軟棗獼猴桃黃酮體外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

王月嬋，姚佳琦，黃 夏，李艷杰，祝儒剛，陳 罡*

（1.遼寧省林業科學研究院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧白石砬子森林生態系統國家定位觀測研究站，遼寧 丹東 118201；3.遼寧大學輕工產業學院，遼寧 沈陽 110036；4.新賓滿族自治縣國有林業總場，遼寧 新賓 113213）

軟棗獼猴桃Actinidia arguta為獼猴桃科、獼猴桃屬大型落葉藤本植物，廣泛分布于中國東北、華北、西北等地區，其中吉林和遼寧東部山區軟棗獼猴桃資源最為豐富，同時在朝鮮半島、日本和俄羅斯亦有分布[1]。軟棗獼猴桃果實富含多糖、黃酮、三萜類、生物堿、VC、微量元素、膳食纖維等多種活性成分，因其酸甜多汁的口感和一定的保健功效，越來越受到人們的關注。

黃酮類化合物是一類植物次生代謝產物，廣泛存在于多種植物的根、莖、葉、花及果實中，不僅數量種類繁多，而且結構類型復雜多樣[2]。黃酮類化合物因其獨特的化學結構具有許多重要的生理、生化和藥理作用，是許多中草藥的有效成分，具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎癥、降血糖、改善神經性疾病等功效。近年來黃酮類化合物研究進程加快，對其構效關系研究不斷深入，為其在醫藥、食品領域的應用提供了理論依據。已有研究表明，植物黃酮類化合物具有抗氧化作用，可通過抑制自由基生成、清除自由基或抑制脂質過氧化實現此效用[3]。此外，目前α-葡萄糖苷酶抑制劑主要來源于微生物、天然產物和化學合成，阿卡波糖是一種廣泛應用的合成型α-葡萄糖苷酶抑制劑，能有效降低餐后高血糖，對胰高血糖素樣肽-1 水平以及胰島素敏感性能產生積極影響[4]。然而，此類抑制劑可能導致胃腸功能問題，對患有腸道基礎疾病和孕婦等特定人群存在局限性。因此，研究具有體外抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性的天然產物具有重要現實意義。本研究通過測定軟棗獼猴桃黃酮提取物對DPPH 自由基、羥基自由基的清除作用和對α-葡萄糖苷酶抑制作用，明確其體外抗氧化和降血糖的效用，為今后軟棗獼猴桃黃酮類化合物的開發與利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為種植在遼寧省林業研究院軟棗獼猴桃示范基地的‘龍成2 號’果實。待果實成熟后置于有冰袋的保溫箱中，帶回實驗室用于軟棗獼猴桃黃酮提取。

無水乙醇、無水碳酸鈉，購于國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸、硫酸亞鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、α-葡萄糖苷酶、磷酸鹽緩沖液，購于北京酷來博科技有限公司；水楊酸，購于天津市北辰方正試劑廠；過氧化氫，購于沈陽市東興試劑廠；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），購于南京都萊生物技術有限公司；阿卡波糖，購于拜耳醫藥保健有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；智能勻漿機（上海凈信實業發展有限公司）；KQ-500DE 超聲波清洗機（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；循環水式真空泵（予華儀器責任有限公司）；高速冷凍離心機（艾本德儀器有限公司）；UV-2550紫外可見分光光度計（島津儀器有限公司）；酶標儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 軟棗獼猴桃黃酮提取及純化

采用超聲輔助乙醇浸提法對軟棗獼猴桃果實中的總黃酮進行提取和純化[5]。

1.3.2 DPPH 自由基清除能力的測定

將軟棗獼猴桃黃酮提取液配制成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-15 個梯度，以抗壞血酸（VC）作為陽性對照，參照Chen 等[6]的方法測定DPPH 自由基清除能力，按照公式（1）計算DPPH 自由基清除率。

式中：A1為樣品組的吸光度值；A2為對照組的吸光度值；A0為空白組的吸光度值。

1.3.3 羥基自由基清除能力的測定

將軟棗獼猴桃黃酮提取液分別配制5 個梯度0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1，以抗壞血酸（VC）作為陽性對照，采用Winterbourn 等[7]的方法測定羥基自由基的清除能力。羥基自由基清除計算公式同式（1）。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

將軟棗獼猴桃黃酮提取液用0.1 mol·L-1、pH6.8磷酸緩沖溶液（PBS），配制2 mg·mL-1、4 mg·mL-1、6 mg·mL-1、8 mg·mL-1、10 mg·mL-1的黃酮樣品液，參考Zhang 等[8]的方法進行α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。取0.1 mol·L-1、pH6.8 的磷酸鹽緩沖液120 μL、0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液20 μL、樣品液20 μL 于96 孔板中，在37 ℃恒溫培養箱中反應10 min，再加入20 μL 2.5 mmol·L-1pNPG 溶液，繼續在37 ℃恒溫培養箱中反應20 min，加入0.2 mol·L-1的Na2CO3溶液80 μL 以終止反應。以阿卡波糖為陽性對照，使用酶標儀在波長405 nm 處測定吸光度，按照以下公式計算軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A1為樣品組的吸光度值；A2為樣品空白組吸光度值；A3為對照組的吸光度值；A0為空白組的吸光度值。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制動力學試驗

