基于網絡藥理學與實驗驗證探討青錢柳治療糖尿病性脂肪肝作用及機制

劉藝璇 ，吳琴 ，張亞男 ，蔡昱哲 ，李定祥 ，鄧奕輝

1.湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

2021年國際糖尿病聯盟發布的第十版全球糖尿病地圖數據顯示，目前我國有1.4億成人糖尿病患者，預計到2045年將增至1.74億[1]。非酒精性脂肪性肝病是糖尿病的獨立危險因素[2]?！吨袊扇?型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病管理專家共識》推薦使用吡格列酮治療，但慎用于伴心功能不全、水腫、骨折風險的患者，臨床用藥局限[3]。中藥在降糖方面具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，能夠有效避免單一成分導致的不良反應[4]。

青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja 是一種藥食同源植物，民間常以其葉作茶飲，有降糖功效。青錢柳調節糖脂代謝的藥效作用物質基礎及具體作用機制尚待闡明。通過網絡藥理學綜合分析藥物成分，有助于揭示某種特定疾病相關的靶點及通路[5]。本研究采用網絡藥理學方法對青錢柳防治糖尿病性脂肪肝的主要活性成分及潛在作用靶點進行預測分析，通過體內實驗驗證其靶點及信號通路，為進一步揭示其藥效成分和藥理作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 藥物化學成分收集與活性成分篩選

由于TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中藥材綜合數據庫（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）等數據庫均未收錄青錢柳相關關鍵詞，故檢索青錢柳相關文獻獲取其化學成分[6-9]。在PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載獲取的成分，部分成分的分子結構通過ChemDraw20.0軟件繪制，將全部成分的分子結構導入SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch/），以“GI absorption”項為“high”且“Druglikeness”至少2項“YES”為條件對化學成分進行篩選。將結果輸入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）及Super-PRED（http://prediction.charite.de/）數據庫獲取潛在靶點。使用SwissTargetPrediction數據庫獲取小分子靶點，設定Probability≥0.05；分子量＞200 者使用Super-PRED 數據庫獲取靶點。

1.1.2 藥物活性成分-靶點網絡構建

將篩選的活性成分重新編號，利用Cytoscape3.9軟件構建青錢柳活性成分-作用靶點網絡，分析其活性成分與靶點之間的作用關系。

1.1.3 疾病相關靶點及交集靶點獲取

在CNKI學術翻譯助手平臺（https://dict.cnki.net/index）輸入“2型糖尿病”“非酒精性脂肪肝”獲取疾病英文詞匯，分別得到type 2 diabetic mellitus、type 2 diabetes mellitus、type 2 diabetes、diabetes mellitus、type 2 diabetes，以及nonalcoholic fatty liver disease、nonalcoholic fatty liver、nonalcoholic steatohepatitis，將所得詞匯分別輸入TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、DrugBank（http://www.drugbank.ca/atc） 及DisGeNET （https://www.disgenet.org/）數據庫進行檢索，將檢索結果匯總后去重、取并集，再輸入UniProt 數據庫（https://uniprot.org/），設置 類 別 為“reviewed”“human”。采 用Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對青錢柳作用靶點與疾病相關靶點取交集，即為青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的潛在作用靶點。

1.1.4 蛋白相互作用網絡構建

將青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的潛在作用靶點導入STRING數據庫（http://www.string-db.org/），設置參數為“Multiple proteins”“Homo sapiens”，置信度≥0.4，導出文件后利用Cytoscape3.9軟件構建蛋白相互作用（PPI）網絡。

1.1.5 GO和KEGG通路富集分析

利用DAVID 在線分析平臺（https://david.ncifcrf.gov/）對交集靶點進行GO和KEGG通路富集分析，并利用微生信在線平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO分析條圖及KEGG分析氣泡圖。

1.1.6 活性成分-共同靶點-信號通路網絡構建與分析

使用Cytoscape3.9軟件內置的merge功能取并集，構建藥物活性成分-共同靶點-信號通路網絡，節點表示青錢柳活性成分、靶點及通路，邊表示化合物所關聯的潛在靶點和通路。利用Network Analyzer功能進行網絡模型特征分析，得到連接度（degree）、網絡密度等參數，獲取核心活性成分及靶點。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物、試藥與儀器

