miR-151-3p在子宮內膜異位癥組織中的表達及其對子宮內膜基質細胞遷移和侵襲的影響

謝 震,趙 健,吳 娟,王雅麗,馬麗霞,趙彩粉

0 引 言

子宮內膜異位癥(endometriosis,EMS)是一種慢性婦科疾病,其特征是存在植入子宮外的子宮內膜樣組織,最常見于盆腔腹膜和卵巢。這些雌激素依賴性異位植入物是一種良性炎癥性疾病,但影響全球高達10%的育齡婦女,可導致痛經和不孕等癥狀[1-3]。目前,EMS的發病機制有多種學說,其中月經逆行學說被普遍認為是導致EMS形成的主要原因,即子宮內膜碎片通過月經逆行在盆腔或盆腔外不同的表面植入并異位生長。然而,有證據表明約90%的女性會發生月經逆行現象,但大約只有10%的女性會患有EMS,表明其還需要其他致病因素如炎癥、氧化應激和表觀遺傳變化的參與,而這些因素會影響子宮內膜細胞的遷移、粘附和侵襲[4]。MicroRNA (miRNA)是一種內源性小的單鏈非編碼RNA,長度為20～22個核苷酸,可與靶mRNA的互補序列結合,以阻斷翻譯或影響mRNA的穩定性[5]。MiR-151在癌癥的發生發展過程扮演抑癌基因的作用,Zhang等[6]研究顯示,miR-151-3p可抑制人神經膠質瘤細胞的增殖和上皮-間充質轉化(EMT);Chen等[7]研究稱,miR-151-3p可抑制前列腺癌細胞生長、遷移和侵襲[7]。眾所周知,細胞遷移和侵襲在EMS發病過程中發揮重要的促進作用[8],但具體作用機制尚不明確,而miR-151-3p在EMS患者子宮內膜組織中表達水平以及其對宮內膜基質細胞(endometrial stromal cells,ESCs)的遷移和侵襲還有待于研究。為此,本研究檢測EMS患者子宮內膜組織中miR-151-3p表達情況,并分析了miR-151-3p對ESCs細胞增殖、侵襲與遷移的影響,旨在為臨床治療EMS提供更多的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集2018年3月至2020年12月在本院婦科行手術治療的EMS患者組織87份,根據發病部位分為在位子宮內膜組(eEMS組)和異位子宮內膜組(nEMS組),同時選取47份因子宮肌瘤等良性婦科疾病進行手術治療的患者正常子宮內膜組織作為對照組。

1.2 主要試劑引物序列、mimics NC、miR-151-3p mimics、inhibitors NC和miR-151-3pinhibitors均由蘇州金唯智公司設計和合成;DMEM/F12和Lipofectamine 3000購自美國Thermo Fisher公司;miRNA逆轉錄試劑盒購自上海新貝生物科技有限公司;miRNA熒光定量PCR試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司;I型膠原酶購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;GAPDH、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;二抗購自美國Millipore公司;人波形蛋白、人角蛋白單克隆抗體和熒光二抗購自英國Abcam公司。

1.3 ESCs細胞提取、分離、培養及鑒定取子宮內膜組織清洗剪碎,加入含有I型膠原酶(1 mg/mL)的DMEM/F12培養基孵育消化50 min。使用400目濾膜過濾分離的ESCs細胞,隨后離心收集細胞,加入含有10% FBS的DMEM/F-12培養基重懸細胞,放入37 ℃、5% CO2的培養箱。將ESCs細胞接種于放有蓋玻片的六孔板中培養24 h。棄去培養基,加入4%甲醛固定30 min,再加1% NP-40處理5 min,用5% BSA室溫孵育1 h,接著加人波形蛋白(vimentin)和人角蛋白(keratin)單抗,4 ℃過夜。次日,加入相應的熒光二抗,室溫孵育1 h。最后加入80 μL DAPI,孵育20 min。滴加放淬滅劑封片,放于倒置熒光顯微鏡觀察拍照,以人波形蛋白陽性且人角蛋白陰性的細胞鑒定為ESCs細胞。

1.4 細胞轉染及分組將ESCs細胞以3×105個/每孔接種到6孔板上,每孔加2 mL含10% FBS 的DMEM/F12培養基進行培養,將ESCs細胞進行分組:mimics NC組、miR-151-3p mimics組、inhibitors NC組和miR-151-3pinhibitors組。待細胞豐度達到80%時,依照Lipofectamine 3000說明書進行操作,將miR-151-3p mimics、mimics NC、miR-151-3p inhibitors和inhibitors NC轉染到相應的細胞中,48 h后進行后續實驗。

