HPLC測定驅蟲藥中二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的含量

劉冠麟,姜淋潔,王 建,楊孝君,馬吉飛

(1.天津農學院動物科學與動物醫學學院,天津 300380;2.天津市中升挑戰生物科技有限公司,天津 300080)

二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑是一種用于治療預防動物體外寄生蟲病的復方藥物,直接涂抹在動物脊柱皮膚上,有效抵抗犬體表蚤、蜱、虱的寄生,抑制白蛉、廄蠅和蚊子的叮咬,輔助治療過敏性皮炎[1],其中有效殺蟲成分是二氯苯醚菊酯和吡蟲啉,藥物通過昆蟲吸食給藥動物血液進入蟲體,干擾神經離子通道,從而達到殺蟲作用,持續驅蟲效果長達28 d[2-7]。

目前德國拜爾公司已上市的驅蟲類產品除了拜寵爽(滴劑),還有愛沃克(滴劑)、旺滴靜(滴劑)、索來多(項圈),主要成分為吡蟲啉和其他殺蟲藥。近年來,國內已有此類殺蟲滴劑仿制藥的項目開發,經查閱文獻,僅有檢測農藥中二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的方法[8-15],但作為獸用驅蟲藥的含量測定方法目前鮮見相關研究報道,因此該研究建立一種高效液相色譜法(HPLC)同時檢測二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑中二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的含量方法,為二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑的質量控制提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑二氯苯醚菊酯對照品(G1050294,99.73%,Dr.Ehrenstorfer);吡蟲啉對照品(G988243,98.55%,Dr.Ehrenstorfer);二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑(批號202204003、202204004、202204005,天津市中升挑戰生物科技有限公司);甲酸銨(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);乙腈(色譜純,天津市川普偉業科技有限公司);甲酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);超純水。

1.2 儀器安捷倫1260Ⅱ高效液相色譜儀,包括G7111A四元泵、G7129A自動進樣器、AT-330柱溫箱、G7115A DAD檢測器、C.01.07 SR2(255)色譜工作站,美國安捷倫科技有限公司;ES225SM-DR電子天平,普利賽斯儀器有限公司;超聲波清洗器,昆山儀器有限公司;真空泵,ASL儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1色譜條件。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(X-Terra C18,100 mm×4.6 mm,3.5 μm,批號02403032213653);以0.05 mol/L甲酸銨溶液(用甲酸調pH至4.5)作為流動相A,乙腈作為流動相B;按表1進行梯度洗脫;柱溫為35 ℃;檢測波長為235 nm;進樣量為5 μL。

表1 流動相洗脫梯度Table 1 Mobile phase gradient elution

1.3.2溶液的制備。

1.3.2.1對照儲備液。電子天平精密稱定吡蟲啉對照品100 mg,用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定容至25 mL,搖勻,配制成濃度為4.0 mg/mL吡蟲啉溶液,作為吡蟲啉對照儲備液;電子天平精密稱定二氯苯醚菊酯對照品500 mg,用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定容至50 mL,搖勻,配制成10 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液,作為二氯苯醚菊酯對照儲備液。

1.3.2.2對照品溶液。精密移取“1.3.2.1”吡蟲啉對照儲備液1 mL,用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定容至10 mL,搖勻,配制成濃度為0.4 mg/mL吡蟲啉溶液,作為吡蟲啉對照溶液備用;精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯對照儲備液2 mL,用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定容至10 mL,搖勻,配制成2.0 mg/mL二氯苯醚菊酯溶液,作為二氯苯醚菊酯對照溶液備用。

1.3.2.3供試品溶液。由于藥品溶液黏稠存在掛壁現象,不適宜使用移液槍,故采用質量稱定移取。精密稱定二氯苯醚菊酯和吡蟲啉滴劑120 mg,用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定至25 mL,搖勻,作為供試品溶液備用。

1.3.2.4空白對照溶液。精密稱定不含二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的空白制劑120 mg,用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定容至25 mL,作為空白對照溶液備用。