SPF級SD雄性大鼠36只，體質量（210±10）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（湘）2019-0004，分籠飼養于湖南中醫藥大學動物中心實驗室，通風良好，每日12 h照明，相對濕度（50±5）%，溫度25 ℃，自由進食飲水。本實驗經湖南中醫藥大學動物倫理委員會審查批準（LL2022022306）。

青錢柳由湖南省中醫藥研究院中藥研究所提供，經湖南中醫藥大學翦雨青研究員鑒定為胡桃科植物青錢柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja 的干燥葉。青錢柳水提物制備方法：取1 kg 青錢柳，加入12倍水，煮沸2 h，過濾，濾渣再加10倍水，煮沸1 h，合并2次濾液，旋轉蒸發儀濃縮，得濃縮液1 L（1 mL濃縮液含1 g原藥材），于4 ℃冰箱保存備用。鹽酸吡格列酮片（杭州中美華東制藥有限公司，批號2101401A），于研缽中碾成粉末后溶于生理鹽水，配制成1 mg/mL藥液。

Anti-mTOR（phospho S2448）抗體、Anti-Akt1（phospho S124）抗體（英國Abcam公司，貨號分別為ab109268、ab81283），Akt1抗體、m-TOR抗體、PI3K抗體、GAPDH抗體（美國Proteintech公司，貨號分別為10176-2-AP、66888-1-Ig、20584-1-AP、10494-1-AP），p-PI3K抗體（北京博奧森公司，貨號bs-5570r），HRP 標記山羊抗兔二抗（中國Abiowell 公司，貨號AWS0002），ECL Plus超敏發光液（中國Abiowell公司，貨號AWB0005），顯影液、定影液（中國上海佳信公司，貨號分別為BW-61、BW-62），蘇木素染液、電鏡固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為G1004、G1102），812 包埋劑（SPI 公司，貨號90529-77-4）。

Chemray 800全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技），BioPrep-24 生物樣品均質儀（中國杭州奧盛），ChemiScope 6100 化學發光成像系統（中國勤翔），Epoch酶標檢測儀（美國BioTek），HT7800/HT7700透射電子顯微鏡（日本HITACHI）。

1.2.2 造模

30 只SD 大鼠予高脂高糖飼料（59%普通飼料、18%豬油、20%蔗糖和3%蛋黃）喂養，并于第4周末腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg誘導2型糖尿病模型，72 h后尾部取血，用血糖儀測定血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L為模型制備成功。成模率為70%，共納入21只成模大鼠。1周后，隨機選取3只大鼠進行肝臟組織HE染色，可見肝臟脂肪變性。血糖指標與肝臟病理變化均滿足上述條件者即為糖尿病性脂肪肝模型[10-11]。

1.2.3 分組及給藥

將18 只成模大鼠根據體質量隨機分為模型組、吡格列酮組（10 mg/kg）、青錢柳組（0.54 g/kg），每組6只。6只普通飼料喂養大鼠作為空白組。青錢柳臨床推薦用量70 kg成人為6 g/d，按人與大鼠體表面積折算，大鼠給藥劑量為0.54 g/kg。各給藥組予相應藥物灌胃，空白組灌胃生理鹽水，體積均為1 mL/100 g，每日1次。4周后取材并檢測相關指標。

1.2.4 血脂、血糖、肝功能指標檢測

用10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，從腹正中線皮膚切開腹腔，腹主動脈取血4 mL，4 ℃、3 500 r/ min離心15 min，分離血清，按試劑盒說明書，采用全自動生化分析儀分別測定血脂[總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）]、血糖[血糖（GLU）、糖化血清蛋白（GSP）]及肝功能指標[丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）]。

1.2.5 HE染色

腹主動脈取血后，用眼科剪沿大鼠肝臟外緣取下完整肝臟，置于4 ℃生理鹽水中浸洗，在冷凍臺上用刀片切取右葉肝組織并固定于4%多聚甲醛中，24 h后將肝組織依次進行脫水、石蠟包埋、切片、染色及封片，鏡下觀察并采集圖像進行分析。

1.2.6 透射電鏡觀察自噬體

將大鼠肝組織置于預冷好的冷凍機上，生理鹽水沖洗后分離右葉組織，切取1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，固定于2.5%戊二醛溶液中，經鋨酸固定、梯度脫水、浸透、包埋、切片、修切、染色后，在透射電鏡下觀察肝細胞形態及自噬體。

