馬來酰亞胺基烯二炔化合物對生物大分子的損傷作用

孫 可， 魯浩天， 張夢思， 胡愛國

（華東理工大學材料科學與工程學院, 上海市先進聚合物材料重點實驗室, 上海 200237）

烯二炔是一個烯單元（ene）共軛連接兩個炔單元（yne）所形成的具有“炔-烯-炔”主體化學結構的一類化合物。1965 年從鏈霉菌的發酵液中分離出的新制癌菌素是第1 個被發現的烯二炔類化合物并于1985 年被證實[1]。1972 年Bergman 等[2]首次提出了烯二炔的環芳香化反應，并闡明了烯二炔抗生素的獨特作用機制[3]。在隨后的二十幾年里，人們陸續發現了包括calicheamicins[4]、esperamicins[5]、dynemicins[6]、C-1027[7]等在內的更多類型的烯二炔。由于烯二炔具有獨特的分子結構和強烈的DNA 剪切活性，因此吸引了無數化學家和生物學家的目光[8]。這類天然烯二炔是目前世界上已知的最具細胞毒性的分子，它們的抗腫瘤活性比臨床上常用藥物阿霉素高出上千倍。因此，烯二炔作為相關臨床藥物的潛力得到了廣泛探索，例如通過用聚合物和抗體-藥物偶聯物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）作為藥物遞送體系可將烯二炔類藥物開發成為抗癌藥物[9]。

除了DNA 外，烯二炔類化合物還可作用于蛋白質[10]，使蛋白質主鏈發生分子內交聯或降解，從而失去結構完整性乃至生物活性。Zein 等[11]在1993 年首次報道了人工合成的烯二炔對蛋白質的損傷作用。他們發現0.46 mmol/L 的烯二炔即可對細胞膜蛋白質HCT116 產生完全降解作用。當使用其他蛋白質如3'，5'-環腺苷酸依賴性蛋白激酶、前列腺酸性磷酸酶或小牛腦微管蛋白時也能觀察到類似的現象。Jones 課題組[12]確定了3 類結構獨立的烯二炔具有明確的蛋白質靶點（白蛋白、組蛋白和雌激素受體），顯示了親合力與蛋白質降解活性之間的相關性。Zaleski 課題組[13]通過金屬配位作用活化烯二炔化合物，發現烯二炔可以降解淀粉樣蛋白，為緩解阿爾茲海默癥提供一條新策略。

烯二炔類化合物的環化反應機理主要包括Bergman環化和Myers-Saito 環化兩類。Bergman 環化反應是共軛的烯二炔通過熱致或光致誘導的分子內環化生成1,4-苯雙自由基或其類似物的一類環化反應[2]。烯炔-聯烯結構（可由烯二炔結構重排而生成）的Myers-Saito 環化與Bergman 環化具有類似的反應機理，它們均是由閉殼層化合物產生開殼層的高活性雙自由基。相對而言，Myers-Saito 環化反應通?？梢栽谳^低的溫度下發生，原因可能是平面內π 軌道在橫向方向上的排斥力減小所致[14]。天然烯二炔是從放線菌中分離得到的，來源非常稀少，提取量一般在微克級別，由于其具有復雜的分子結構，通過化學方法進行合成困難，極大地限制了它們的應用。因此，為了尋找能夠替代天然烯二炔的優異抗癌藥物，人們付出了大量努力設計合成具有高反應活性的烯二炔分子[15]。

本課題組經過系列研究，發現在非環烯二炔的烯端引入馬來酰亞胺基團對于降低化合物的熱觸發反應溫度有重要作用[16]，并提出了馬來酰亞胺促進的重排和環芳香化反應（Maleimide Assisted Rearrangement and Cycloaromatization, MARACA）機制[17]。研究表明馬來酰亞胺基團的存在可以促進分子內的級聯1,3-質子轉移過程，使得原本具有熱穩定性的開環烯二炔化合物在生理環境下原位轉化為烯炔-聯烯結構，并快速通過Myers-Saito 環化形成高活性的雙自由基中間體?；谶@種新機制設計合成的馬來酰亞胺基烯二炔化合物均可在生理溫度下形成活性雙自由基并導致DNA 斷裂，從而對所有測試的腫瘤細胞系均產生細胞毒性[17-18]。