1.3.3專屬性試驗。按照“1.3.2”方法分別配制吡蟲啉對照品溶液、二氯苯醚菊酯對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液,按照“1.3.1”色譜條件分別進樣高效液相色譜儀,記錄色譜圖。

1.3.4精密度試驗。按照“1.3.2”方法分別配制2種對照品溶液、6份供試品平行溶液,按照“1.3.1”色譜條件分別進樣,記錄色譜峰面積。

1.3.5穩定性試驗。按照“1.3.2”方法配制2種對照品溶液、6份相同濃度滴劑供試品平行溶液,分別放置0、1、4、8、16、24 h后,按照“1.3.1”色譜條件分別進樣,記錄色譜峰面積。

1.3.6線性關系確定。

1.3.6.1二氯苯醚菊酯線性關系。精密移取“1.3.2.1”二氯苯醚菊酯對照儲備液4.0、5.0、6.0、7.5、9.0 mL用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定容至20 mL,按照“1.3.1”色譜條件分別進樣,記錄色譜峰面積,并以峰面積為y軸、進樣濃度為x軸繪制標準曲線。

1.3.6.2吡蟲啉線性關系。精密移取“1.3.2.1”吡蟲啉對照儲備液3、4、5、6、7 mL用流動相A-流動相B(10∶90)混合溶液定容至50 mL,按照“1.3.1”色譜條件分別進樣,記錄色譜峰面積,并以峰面積為y軸、進樣濃度為x軸繪制標準曲線。

1.3.7加樣回收率試驗。分別移取適量“1.3.2.1”項對照儲備液置25 mL容量瓶中,稀釋定容為80%加樣回收溶液(4 mL二氯苯醚菊酯+2 mL吡蟲啉)、100%加樣回收溶液(5 mL二氯苯醚菊酯+2.5 mL吡蟲啉)、120%加樣回收溶液(6 mL二氯苯醚菊酯+3 mL吡蟲啉),備用,按照“1.3.1”色譜條件分別進樣,記錄色譜峰面積,計算加樣回收率。

1.3.8定量限和檢測限。移取“1.3.2.2”項中2種主藥對照品溶液,逐步稀釋,連續進樣6次,記錄二氯苯醚菊酯和吡蟲啉信噪比平均數,以信噪比S/N為3時對應的濃度為檢測限(LOD);以信噪比S/N為10時對應的濃度為定量限(LOQ)。

1.3.9耐用性試驗。移取“1.3.2”項對照品溶液和供試品溶液各1份,供試品選用批號202204003樣品,在“1.3.1”色譜條件下,通過改變流速(±5%)、柱溫(±5 ℃)、流動相A 酸度(pH±0.2),換用不同批號的色譜柱(批號02403032213653、02413128113605),記錄各個條件下主峰的分離情況。

1.3.10樣品含量測定。移取“1.3.2.2”項對照品溶液,另選取3批不同批號(202204003、202204004、202204005)二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑樣品,溶解稀釋,按照“1.3.1”色譜條件進樣2次,記錄色譜峰面積,并采用外標法計算樣品中2種藥效成分含量結果。

2 結果與分析

2.1 專屬性試驗從吡蟲啉對照品、二氯苯醚菊酯對照品、供試品、空白對照色譜圖(圖1)可以看出,吡蟲啉出峰時間在2.5～3.0 min,二氯苯醚菊酯順反異構體出峰時間在14～16 min,供試品與對照品出峰時間一致,且空白對照無主峰出現對含量測定無干擾,說明該色譜條件下專屬性良好。

2.2 精密度試驗精密度試驗結果表明,二氯苯醚菊酯平均峰面積為10 763.4,RSD為0.17%,吡蟲啉平均峰面積為5 936.7,RSD為0.52%,峰面積RSD均小于2%,表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗穩定性試驗結果表明(表2),二氯苯醚菊酯平均峰面積為13 310.8,RSD為0.89%;吡蟲啉平均峰面積為7 342.6,RSD為0.85%,2種主藥成分峰面積RSD均小于1.00%,表明溶液穩定性良好。