1.2.7 Western blot檢測關鍵靶點蛋白表達

取大鼠肝組織，迅速放入-80 ℃冰箱中凍存，實驗前取出解凍，取黃豆大小，放入1.5 mL EP管中，加入蛋白裂解液提取總蛋白，利用蛋白測定試劑盒檢測蛋白含量。以40 μg 蛋白/泳道上樣，經SDS-PAGE 后，濕轉法轉膜至PVDF 膜，加PI3K 一抗（1∶1 000）、Akt1 一抗（1∶5 000）、mTOR 一抗（1∶5 000）、p-PI3K 一抗（1∶2 000）、p-Akt1 一抗（1∶5 000）、p-mTOR一抗（1∶5 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），置于4 ℃冰箱中孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min，加HRP標記二抗孵育。按1∶1比例配制化學發光液，將膜放在曝光板上，膜上滴適量發光液，將曝光后的底片用Quantity One專業灰度分析軟件進行分析，以GAPDH 為內參，計算關鍵靶點蛋白相對表達量。

1.2.8 統計學方法

采用SPSS26.0 統計軟件進行分析。計量資料滿足正態分布以±s表示，組間比較采用方差分析；不滿足正態分布用M（QR）表示，組間比較采用獨立樣本非參數檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

2.1.1 青錢柳活性成分及有效靶點

通過查閱文獻共獲得青錢柳化學成分124個，運用SwissADME平臺篩選后保留活性成分46個，并對其進行重新編號，見表1。使用SwissTargetPrediction 及Super-PRED 數據庫獲取活性成分靶點，經篩選、匯總、去重后，共獲得599個靶點。

表1 青錢柳活性化合物

2.1.2 青錢柳活性成分-靶點網絡

將青錢柳活性成分和有效靶點數據導入Cytoscape3.9進行網絡構建，獲得的藥物活性成分-靶點網絡共包含646個節點、2 169條邊?；诖司W絡進行分析，degree 值前6 位活性成分為pterolactone、5S-5-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥苯基)-3-庚酮、六氫姜黃素、槲皮素、山柰酚、3,6,3＇,5＇-四甲氧基-5,7,4＇-三羥基黃酮醇，degree值分別為108、107、104、104、104、104，推測上述成分可能是青錢柳的重要活性成分。

2.1.3 疾病相關靶點及交集靶點

通過TTD、DrugBank 及DisGeNET 數據庫得到2 型糖尿病相關靶點2 382個，去重后為2 195個；非酒精性脂肪肝相關靶點829個，去重后為816個。將疾病相關靶點與599個青錢柳靶點取交集，得到共同靶點101個。

2.1.4 蛋白相互作用網絡

將101 個交集靶點導入STRING 平臺構建PPI 網絡，并使用Cytoscape軟件進行可視化分析。該網絡共101個節點、1 053條邊，平均節點度為20.851，聚類系數為0.598，見圖1。靶蛋白節點越大、顏色越深其degree值越高，表明該靶點越重要。計算靶點degree值及中介中心度（BC）、接近中心度（CC），以三者均不低于其相應中位數（degree≥15、BC≥0.001 8、CC≥0.607 1）為條件進行篩選，得到青錢柳治療糖尿病性脂肪肝的關鍵靶點15 個，分別為PPARG、MTOR、

圖1 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝核心靶點PPI網絡

PPARA、AKT1、STAT3、EGFR、TLR4、VEGFA、HIF1A、 MMP9、 IL6、 TNF、 CASP3、 PTGS2、ESR1。其中degree值最高的是AKT1，能與70個蛋白發生相互作用，可能發揮重要作用。將上述關鍵靶點名稱輸入DisGeNET數據庫，獲得關鍵靶點的拓撲性質信息，見表2。