在病毒肆虐的今天，探索新型抗病毒藥物具有重要的意義[19]。病毒是一種結構簡單的非生命體，其主要成分是核酸和發揮保護、傳染、復制等功能的蛋白質[20]，任何對這些生物大分子結構具有破壞作用的化合物均可能成為潛在的抗病毒藥物。本文利用Sonogashira 偶聯反應設計合成了3 種炔末端具有不同羥基數量的馬來酰亞胺基烯二炔，探索了其在生理溫度下通過MARACA 反應機制產生自由基的能力；通過瓊脂糖凝膠電泳實驗和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳實驗探究了其對DNA、蛋白質等生物大分子的損傷作用，為開發基于烯二炔的抗病毒藥物奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑 2,3-二氯馬來酸酐，分析純，上海霖陵化工科技有限公司；新戊胺，分析純，上海泰坦科技股份有限公司；碘化鈉，分析純，薩恩化學技術（上海）有限公司；3-丁炔-1-醇，分析純，安徽澤升科技有限公司；乙基炔丙酯，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；季戊四醇，分析純，上海泰坦科技股份有限公司；4-戊炔酸，分析純，薩恩化學技術（上海）有限公司；N,N-二異丙基乙胺，分析純，薩恩化學技術（上海）有限公司；碘化亞銅，分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；4-二甲氨基吡啶，分析純，上海泰坦科技股份有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，分析純，上海畢得醫藥科技有限公司；乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（DCM）、甲苯、四氫呋喃（THF）、二甲基亞砜（DMSO），分析純，上海泰坦科技股份有限公司；乙腈、冰乙酸，分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF），分析純，安徽澤升科技有限公司；Tris-EDTA 緩沖液，分析純，碧云天生物技術公司；pUC 19 DNA 緩沖液，上海晶岱生物科技有限公司；DNA 上樣緩沖液（6×），上海源葉生物科技有限公司；瓊脂糖，分析純，百靈威科技有限公司；YeaRed Nucleic Acid Gel Stain，分析純，翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Lysozyme/溶菌酶(＞20 kU/mg)，分析純，碧云天生物技術有限公司；PAGE 預制膠(Hepes, 4%～20%)，碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE Hepes 電泳液(20×)，分析純，碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE 蛋白染色及上樣緩沖液(5×)，碧云天生物技術有限公司；蛋白質標準品(5 mg/mL BSA)，分析純，碧云天生物技術有限公司。甲苯、THF 均經過鈉砂干燥重蒸后使用?；衔?，2 參考我們前期工作合成[17]。

1.1.2 主要儀器 核磁共振氫譜儀（1H-NMR，400、600 MHz）和碳譜儀（13C-NMR，600 MHz）：美國Bruker公司BRUKER BIOSPIN AG 型；高分辨質譜儀（HRMS）：采用英國Micromass LCTTM 型液相色譜/飛行時間質譜聯用儀， 配以Waters 600 液相色譜儀進樣系統，注射泵離子化方式為電噴霧電離（ESI）；電子順磁共振波譜儀（EPR）：美國Bruker 公司EMX-8/2.7C 型，采用X 波帶頻率測試記錄；蛋白質/DNA 電泳儀：北京六一生物科技有限公司DYY-6D 型；蛋白質/DNA成像系統：上海越眾設備有限公司暗箱紫外分析儀ZF-20A 型。

1.2 烯二炔化合物的制備

烯二炔的合成策略參考本課題組前期工作[17]，合成步驟如圖1 所示。

圖1 烯二炔化合物的合成路線Fig.1 Synthetic route of the enediyne compounds

化合物3[21]：室溫下稱取4-戊炔酸（2.16 g，22 mmol），季戊四醇（6 g，44 mmol），4-二甲氨基吡啶（537 mg，4.4 mmol）加入250 mL 圓底燒瓶中，在0 ℃冰水浴中緩慢逐滴加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（4.2 g，22 mmol）的DMF（40 mL）溶液，有輕微混濁出現，隨后轉移至80 ℃油浴鍋中攪拌24 h。通過薄層色譜（TLC）點板對反應進行跟蹤，待4-戊炔酸反應完全后減壓蒸餾除去DMF。加入適量甲醇制備干粉，通過硅膠柱層析法（淋洗劑為DCM 和甲醇的混合物，體積比10∶1）對產物進行分離，得到無色油狀物2.1 g，產率為44%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3，δ)： 4.22 (s, 2H), 3.65 (s, 6H), 2.61 (t,J=6.7 Hz, 2H),2.52 (td,J= 6.4, 2.3 Hz, 2H), 2.01 (t,J= 2.5 Hz, 1H);13C-NMR (101 MHz, CDCl3，δ)：172.79, 82.24, 69.43,63.51, 63.25, 45.30, 33.40, 14.48。

