基于Wnt/β-catenin信號通路的復方補腎活血顆粒對骨髓間充質干細胞成骨、成脂分化的影響

喬明珠 ，呂浩 ，胡芷苜 ，梁龍 ，江渟

1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230031； 2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量減少、骨組織微小結構發生變化為主要特征的骨代謝疾病之一，容易引起骨脆性增加、骨折風險升高[1]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）是一類能在機體內自行更新并分化為中胚層細胞、具有多向分化潛能的成體干細胞[2]。BMSCs的增殖能力減弱會引起成骨細胞活力下降和成骨分化能力受到抑制[3]。研究表明，骨-脂間平衡與BMSCs分化為成骨細胞或成脂細胞有重大聯系，OP是骨-脂間平衡被破壞導致的代謝性疾病，其特征為骨髓內脂肪細胞過度積累而成骨細胞比例降低，骨量減少[4]。BMSCs促進骨修復主要是通過增強成骨分化，抑制成脂分化。因此，調控BMSCs分化對于代謝性骨病的治療至關重要。Wnt/β-catenin信號通路是BMSCs分化的經典途徑[5]，主要由細胞外分泌蛋白Wnt家族細胞膜上的跨膜受體、胞質內的降解復合體和β-連環蛋白（β-catenin）等組成。成骨分化過程中的Runt相關轉錄因子2（RUNX2）和脂肪形成過程中的過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ被認為是BMSCs分化的重要調節因子[6]，激活Wnt/β-catenin信號通路在促進BMSCs骨形成相關基因RUNX2和成骨細胞特異性轉錄因子Osterix（Osx）表達的同時，可以抑制其分化為脂肪細胞，具有促成骨和抗成脂活性[7-8]，對維持骨量、促進成骨分化和骨代謝至關重要[9]。復方補腎活血顆粒是安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，前期研究表明，該方能明顯改善OP患者中醫臨床癥狀、視覺模擬評分和骨密度[10]；體外實驗發現，其含藥血清具有促進BMSCs 增殖作用[11]。本研究基于Wnt/β-catenin信號通路觀察復方補腎活血顆粒含藥血清對BMSCs成骨、成脂分化的影響，探討其發揮作用的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

SPF 級8 周齡SD 大鼠30 只，雌雄各半，體質量200～250 g，購于安徽醫科大學實驗中心，動物許可證號SCXK（皖）2017-001。飼養于安徽中醫藥大學實驗動物中心標準動物房，動物實驗經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批。骨髓液取自安徽中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科手術患者（排除近5年內患有糖尿病、嚴重腎功能不全、甲亢、甲減、血液疾病、惡性腫瘤等進而影響骨代謝者），用于分離培養BMSCs。臨床試驗經安徽中醫藥大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審批。

1.2 藥物及制備

復方補腎活血顆粒（首烏藤25 g，白芍20 g，淫羊藿20 g，黃芪18 g，川牛膝15 g，牡蠣10 g），飲片由安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供。飲片加8倍量水浸泡1 h，煮沸30 min，過濾，再加6倍量水煎煮30 min，合并煎液，過濾，濃縮至1 mL藥液含原藥材2.9 g，4 ℃冰箱保存備用。

1.3 試劑與儀器

堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液、茜素紅染色液（上海碧云天生物，貨號分別為C3206、C0222、C0140），DMEM 培養基、PBS 緩沖液（美國Hyclone 公司，貨號分別為SH30243.01、AC10217621），RUNX2 抗體、Osx 抗體、CCAAT/增強子結合蛋白α（C/EBPα）抗體、PPARγ抗體、低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）5抗體、β-catenin抗體（英國Abcam公司，貨號分別為ab76956、ab209484、ab40764、ab178860、ab223203、ab32572），0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（美國Invitrogen公司，貨號25200056、16000-044），反轉錄試劑盒（上海新貝生物，貨號R202-02），BMSCs成骨、成脂誘導分化試劑盒（南京建成生物，貨號分別為HUXMX-90021、HUXMX-90031），CCK-8試劑、RNA提取試劑盒（上海奕杉生物，貨號分別為100-106、RN001），油紅O染色液（北京索萊寶，貨號G1262）。

