分別為7 685.50 mgCOD/L 與6 720.22 mgCOD/L。 經稀酸處理及超聲-酸預處理后，半纖維素水解轉化為戊糖，可以直接被微生物利用，從而縮短了厭氧發酵過程中的水解步驟。 因此，發酵體系在初始狀態下可溶性有機物含量較高，可以更快地轉化為VFA[30]。 發酵第3 天，經過熱堿處理的啤酒糟的VFAs 產量已經超過了超聲-酸處理，可能是因為之前溶解在液相中的有機物（如蛋白質）開始被微生物利用，此時提供給微生物的有機物含量更多。 然而，超聲-堿處理主要是用于去除啤酒糟中的木質素，對半纖維素及其他有機物的溶出作用較弱，因此厭氧發酵的VFAs產量不及其他幾種預處理方式。

圖6 預處理方法對VFAs 的產量及組分的影響

到第10 天VFAs 產量基本平穩，周期結束時VFAs 產量為：稀酸處理＞熱堿處理＞超聲-酸處理＞超聲-堿處理＞對照組。 稀酸處理的VFAs 產量最高， 為13 268.84 mg COD/L， 相較對照組提升了2.4 倍， 但略低于Juan 等[10]的研究結果，后續可通過調節pH 等操作進行優化；超聲-堿處理、超聲-酸處理、超聲-堿處理則分別提升99.69%、76.43%、25.49%。 不同預處理途徑均可以不同程度實現啤酒糟中半纖維素的增溶以及木質素的降解并破壞木質纖維素結構，使得其中的有機物等更容易被發酵體系中的微生物所利用。與Xue 等人[30]的研究結論不同，本研究結果表明使用固體回收率更低的稀酸與熱堿預處理方法實現了更高的VFAs 產量，可能因為固體回收率在一定程度上反映了預處理方法的增溶能力。Guo 等人[31]也得出了類似的結論。在預處理過程產生的乙酸、糠醛與5-羥甲基糠醛（HMF）等可能會抑制后續的厭氧發酵。由表2 可知，盡管稀酸處理與熱堿處理過程中產生的副產物相對較高，但仍具有較高的VFAs 產量，由此可知副產物的抑制作用并非是造成厭氧產酸差異的決定性因素。

圖6（b）所示為經過各方法預處理后啤酒糟在厭氧發酵產VFAs 組分構成占比。 厭氧發酵VFAs 組分構成對其下游的進一步利用至關重要，也在一定程度上決定了其實際價值。 例如，對于作為廢水處理的碳源利用過程，有機酸的利用順序為乙酸＞丁酸＞戊酸＞丙酸。 不同預處理方法會導致VFA 的比例有所不同。 乙酸、丙酸和正丁酸是三種最常見的VFA， 在各體系中分別占總揮發性脂肪酸產量的95.27%、94.42%、94.01%、89.23%和91.62%。 經各方法預處理后的發酵體系中，乙酸占比均超過50%，而丙酸和正丁酸的變化幅度相對較大。 稀酸處理后的發酵體系中，正丁酸占比相對最高（34.95%），濃度為3 652.22 mg/L，丙酸占比僅為2.66%，而在熱堿處理和超聲-堿預處理的發酵體系中占比分別為18.81%和14.04%。 除對照組外，各個體系中都檢測到了異丁酸的產生，但濃度均低于300 mg/L。 在各個體系中都檢測到了前五種VFA，僅在超聲-堿體系中檢測到了極少量的正戊酸（91.01 mg/L）。

3 結語

（1）不同預處理方法對啤酒糟組分特性具有不同影響。熱堿處理可脫除79.97%的木質素，稀酸處理實現了98.35%的半纖維素降解。 經超聲-酸/堿處理對啤酒糟組分特性影響相對較小， 但該法固體回收率相對較高。

（2）采用SEM、XRD 和FTIR 法對預處理前后的啤酒糟的形態結構表征結果表明，經預處理后，啤酒糟表面出現不同程度的孔洞、裂縫，有效增加了后續聯合酶解反應的接觸面積；隨著木質素、半纖維素的脫除，纖維素結晶度由16.36%最高增加至27.97%，FTIR 相關官能團信號強度變化驗證了預處理后半纖維素、 纖維素及木質素等成分組成的變化趨勢。

（3）酸性處理的預處理產糖率要遠高于堿性預處理，而堿性處理更利于酶解產糖。 稀酸處理、熱堿處理、超聲-酸處理、超聲-堿處理還原糖總產率分別為433.16、306.69、332.90、235.00 mg/g。 啤酒糟半纖維素更高且酸性溶劑對其具有更好的水解效果，因此從總產糖率的角度看酸法預處理的產糖性能更佳。

（4） 各預處理后的啤酒糟厭氧發酵VFAs 產量順序為稀酸處理＞熱堿處理＞超聲-酸處理＞超聲-堿處理，VFAs 產量與預處理對有機物的增溶能力相關， 可由固體回收率反映。 各發酵體系中， 乙酸所占比例均在50%以上，是最主要的VFA。