馬來酰亞胺基烯二炔化合物的一般合成方法：室溫下分別稱取化合物2（252 mg，0.6 mmol）、NHC（氮雜環卡賓）-PdCl2-3-chloropyridine[22]（41 mg，0.06 mmol）、碘化亞銅（46 mg，0.24 mmol）加入25 mL Schlenk 瓶中。抽換氣3 次后，通氮氣條件下依次加入干燥的甲苯（4 mL）、N，N-二異丙基乙胺（297 μL，1.8 mmol），分別加入反應所需要的炔各0.9 mmol、干燥的THF 2 mL，每一次加入后均需要抽換氣3 次。反應在室溫通氮氣保護條件下進行，通過TLC點板對反應進行跟蹤。待化合物2 反應完全，抽真空將體系中的溶劑濃縮至1.5 mL 左右，通過硅膠柱層析法對產物進行分離純化，最終得到純凈的烯二炔化合物。

化合物EDY-A：根據一般合成方法制備（室溫反應16 h），通過硅膠柱層析法（淋洗劑為正己烷與乙酸乙酯的混合物，體積比1∶1）對產物進行分離純化，得到深紅色油狀物54.2 mg，產率為27%。1H-NMR(600 MHz, CDCl3，δ) ：4.97 (s, 2H), 3.87 (t,J= 6.0 Hz,2H), 3.34 (s, 2H), 2.85 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 2.14 (s, 3H),0.91 (s, 9H);13C-NMR (151 MHz, CDCl3，δ): 170.3,167.6, 130.4, 127.0, 110.5, 102.2, 76.2, 73.0, 60.4, 52.6,50.3, 33.7, 28.0, 25.1, 20.8; HRMS (ESI),m/zcalcd.for C18H21NO5Na [M + Na]+: 354.131 7; found 354.131 6。

化合物EDY-B：根據一般合成方法制備（室溫反應15 h），通過硅膠柱層析法（淋洗劑為正己烷和乙酸乙酯的混合物，體積比1∶3）對產物進行分離純化，得到黃色油狀物124 mg，產率為68%。1H-NMR(600 MHz, CDCl3，δ)： 3.85 (t,J= 6.0 Hz, 4H), 3.33 (s,2H), 2.83 (t,J= 6.0 Hz, 4H), 0.90 (s, 9H); HRMS (ESI),m/zcalcd.for C17H21NO4Na [M + Na]+: 326.136 8; found 326.136 6。

化合物EDY-C：根據一般合成方法制備（室溫反應17 h），通過硅膠柱層析法（淋洗劑為DCM 和甲醇的混合物，體積比8∶1）對產物進行分離純化，得到紅色油狀物230 mg，產率為64%。1H-NMR (600 MHz,CD4O，δ) ：4.15 (s, 4H), 3.59 (s, 12H), 3.30 (s, 2H), 2.91(t,J= 7.1 Hz, 4H), 2.73 (t,J= 7.1 Hz, 4H), 0.90 (s, 9H);13C-NMR (151 MHz, CD4O，δ) ：171.80, 167.94, 128.15,109.40, 71.27, 63.30, 60.97, 47.61, 44.93, 32.90, 32.40,26.94, 15.47; HRMS (ESI),m/zcalcd.for C29H41NO12Na[M + Na]+: 618.252 6; found 618.252 7。

1.3 電子順磁共振實驗

配制濃度為100 mmol/L 的N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）的DMSO 溶液，隨后依據化合物的質量向烯二炔中加入一定量PBN（濃度為20 mmol/L）的DMSO 溶液配制烯二炔母液；另外設置一組不加烯二炔且PBN 濃度為20 mmol/L 的DMSO 溶液作為對照組。將所有樣品置于37 ℃水浴鍋中反應12 h 后進行電子順磁共振測試。