CO2恒溫培養箱（德國Eppendorf 公司，型號C170i），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號CX53），全波段酶標儀（上海賽默飛公司，型號SkyHigh），梯度PCR 儀（美國ABI 公司，型號ABI VERITI），熒光定量PCR 儀（美國羅氏公司，型號LightCycler 480Ⅱ），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號5430R），Countstar細胞計數儀（上海睿鈺生物，型號IC1000），免疫印跡系統（上海天能公司，型號VE-180）。

2 實驗方法

2.1 骨髓間充質干細胞分離、培養及分組

用完全培養基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基）稀釋骨髓液后鋪于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，48 h后更換培養基，繼續培養6～8 d，將細胞進行消化傳代，作為第1代BMSCs。取第3代BMSCs，以5×104個/mL接種至6孔板中，待細胞完全貼壁后，將細胞分為空白組（完全培養基）和含藥血清低、中、高劑量組（低、中、高劑量組，分別為2%、5%、8%含藥血清）。

2.2 含藥血清制備

大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法分為含藥血清組和空白血清組（各15只）。按人與動物體質量折算等效劑量，含藥血清組以6倍等效劑量（29 g/kg）灌胃[12]，灌胃體積10 mL/kg，空白血清組以等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續7 d。末次給藥前12 h大鼠禁食不禁水，稱重后按60 mg/kg用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置1 h，3 500 r/min 離心20 min，取血清，56 ℃滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，15 mL離心管分裝，于-20 ℃冰箱保存。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力

收集狀態良好的第3～5代BMSCs，制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×104個/mL，接種于96孔板，將細胞按“2.1”項下分組，每組3個復孔，24 h后分別更換為不同濃度含藥血清繼續培養，于培養12、24、36、48 h后每孔加CCK-8溶液10 μL，培養箱培養1 h，酶標儀波長450 nm處測定各孔細胞活力（OD值）。

2.4 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色

BMSCs以5×104/mL密度接種于6孔板，將細胞按“2.1”項下分組，每組3個復孔，待細胞貼壁后，更換為含相應血清的BMSCs成骨誘導分化培養基繼續培養，每隔3 d更換1次培養基，誘導7 d后，PBS洗滌，加入40 g/L多聚甲醛溶液2 mL固定30 min，PBS洗滌，每孔加入ALP溶液1 mL充分反應，顯微鏡下觀察。成骨誘導14 d后，按照上述方法固定和清洗BMSCs，加入1 mL茜素紅染色液反應15 min，PBS沖洗，觀察鈣鹽沉積。

2.5 油紅O染色

BMSCs以5×104個/mL接種至6孔板中，將細胞按“2.1”項下分組，每組3個復孔，待細胞融合達到80%時，更換為含相應血清的BMSCs成脂誘導分化培養基A液培養3 d，換為含相應血清的成脂誘導分化培養基B液培養1 d，再次更換為培養基A液誘導，如此循環誘導14 d，PBS 輕柔洗滌，加入多聚甲醛溶液固定30 min，PBS沖洗2遍，每孔加入油紅O溶液2 mL，室溫染色30 min，顯微鏡下觀察染色效果。

2.6 RT-PCR檢測

將BMSCs 以5×104個/mL 接種于6 孔板中，按“2.1”項下分組，每組3個復孔，待細胞貼壁后，分別加入相應含藥血清培養基2 mL，置于培養箱培養3、5、7 d。按照試劑盒說明書抽提細胞中的RNA，紫外分光光度計測定濃度，根據PCR擴增體系和反應條件進行擴增，利用RUNX2、Osx、C/EBPα、PPARγ引物進行PCR，以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。引物由上海新貝生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測

將BMSCs按“2.6”項下方法處理后，PBS清洗3次，加入RIPA和PMSF混合液200 μL，裂解10 min提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，12%凝膠電泳分離等量蛋白，轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加GAPDH一抗（1∶2 000）、RUNX2一抗（1∶300）、Osx一抗（1∶1 000）、C/EBPα一抗（1∶1 000）、PPARγ一抗（1∶1 000）、LRP5一抗（1∶1 000）、β-catenin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，孵育相應二抗，利用Image J軟件對條帶進行分析，并計算目的蛋白相對表達量。

3 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態分布及方差齊性，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；不滿足正態分布使用非參數檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 骨髓間充質干細胞形態學特征