表2 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝關鍵靶點及其拓撲性質

2.1.5 GO和KEGG通路富集分析結果

對15個關鍵靶點進行GO功能富集分析，得到270個條目，以P＜0.05、FDR＜5%為條件，共篩選出81個條目，包括66個生物過程（Biological process）、2個細胞 組 分（Cellular component）、 13 個 分 子 功 能（Molecular function）。主要生物過程包括蛋白結合（protein binding）、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、細胞因子介導的信號通路（cytokine-mediated signaling pathway）、基因表達的正調控（positive regulation of gene expression）、轉錄的正調控及DNA模板化（positive regulation of transcription，DNA-templated）、平滑肌細胞增殖的正調控（positive regulation of smooth muscle cell proliferation）、炎癥反應（inflammatory response）、肽基-絲氨酸磷酸化的正調節（positive regulation of peptidyl-serine phosphorylation）、對缺氧的反應（cellular response to hypoxia）、基因表達的負調控（negative regulation of gene expression）、凋亡過程的正調控（positive regulation of apoptotic process）、凋亡過程的負調控（negative regulation of apoptotic process）、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的負調控（negative regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter）等；主要細胞組分包括大分子復合體（macromolecular complex）與細胞質（cytoplasm）；主要分子功能包括相同的蛋白質結合（identical protein binding）、酶的結合（enzyme binding）、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性及配體激活的序列特異性DNA結合（RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity， ligandactivated sequence-specific DNA binding）、NO合成酶調節活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、蛋白質結構域特異性結合（protein kinase binding）、轉錄因子結合（transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ抑制轉錄因子的結合（RNA polymerase Ⅱ repressing transcription factor binding）、轉錄輔助因子結合（transcription coactivator binding）、轉錄因子活性及序列特 異 性DNA 結 合（transcription factor activity，sequence-specific DNA binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、蛋白質結合（protein binding）、轉錄激活活性（transcriptional activator activity）、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節區域序列特異性結合（RNA polymerase Ⅱ transcription regulatory region sequence-specific binding）。見圖2。

圖2 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝關鍵靶點GO富集分析

對15個關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，以P＜0.05為條件，共篩選出89個信號通路，前21條通路見圖3。靶點數靠前的信號通路為糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications Insulin resistance）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、丙型肝炎（Hepatitis C）、胰島素抵抗（Insulin resistance）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease）、脂肪細胞因子信號通路（Adipocytokine signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、癌癥的途徑（Pathways in cancer）等?？梢?，青錢柳治療糖尿病性脂肪肝是多靶點、多通路相互影響的結果。

圖3 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝關鍵靶點KEGG通路富集分析

2.1.6 活性成分-共同靶點-信號通路網絡

利用Cytoscape3.9軟件構建青錢柳治療糖尿病性脂肪肝活性成分-共同靶點-信號通路網絡。其中degree值較大的成分是5S-5-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥苯基)-3-庚酮、2α-羥基烏蘇酸、六氫姜黃素、2α, 3α, 20β, 23-tetrahydroxyurs-12-en-28-ursolic acid、2a-羥基熊果酸，degree值較大的靶點有STAT3、AKT1、MTOR、TLR4、PIK3CA、EGFR等，見表3。

表3 青錢柳治療糖尿病性脂肪肝核心活性成分及靶點

2.2 實驗驗證結果

2.2.1 青錢柳對模型大鼠一般情況的影響

空白組大鼠反應靈活，毛發光澤，糞便、尿液正常；模型大鼠反應欠靈敏、皮毛晦黯無光澤，尿量明顯增多并有爛蘋果味，部分出現顯著的“三多一少”表現；與模型組比較，青錢柳組大鼠一般情況明顯改善。與空白組比較，模型組大鼠體質量、肝濕重明顯升高；與模型組比較，青錢柳組大鼠體質量、肝濕重明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠體質量、肝濕重比較（±s，g，每組6只）

表4 各組大鼠體質量、肝濕重比較（±s，g，每組6只）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

肝濕重17.50±1.04 28.00±2.67*19.60±0.87#20.39±1.80組別空白組模型組青錢柳組吡格列酮組體質量461.50± 9.98 582.00±13.42*463.00±40.34#480.75±38.40

2.2.2 青錢柳對模型大鼠血脂、血糖、肝功能指標的影響

與空白組比較，模型組大鼠TC、LDL、GLU、GSP、ALT、AST含量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，吡格列酮組大鼠LDL、GLU、GSP、ALT、AST含量下降，青錢柳組大鼠TC、GLU、GSP、ALT、AST含量下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血脂、血糖、肝功能指標比較