1.4 DNA 凝膠電泳實驗

瓊脂糖凝膠的配制：室溫下稱取5 g 瓊脂糖加入500 mL 玻璃瓶中，加入500 mL 三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（TAE）（1×）緩沖液，將玻璃瓶轉移至微波爐中，加熱至溶液澄清透明后取出，置于70 ℃烘箱中備用；核酸染料的配制：取1.755 g NaCl、90 μL DuRed、300 mL 超純水混勻。將烯二炔溶于DMSO 中配制成濃度為40 mmol/L 的母液。將pUC19 DNA 緩沖液（20 ng/μL）與Tris-EDTA 緩沖液按照體積比1∶8 在適當的離心管中充分混勻后分裝到若干個200 μL 離心管中，每個離心管加入8 μL 該混合溶液。在實驗組中，每個離心管中分別加入一定量的烯二炔母液與DMSO，使溶液最終的體積均為16 μL，配制成一系列具有不同濃度梯度的烯二炔與DNA 的混合溶液；在對照組中，則僅加DMSO 使溶液的終體積達到16 μL。將對照組與實驗組轉移至37 ℃水浴鍋中作用48 h。取適量配制好的瓊脂糖凝膠倒入帶有梳子的制樣槽中，冷卻后得到帶有若干孔道的瓊脂糖凝膠板。將膠板轉移至含有一定量TAE（1×）緩沖液的電泳槽中，使緩沖液沒過瓊脂糖凝膠板3～4 mm。將2 μL DNA 上樣緩沖液與反應后的樣品混勻，然后吸取9 μL 緩慢加入瓊脂糖凝膠板孔道中。設置電泳儀電壓為100 V，電流為90 mA，開始跑膠，時間約為1.5 h。將結束跑膠的瓊脂糖凝膠板置于配制好的核酸染料中至少染色30 min。最后將結束染色的膠板置于暗箱中，在302 nm紫外燈下使用蛋白質/DNA 成像系統對DNA 成像并拍攝記錄。

1.5 SDS-PAGE 凝膠電泳實驗

InstantView? SDS-PAGE 蛋白染色及上樣緩沖液（5×）的配制：取出裝有染料的離心管，將染料集中至管底。從低溫冰箱中取出上樣緩沖液（5×），室溫融化并使用移液槍吹打混勻。在裝有染料的離心管中加入1 mL上樣緩沖液（5×），充分溶解并使用移液槍吹打混勻后備用。將烯二炔溶于DMSO 中配制成濃度為40 mmol/L 的母液。分別取8 μL 蛋白樣品分裝到若干個200 μL 離心管中，即每個離心管中有40 μg蛋白樣品。在實驗組中，每個離心管中分別加入一定量的烯二炔母液與DMSO，使溶液最終的體積均為16 μL，配制成一系列具有不同濃度梯度的烯二炔與蛋白質的混合溶液；在對照組中，僅加入DMSO 使溶液終體積達到16 μL。將對照組與實驗組轉移至37 ℃水浴鍋中作用48 h。以上樣緩沖液體積與蛋白質樣品總體積之比為1∶4 向每個離心管中加入4 μL 上樣緩沖液并充分混勻。將離心管轉移至95～100 ℃水浴中加熱5～10 min，使蛋白質充分變性并與染料結合緊密。

SDS-PAGE 電泳液（1×）的配制：室溫下量取25 mL SDS-PAGE 電泳液（20×）加入500 mL 燒杯中，再向燒杯中加入400 mL 超純水，轉移至500 mL 容量瓶中，定容至500 mL 即得到SDS-PAGE 電泳液（1×）。

SDS-PAGE 凝膠電泳實驗：將預制膠從包裝中取出后固定在電泳槽中，緩慢拔出梳子。內槽加入少量配制好的電泳液，再使用100 mL 移液槍輕輕吹打加樣孔以去除氣泡和殘留的儲存緩沖液。隨后將內槽加滿電泳液，外槽加入適量電泳液沒過電泳槽底部陽極。待加熱后的離心管冷卻至室溫后使用10 μL 移液槍垂直插入上樣孔中上樣，在膠板的每個孔道中加入8 μL樣品。設置電泳儀電壓為120 V，電流100 mA，時間70 min，開始跑膠。跑膠結束，置于暗箱紫外分析儀中，在254 nm 波長下觀察熒光結果。

2 結果與討論

2.1 化合物的合成

基于本課題組對馬來酰亞胺基烯二炔化合物的研究，本文延續以往的合成路線，通過Sonogashira偶聯反應[23]將反應所需要的一種或兩種端基炔連接到二碘馬來酰亞胺化合物2 上，從而實現對稱或者非對稱烯二炔核心單元的構建?；衔顴DY-A 為以往工作中報道過的烯二炔[17]，化合物EDY-B 和EDYC 的結構得到了核磁共振氫譜（如圖2）與高分辨質譜結果的證實。

圖2 EDY-B 和EDY-C 的核磁共振氫譜Fig.2 1H-NMR spectra of EDY-B and EDY-C

2.2 自由基的產生

通過電子順磁共振實驗證明烯二炔具有在生理溫度下產生自由基的能力[24]。對此，選用自由基捕捉劑PBN 將體系生成的自由基轉化為穩定的氮氧自由基從而間接證明自由基的生成，如圖3 所示。與對照組PBN 相比，烯二炔EDY-A 在0.352 0 T 附近處出現對應于氮氧自由基信號的典型三重峰，由此證實了體系中自由基的產生。這一結果為后續進一步開展生物測試奠定了理論基礎。