BMSCs首次換液后呈梭形或多角形分布，7 d左右可長滿培養瓶。傳至第3代，細胞生長速度加快，為較均一的長梭形，聚集生長，呈有方向性的魚群狀，細胞形態均勻。見圖1。

圖1 BMSCs形態學特征（×40）

4.2 復方補腎活血顆粒對骨髓間充質干細胞活力的影響

在一定濃度范圍內，復方補腎活血顆?？商岣連MSCs細胞活力，其中以中劑量組作用最明顯，36 h達到高峰，說明復方補腎活血顆粒提高細胞活力不僅與劑量有關，也與作用時間有關。見圖2。

圖2 各組BMSCs細胞活力比較（±s，n=3）

4.3 復方補腎活血顆粒對骨髓間充質干細胞成骨分化潛能的影響

成骨誘導分化7 d后，與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs ALP染色加深，其中以高劑量組顏色最深，陽性染色面積最大，顯微鏡下可見無規則的形態變化，局部有一定的細胞聚集，并有大量鈣化結節。見圖3。成骨誘導分化14 d 后，與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs染色加深，橘紅色沉淀增多，說明礦化結節增加。見圖4。

圖3 各組BMSCs形態（ALP染色，×40）

圖4 各組BMSCs形態（茜素紅染色，×40）

4.4 復方補腎活血顆粒對骨髓間充質干細胞成脂分化潛能的影響

成脂誘導分化14 d后，BMSCs形態呈圓形或不規則形，其油脂可被油紅O染為紅色。與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs顏色逐漸變淺，表明脂滴數量逐漸減少，其中以高劑量組脂滴減少最為明顯。見圖5。

圖5 各組BMSCs形態（油紅O染色，×40）

4.5 復方補腎活血顆粒對骨髓間充質干細胞成骨、成脂分化相關基因表達的影響

與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs培養3、5、7 d后，成骨相關因子RUNX2和Osx mRNA表達升高，成脂相關因子C/EBPα和PPARγ mRNA表達降低，除3 d低劑量組Osx、RUNX2、PPARγ，3 d中劑量組Osx、RUNX2和5 d低、中劑量組RUNX2外，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見圖6。

圖6 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx、C/EBPα、PPARγ mRNA表達比較（±s）

4.6 復方補腎活血顆粒對骨髓間充質干細胞成骨、成脂分化相關蛋白表達的影響

與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs培養3、5、7 d 后RUNX2 和Osx 蛋白表達升高，C/EBPα 和PPARγ蛋白表達降低，其中高劑量組差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見表2、表3、圖7。

圖7 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx、C/EBPα、PPARγ蛋白免疫印跡

表2 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx蛋白表達比較（±s）

表2 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx蛋白表達比較（±s）

注：與空白組同一時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 d 5 d 7 d Osx 0.84±0.01 0.91±0.01 0.94±0.02 1.30±0.09**RUNX2 0.76±0.02 0.91±0.02 1.28±0.53 1.27±0.05 Osx 0.73±0.03 0.83±0.03**0.84±0.01**1.28±0.05***RUNX2 0.82±0.03 0.90±0.02*0.96±0.02 1.15±0.05**Osx 0.73±0.01 0.84±0.03*1.10±0.05**1.20±0.03**RUNX2 0.68±0.01 0.79±0.05*0.87±0.02*1.21±0.01**

表3 各組BMSCs不同時點C/EBPα、PPARγ蛋白表達比較（±s）

表3 各組BMSCs不同時點C/EBPα、PPARγ蛋白表達比較（±s）

注：與空白組同一時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 d 5 d 7 d PPARγC/EBPαPPARγC/EBPαPPARγ 1.09±0.10 0.91±0.03*0.73±0.04***0.50±0.26***C/EBPα 1.20±0.01 0.98±0.02***0.52±0.03***0.49±0.04***0.80±0.60 0.96±0.02 0.74±0.07 0.60±0.05 0.94±0.07 0.68±0.12**0.70±0.01*0.57±0.02***1.08±0.10 0.82±0.10**0.57±0.03**0.48±0.01***1.21±0.10 0.81±0.02***0.60±0.01***0.56±0.02***

Western blot 檢測培養3、7 d 后LRP5、β-catenin蛋白表達。結果顯示，與空白組比較，中、高劑量組LRP5蛋白表達顯著升高，各組β-catenin蛋白表達均顯著升高（P＜0.05，P＜0.001），見圖8、圖9。