2.2.3 青錢柳對模型大鼠肝組織形態的影響

正常組大鼠肝細胞排列整齊，肝小葉結構清晰，肝細胞無脂肪變，無炎細胞浸潤；模型組大鼠肝細胞腫脹，細胞內有大小不一的脂滴空泡，細胞核邊緣化，可見少量炎癥細胞浸潤；青錢柳組和吡格列酮組大鼠肝細胞脂肪變顯著減輕，炎癥細胞顯著減少。見圖4。

2.2.4 青錢柳對模型大鼠肝臟自噬體的影響

透射電鏡觀察顯示，自噬體是由單層膜或典型雙層膜將一小部分細胞質包圍而成的結構。與空白組比較，模型組大鼠肝細胞自噬體數量有減少趨勢；與模型組比較，青錢柳組大鼠肝細胞自噬體數量明顯增多，見圖5。

2.2.5 青錢柳對模型大鼠關鍵靶點蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，青錢柳組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達下降，吡格列酮組大鼠肝組織p-Akt1、p-mTOR蛋白表達下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖6、表6。

表6 大鼠肝組織PI3K、Akt1、mTOR、p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達各組比較（±s，每組3只）

表6 大鼠肝組織PI3K、Akt1、mTOR、p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達各組比較（±s，每組3只）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

蛋白PI3K p-PI3K Akt1 p-Akt1 mTOR p-mTOR吡格列酮組0.48±0.03 0.16±0.02 0.49±0.02 0.14±0.02#0.42±0.01 0.11±0.02#空白組0.48±0.04 0.04±0.01 0.47±0.03 0.03±0.00 0.45±0.00 0.05±0.01模型組0.45±0.03 0.22±0.03**0.45±0.03 0.22±0.02**0.40±0.02 0.24±0.05*青錢柳組0.45±0.04 0.09±0.02#0.46±0.04 0.07±0.01#0.41±0.01 0.08±0.00#

3 討論

目前，青錢柳的相關研究多集中于化學成分、藥理作用及有效部位提取工藝，尚未對其作用機制開展深入研究。因此，本研究通過網絡藥理學初步探討青錢柳發揮治療作用的途徑，并通過動物實驗進行驗證。

網絡藥理學分析結果顯示，青錢柳可以通過多個生物學過程對糖尿病性脂肪肝發揮治療作用，其核心作用靶點可能是AKT1，并且涉及PI3K/Akt1/mTOR信號通路。研究表明，該通路參與自噬分子機制、信號調控，以及細胞的生長、增殖、分化和凋亡等過程，其中PI3K屬于脂質激酶，是細胞膜的關鍵組成部分，分為3種亞型[12]，主要是Ⅰ型PI3K參與該通路信號傳導，通過作用于下游Akt，使磷酸化的Akt激活下游mTOR，從而負性調節自噬。mTOR 由2 種不同蛋白mTORC1和mTORC2組成，前者與自噬密切相關，對經典的抑制劑雷帕霉素敏感[13]，后者與自噬的關系尚未明確。研究發現，肝臟自噬在脂質代謝中發揮重要作用，自噬失調會導致肝內脂質淤積增加，且肝內脂質淤積可進一步加重代謝功能障礙，從而形成惡性循環，促使疾病發生和進展[14]。通過調控自噬靶向改善非酒精性脂肪肝肝臟脂質積累的策略可能是防治糖尿病性脂肪肝新的干預手段。

基于網絡藥理學預測結果進行動物實驗驗證，以高糖高脂飼料喂養+鏈脲佐菌素腹腔注射方法構建糖尿病性脂肪肝大鼠模型，通過青錢柳水提物連續灌胃4周后取材，對PI3K/Akt1/mTOR信號通路進行驗證。結果顯示，青錢柳能夠降低模型大鼠GLU、GSP、TC水平，減輕肝功能損傷，與以往研究結果[15-16]一致；Western blot檢測結果顯示，青錢柳可下調模型大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt1、p-mTOR蛋白表達，透射電鏡觀察發現肝臟自噬體增多。

綜上所述，青錢柳可有效降低糖尿病性脂肪肝大鼠血脂、血糖水平，減輕肝功能損傷，對肝臟有一定保護作用，其作用機制與抑制PI3K/Akt1/mTOR信號通路以增強自噬有關。