圖3 化合物EDY-A（紅色）與對照組（黑色）的EPR 譜圖Fig.3 EPR spectra of compound EDY-A (red) and control group(black)

2.3 DNA 裂解活性

Basak 等[25]將DNA 的裂解分為兩種形式：單鏈剪切和雙鏈剪切。通過使用環狀超螺旋質粒DNA（Form Ⅰ）來探索DNA 的切割活性，當兩條鏈中僅有一條斷裂或產生切口而引起DNA 松弛時為單鏈剪切（Form Ⅱ）；當在兩條鏈的互補位點（或接近互補位點）產生切割從而形成線性形態時為雙鏈剪切（FormⅢ）。本文使用pUC19 DNA 質粒，探究了烯二炔EDY-A 和EDY-C 對DNA 的損傷作用。研究結果表明，兩種烯二炔在生理溫度下均可以對DNA 產生裂解效果，并且表現出明顯的濃度依賴性（圖4）。其中，隨著藥物濃度增大，EDY-A 在5 mmol/L 時可使DNA 由Form Ⅱ轉化為Form Ⅲ，意味著此濃度下烯二炔對DNA 雙螺旋結構產生了更強的裂解作用。然而與EDY-A 相比，EDY-C 在相同濃度下并未對DNA 表現出明顯的剪切效果。當EDY-C 濃度增大到15 mmol/L 以上時，才出現除Form Ⅰ以外的熒光拖尾條帶。這表明EDY-C 對DNA 的損傷作用弱于EDY-A，我們認為這是由于化合物EDY-C 的烯二炔結構產生自由基的能力弱于EDY-A 導致的。根據MARACA 機理，烯二炔的炔丙位上如果存在雜原子，則會加速分子內氫轉移過程，促進烯二炔轉化為炔烯-聯烯結構和高活性自由基的生成[17,26]。在EDY-C（或者EDY-B）中，炔丙位直接相連的是無推拉電子作用的亞甲基，而在EDY-A 中，其中一個炔臂上存在炔丙酯結構，有利于分子內氫轉移過程和后續的環芳香化反應。

圖4 在37 ℃下，化合物EDY-A（a）和EDY-C（b）與pUC19 DNA 作用48 h 后的凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of compound EDY-A (a) and EDY-C (b) reacting with pUC19 DNA at 37 ℃ for 48 h

2.4 蛋白質降解活性

選擇生化實驗中常用的牛血清白蛋白（BSA）和溶菌酶（Lysozyme）為模型蛋白質，借助SDS-PAGE凝膠電泳技術探究了此類馬來酰亞胺基烯二炔化合物對不同蛋白質的損傷作用。結果表明烯二炔化合物對蛋白質同樣具有濃度依賴性的裂解效果（圖5）?；衔顴DY-A 在5 mmol/L 濃度下對BSA表現出裂解活性，蛋白質熒光條帶變暗；當EDY-A 濃度提高至10 mmol/L時則無法觀察到蛋白質熒光條帶，我們認為這是由于烯二炔產生的高活性自由基將蛋白質裂解成碎片導致的。類似的，EDY-A 在相同濃度梯度下對溶菌酶蛋白質表現出顯著的裂解效果。然而當烯二炔濃度增大至10 mmol/L 時，依然可以觀察到拖尾的蛋白質熒光條帶，說明EDY-A 對溶菌酶蛋白質的損傷效果弱于BSA。此外，EDY-B、EDY-C 對溶菌酶蛋白質在設置的最大濃度（分別為20，40 mmol/L）下才表現出一定的裂解效果，且效果并不明顯。以上結果與前文烯二炔對DNA 的裂解實驗結果一致。

圖5 不同種類烯二炔化合物對牛血清白蛋白和溶菌酶的SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig.5 SDS-PAGE gel electrophoresis of the different enediyne compounds on BSA and lysozyme

3 結論與展望

本文基于MARACA 反應機制，利用Sonogashira偶聯反應合成了3 種具有不同羥基數量封端的馬來酰亞胺基烯二炔。通過凝膠電泳實驗證實了此類烯二炔具有在生理溫度下產生自由基的能力，并可導致生物大分子如DNA 或蛋白質出現裂解等損傷作用，其損傷效果與烯二炔化合物的反應活性一致，其中炔丙位上具有雜原子的EDY-A 表現出最優異的生物損傷作用。以上研究結果為后續通過分子設計合成具有更高生物活性的烯二炔化合物提供指導，為此類烯二炔在未來破壞病毒蛋白結構的研究方向鋪平道路。