圖9 各組BMSCs不同時點LRP5、β-catenin蛋白表達比較（±s）

5 討論

OP導致的脆性骨折帶來的嚴重并發癥具有較高的致殘率和病死率，在很大程度上威脅患者的生活質量和身心健康[13]。OP屬中醫學“骨痿”“骨枯”范疇，腎主骨、生髓，骨之強健，非骨髓之滋養不可，即“腎充則髓實”。腎的精氣盛衰對骨代謝的影響極為重要，腎虛精虧為OP核心病機[14]。多項臨床及實驗研究顯示，中藥復方在治療OP方面具有顯著優勢[15-16]。復方補腎活血顆粒中淫羊藿、川牛膝入腎經，具有補腎精、固筋骨作用；黃芪、牡蠣、首烏藤歸肝、腎經，可補諸虛不足，具有補虛、益氣、通脈功效；白芍緩急止痛。BMSCs在OP發展過程中扮演重要角色，正常狀態下，成骨-成脂分化處于動態平衡狀態，當代謝平衡被打破后，會造成骨代謝紊亂，進而引發OP等骨代謝疾病[17-18]。研究發現，大部分OP 患者表現為BMSCs成骨分化能力減弱、成脂分化能力增強[19-20]。促進BMSCs向成骨細胞轉化，降低成脂細胞比例，對于改善骨-脂代謝，延緩OP進程具有重大意義。本研究以復方補腎活血顆粒含藥血清干預體外培養的BMSCs，觀察其對BMSCs增殖及成骨、成脂分化的影響，明確復方補腎活血顆粒發揮作用的機制。

ALP作為早期成骨標志物，通過水解各種類型的磷酸鹽促進細胞成熟，在成骨分化過程中能夠促進細胞鈣化；茜素紅染色對成骨分化晚期鈣結節的數量具有指示作用。二者均能直接反映成骨分化程度[21]。本實驗結果顯示，復方補腎活血顆粒含藥血清能明顯促進BMSCs鈣化，形成鈣結節。油紅O染色結果表明，復方補腎活血顆粒含藥血清能顯著降低BMSCs脂質沉積，抑制BMSCs成脂分化能力。促進BMSCs向成骨細胞或成脂細胞分化的關鍵因素是提高與特異性細胞類型有關的基因表達，啟動和促進特異性細胞類型的分化[22]。RUNX2在BMSCs轉化為成骨細胞的過程中起關鍵作用，可促進BMSCs成骨分化，抑制BMSCs成脂分化，RUNX2缺失導致BMSCs無法分化為成骨細胞[23]。Osx 是BMSCs 成骨分化的另一重要轉錄因子，在RUNX2下游起作用，且可被RUNX2激活[24]。PPARγ不僅在脂肪細胞分化中起重要作用，而且對成骨相關因子RUNX2有負向調節作用，對骨形成有一定抑制作用[25]。C/EBPα作為PPARγ下游，其激活后能協同PPARγ發揮作用，調控多種成脂蛋白[26]。在成脂過程中，PPARγ和C/EBPα表達升高。通過在BMSCs分化的不同時點驗證復方補腎活血顆粒含藥血清的作用，發現復方補腎活血顆粒含藥血清能促進BMSCs分化不同階段的RUNX2和Osx表達。此外，干預后成脂分化關鍵因子PPARγ和C/EBPα表達降低，進一步表明復方補腎活血顆粒含藥血清促進成骨分化、抑制成脂分化的藥效作用。

Wnt通路激活后，Wnt配體與LRP5/6受體結合，導致GSK-3β活性被抑制，進一步激活β-catenin，活化的β-catenin進入細胞核與核轉錄因子結合，形成復合體，刺激下游相關基因表達。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活后促進BMSCs成骨分化，抑制成脂分化[27]，其關鍵分子β-catenin缺失會導致BMSCs成骨分化能力減弱，從而導致OP發生[28-29]。因此，通過檢測Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白LRP5和β-catenin表達，發現復方補腎活血顆粒含藥血清可顯著上調LRP5和β-catenin蛋白表達，提示復方補腎活血顆?？赡芡ㄟ^激活Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化。但考慮到中藥復方藥材的多樣性及化學成分的復雜性，其干預疾病的途徑及靶點并非單一，因此本研究結果仍需進一步探討。