1.5 qRT-PCR檢測采用TRIzol法提取子宮內膜組織及各組細胞內總RNA,然后用miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,隨后依照miRNA熒光定量PCR試劑盒反應體系進行實驗。所用引物序列如下:miR-151-3p上游5′-GGATGCTAGACT GAAGCTCCT-3′,下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游5′-CTCGCTTC GGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6作為內參,采用2-ΔΔCT法計算miR-151-3p的相對表達量。

1.6 CCK-8實驗將轉染后ESCs細胞以5×103個/每孔接種到96孔板中,分別培養24、48和72 h后,每孔加10 μL CCK-8溶液,接著培養4 h 。酶標儀檢測450 nm處的A值,并以A450值表示細胞增殖活性。

1.7 Transwell檢測遷移與侵襲實驗遷移實驗:將轉染后ESCs細胞,用無血清DMEM/F-12培養基重懸,其密度為1×105個/mL,加200 μL細胞懸液至Transwell小室的上層,同時加500 μL含10% FBS的DMEM/F-12培養基至小室下層,培養24 h。取出小室,多聚甲醛固定下層細胞,結晶紫染色,用載玻片固定小室中的膜后,顯微鏡觀察,每組隨機選取5個視野拍片,統計細胞數。侵襲實驗:提前將用無血清DMEM/F-12培養基稀釋的Matrigel膠(1 mg/mL)加到小室上層,隨后步驟同遷移實驗。

1.8 Western blot實驗提取各組總蛋白并用考馬斯亮藍法定量。取等量蛋白用10% SDS-PAGE電泳分離,并轉至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h,以1∶1000的稀釋比例加入GAPDH、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin抗體4 ℃過夜,再加二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,最后加ECL曝光顯色。以GAPDH為內參,用Image J軟件對各蛋白進行定量分析。

1.9 生物信息學分析使用miRDB(http://mirdb.org/)、TargetScan7.1(https://www.targetscan.org/vert_71/)及mirDIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/)等數據庫對miR-151-3p下游靶基因進行預測,并使用String(http://string-db.org/)在線數據庫進行差異基因的PPI分析,篩選出關鍵靶基因。

2 結 果

2.1 EMS患者子宮內膜組織中miR-151-3p表達水平變化qRT-PCR 結果顯示,與對照組中miR-151-3P表達水平(1.02±0.17)相比,eEMS組(0.79±0.21)和nEMS組(0.62±0.15)均明顯降低(P<0.05);與eEMS組相比,nEMS組中miR-151-3P表達水平均明顯降低(P<0.05)。

2.2 轉染后各組ESCs細胞中miR-151-3p表達水平ESCs細胞分離培養,其鑒定結果顯示,人波形蛋白陽性細胞比率>95%,人角蛋白陽性細胞比率<5%,ESCs細胞分離培養成功。轉染結果顯示,與mimics NC組ESCs細胞中miR-151-3p表達水平(1.00±0.02)比較,miR-151-3p mimics組(3.62±0.29)顯著上升(P<0.05),而與inhibitors NC組ESCs細胞中miR-151-3p表達水平(0.99±0.09)比較,miR-151-3p inhibitors組(0.17±0.05)顯著降低(P<0.05),細胞轉染成功。

2.3 轉染后各組ESCs細胞增殖水平細胞培養24、48和72 h,增殖結果顯示,與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細胞增殖水平顯著降低(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,miR-151-3p inhibitors組ESCs細胞增殖水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖1 CCK-8檢測各組細胞增殖活性Figure 1 CCK-8 was used to detect cell proliferation activity in each group

2.4 miR-151-3p表達水平對ESCs細胞遷移和侵襲的影響Transwell實驗結果顯示,與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細胞遷移和侵襲細胞數顯著減少(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,miR-151-3pinhibitors組ESCs細胞遷移和侵襲細胞數顯著增加(P<0.05)。見圖2、圖3。

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細胞遷移情況;b:各組細胞遷移數目統計分析與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖2 Transwell實驗檢測各組細胞遷移情況Figure 2 Transwell assay was used to detect cell migration in each group

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細胞侵襲情況;b:各組細胞侵襲數目統計分析與mimics NC組比較:*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖3 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲情況Figure 3 Transwell assay was used to detect cell invasion in each group

2.5 miR-151-3p表達水平對ESCs細胞中MMPs和EMT相關蛋白表達的影響Western blot 檢測結果顯示,與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,miR-151-3pinhibitors組ESCs細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖4。與mimics NC組比較,miR-151-3p mimics組ESCs細胞中E-cadherin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),而與inhibitors NC組比較,E-cadherin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),miR-151-3pinhibitors組ESCs細胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖5。

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平;b:各組細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平定量分析與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖4 Western blot檢測各組細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平Figure 4 Western blot analysis of MMP-2 and MMP-9 protein expression levels in cells of each group