設定α-葡萄糖苷酶濃度為0.2 U·mL-1，設置pNPG 溶液濃度分別為1.0 mmol·L-1、1.5 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1，樣品溶液質量濃度分別為0 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1，按照1.3.4 的方法測定405 nm 吸光度值，計算反應速率。為判斷軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制類型，采用Lineweaver-Burk 雙倒數法繪制曲線，將pNPG 濃度的倒數（1/S）作為橫坐標，反應速率的倒數（1/V）作為縱坐標，分析其抑制特性[9]。

設定pNPG 溶液濃度為2.5 mmol·L-1，設置α-葡萄糖苷酶濃度分別為0.1 U·mL-1、0.15 U·mL-1、0.2 U·mL-1、0.25 U·mL-1，樣品溶液質量濃度分別為0 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1，按照1.3.4 的方法測定405 nm 吸光度值，計算反應速率。以α-葡萄糖苷酶濃度為橫坐標，反應速率為縱坐標，確定軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的可逆性。

2 結果與分析

2.1 軟棗獼猴桃黃酮體外抗氧化活性

2.1.1 軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基清除能力

由圖1 可知，軟棗獼猴桃黃酮和VC 均對DPPH 自由基具有一定的清除作用，且清除率與軟棗獼猴桃黃酮和VC 的質量濃度呈正相關。當質量濃度為1.0 mg·mL-1時，軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基清除率為80.5%±2.21%，VC 對DPPH 自由基清除率為91.7% ± 1.45%。在0.2～1.0 mg·mL-1質量濃度范圍內，VC 和軟棗獼猴桃黃酮的IC50分別為0.18 mg·mL-1和0.42mg·mL-1，說明軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基的清除作用稍差于VC。當VC 質量濃度達到0.4 mg·mL-1后清除率不再明顯增加；而隨著軟棗獼猴桃黃酮質量濃度的增加，對DPPH 自由基的清除能力逐漸接近VC。

圖1 軟棗獼猴桃黃酮對DPPH自由基的清除作用

2.1.2 軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基清除能力

由圖2 可知，軟棗獼猴桃黃酮與VC 同樣具有清除羥自由基的作用，且清除率隨著質量濃度的增加而增強，也表現出明顯的量-效關系。當質量濃度為1.0 mg·mL-1時，軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基清除率為74.1% ± 2.78% ，VC 對羥基自由基清除率為93.9% ± 1.86%。在0.2～1.0 mg·mL-1范圍內，VC 和軟棗獼猴桃黃酮的IC50分別為0.39 mg·mL-1和0.59 mg·mL-1，與清除DPPH 自由基的能力相似，軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基的清除作用稍差于VC。VC 對羥基自由基的清除率呈現先增加后逐漸平穩的趨勢，而軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基清除率隨質量濃度增加呈現不斷上升趨勢。

圖2 軟棗獼猴桃黃酮對羥基自由基的清除作用

2.2 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結果

由圖3 可知，以阿卡波糖作為陽性對照，軟棗獼猴桃黃酮和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率隨質量濃度增加而提高，當質量濃度為10 mg·mL-1時抑制率達到最高，即黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制率為73.2%±1.69%，阿卡波糖為80.4%±1.75%。黃酮的IC50為1.87 mg·mL-1，阿卡波糖IC50為0.43 mg·mL-1，說明阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用優于軟棗獼猴桃黃酮。

圖3 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶活性影響

2.2.2 α-葡萄糖苷酶的抑制動力學試驗

軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制的雙倒數曲線見圖4。

圖4 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制的雙倒數曲線

3 種質量濃度軟棗獼猴桃黃酮抑制線性方程分別為：y=5.3167x+0.5585、y=3.6178x+0.5494、y=2.7387x+0.4718，R2分別為0.997 7、0.989 3、0.994 2。在不同軟棗獼猴桃黃酮質量濃度下，各曲線在縱軸上的截距基本保持不變，而斜率隨黃酮質量濃度的增加而增加。這一特征表明，Km 值（米氏常數）隨著抑制劑質量濃度的增加而增加，而Vmax 值（最大反應速率）保持不變，說明軟棗獼猴桃黃酮占據了α-葡萄糖苷酶的活性位點，表現出競爭性抑制特性。

判定軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用可逆性如圖5 所示，3 種質量濃度依次增加，各質量濃度的軟棗獼猴桃黃酮抑制作用直線均經過原點，且斜率逐漸減小。由此推斷，軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有可逆性特征。若為不可逆抑制類型，隨著黃酮質量濃度的變化，斜率應保持恒定。因此，可以得出結論，軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的。

圖5 軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用可逆性

3 結 論

本研究通過提取軟棗獼猴桃果實黃酮，測定其對DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，探討軟棗獼猴桃黃酮的體外抗氧化活性及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結果表明，軟棗獼猴桃黃酮對DPPH 自由基和羥基自由基的清除率均在70%以上，具有較好的抗氧化活性。雖然稍差于VC，但進一步增加軟棗獼猴桃黃酮質量濃度，可以提高對自由基的清除率。軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶IC50為1.87 mg·mL-1，在2～10 mg·mL-1，抑制活性呈現一定的質量濃度依賴性。抑制動力學試驗可推斷，軟棗獼猴桃黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制機制為競爭性抑制，且抑制作用是可逆的，這一結論與趙坤[10]的研究結果一致。本研究結果將為軟棗獼猴桃黃酮類化合物在抗氧化和降脂降糖功能的深入研究提供理論依據。