1:mimics NC組;2:miR-151-3p mimics組;3:inhibitors NC組;4:miR-151-3pinhibitors組a:各組細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平;b:各組細胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平定量分析與mimics NC組比較,*P<0.05;與inhibitors NC組比較,#P<0.05圖5 Western blot檢測各組細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平Figure 5 Western blot analysis of the expression levels of E-cadherin, N-cadherin and Vimentin in cells of each group

2.6 miR-151-3p靶基因的預測與分析通過miRDB、TargetScan7.1和mirDIP3大數據庫預測的miR-151-3p潛在靶基因分別有220、114和159個,其中三者交集有34個靶基因。隨后,使用String在線數據庫對交集靶基因進行PPI分析,篩選出RC3H1、AGO2、AGO3和FXR1等4個關鍵靶基因。見圖6。

a:在線數據庫預測miR-151-3p下游靶基因;b:PPI分析圖6 生物信息學篩選miR-151-3p下游靶基因Figure 6 Bioinformatics screening of downstream target genes of miR-151-3p3

3 討 論

EMS是育齡婦女的一種慢性疾病,其特點是子宮腔外子宮內膜樣組織異位生長,導致慢性盆腔疼痛和不孕,嚴重影響了患者的生活質量并給其帶來了很大的經濟負擔[3]。近年來,已報道多種miRNA在EMS中表達異常,并參與子宮內膜的異位植入及生長[9-10]。miR-151-3p參與多種人類腫瘤的發生、發展,其作為腫瘤抑制因子抑制前列腺癌細胞、結腸癌細胞和乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7,11-12]。本研究發現,miR-151-3p在EMS患者的eEMS組織和nEMS組織中均低表達,并且在nEMS組織中表達最低,這提示miR-151-3p的表達水平可能與EMS的發生、發展有關。

本研究通過分離培養ESCs細胞,將miR-151-3p mimics和miR-151-3p inhibitors轉染ESCs細胞,進一步研究miR-151-3p對ESCs細胞增殖、侵襲與遷移的影響。miR-151-3p過表達明顯抑制ESCs細胞的增殖活性,降低細胞的侵襲和遷移能力;而抑制miR-151-3p表達明顯增強ESCs細胞的增殖活性,促進細胞的侵襲和遷移。結果提示,miR-151-3p可能通過影響ESCs細胞增殖、侵襲與遷移來參與EMS的進展。

EMS是一種炎癥性疾病,而炎癥的標志是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的過度激活。MMPs作為一類蛋白水解酶,可分解細胞外基質(extracellular matrix, ECM),并在生理或病理條件下觸發ECM重塑過程。MMPs通過降解ECM促進細胞遷移和侵襲,并廣泛參與血管重塑,從而促進子宮內膜細胞異位植入和EMS形成。此外研究報道,MMP-2和MMP-9在EMS患者病變組織和患者的在位子宮內膜中表達上調[13]。本研究發現,miR-151-3p過表達顯著降低ESCs細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平;而抑制miR-151-3p表達顯著升高ESCs細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平。

EMT是上皮細胞轉變成間質表型的生物學過程,在此過程中上皮細胞獲得遷移、侵襲和重新定位的能力,其異常激活是腫瘤侵襲和轉移等病理過程的關鍵因素[8,14-15]。研究報道,EMT現象普遍存在于EMS病變中,并在子宮內膜細胞異位植入中發揮重要作用[16]。本研究發現,miR-151-3p過表達明顯上調ESCs細胞中E-cadherin蛋白表達水平,降低N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平;而抑制miR-151-3p表達明顯降低ESCs細胞中E-cadherin蛋白表達水平,上調N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平。結果提示,miR-151-3p可能通過影響MMPs和EMT進而影響ESCs細胞的侵襲與遷移。

本研究基于在線miRNA靶基因預測網站對miR-151-3p下游靶基因進行預測,并結合PPI分析篩選關鍵靶基因,得到RC3H1、AGO2、AGO3和FXR1這4個關鍵靶基因。經查閱文獻,Huang等[17]報道,LncRNA SNHG11通過調節hsa-miR-184/AGO2促進肝癌細胞的增殖與遷移;Pan等[18]研究顯示,AGO3通過調節Wnt/β-catenin信號通路促進宮頸癌細胞的遷移與侵襲;Cao等[19]研究發現,FXR1通過調節FBXO4影響前列腺癌細胞的遷移與侵襲。因此,miR-151-3p是否通過這些關鍵靶基因影響ESCs細胞的遷移和侵襲還有待于后期研究。

綜上所述,miR-151-3p在EMS患者的eEMS組織和nEMS組織中均低表達,并且在nEMS組織中表達最低。過表達miR-151-3p可以抑制ESCs細胞的遷移和侵襲。這提示miR-151-3p可能為EMS治療提供新的思路。