2.4 線性關系從圖2可以看出,二氯苯醚菊酯線性方程為y=6 030x-79.36(R2=0.999 8),表明二氯苯醚菊酯對照品溶液濃度在1.209 8～2.822 8 mg/mL時與峰面積線性關系良好;吡蟲啉線性方程為y=15 746x+24.61(R2=1.000 0),表明吡蟲啉對照品溶液濃度在0.237 5～0.554 2 mg/mL時與峰面積線性關系良好。

2.5 加樣回收率從表3可以看出,二氯苯醚菊酯平均回收率為99.84%,吡蟲啉平均回收率為100.33%,2種主藥成分回收率RSD均小于1.00%,表明該方法準確性良好。

2.6 定量限和檢測限試驗結果表明,當S/N=10時,二氯苯醚菊酯濃度為2.447 μg/mL,吡蟲啉濃度為0.082 μg/mL;當S/N=3時,二氯苯醚菊酯濃度為0.733 μg/mL,吡蟲啉濃度為0.029 μg/mL。

2.7 耐用性試驗按“1.3.9”方法操作,結果如表4所示,在各個條件下,主峰與各雜質峰均能分離,且二氯苯醚菊酯、吡蟲啉含量的RSD均小于2.00%,試驗結果說明流動相酸度、柱溫、流速及不同批次色譜柱對含量檢測無明顯影響,表明該方法耐用性良好。

注:a、b、c、d分別為吡蟲啉對照品、二氯苯醚菊酯對照品、供試品、空白對照。Note:a,b,c and d refer to imidacloprid reference substance,permethrin reference substance,test substance,and blank control,respectively.圖1 專屬性試驗色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of specific test

表2 穩定性試驗結果

圖2 二氯苯醚菊酯(a)、吡蟲啉(b)標準曲線Fig.2 Standard curves of permethrin (a) and imidacloprid (b)

2.8 樣品含量測定經測定(表5),3批不同批號二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑樣品中二氯苯醚菊酯和吡蟲啉這2種藥效成分含量分別為98.88%～100.80%、99.59%～100.89%,平均值分別為99.83%、100.12%,表明檢測結果符合標準規定(95.0%～105.0%)。

3 討論

經查閱文獻,目前關于二氯苯醚菊酯和吡蟲啉這2種藥品的檢測僅局限于農藥[16-22],未見獸藥制劑的含量檢測,該研究對比多位國內外學者建立的二氯苯醚菊酯和吡蟲啉的測定方法,結合二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑的藥物性狀對檢測方法進行了優化,以求同時檢測2種藥品含量,建立了一種獸藥制劑的HPLC檢測方法。

以往的文獻資料中[16-22],HPLC法檢測二氯苯醚菊酯和吡蟲啉含量色譜條件選用的流動相大多是高比例乙腈-水、甲醇-水,預試驗中使用高比例甲醇-水和乙腈-水作為流動相峰形并不理想,所以該研究選用0.05 mol/L甲酸銨-乙腈溶液作為流動相,甲酸銨作為離子緩沖劑,有利于改善峰形,提高積分準確度,調節pH至4.5可以使出峰時間提前。另外,設置梯度洗脫可以有效防止二氯苯醚菊酯對吡蟲啉出峰的干擾,以便更好地收集數據。在檢測波長的選擇時,Waleng等[23]檢測吡蟲啉時波長為268 nm,吳國旭等[24]研究發現2種主藥的紫外最大吸收波長分別為吡蟲啉270 nm、菊酯類225 nm,在預試驗中檢測到吡蟲啉紫外最大吸收波長為270 nm,二氯苯醚菊酯最大吸收波長為210 nm,為了避免檢測波長趨近于紫外最大吸收波長,兼顧2種成分最終確定235 nm為檢測器適宜波長,已達到同時檢測的目的。

表3 回收率考察結果Table 3 Recovery rate inspection results

表4 耐用性試驗結果Table 4 Durability test results 單位:%

表5 樣品含量測定Table 5 Sample content determination 單位:%

由于二氯苯醚菊酯和吡蟲啉這2種主藥都易溶于極性有機溶劑,國內外學者使用乙腈或甲醇稀釋[16-26],為了提高分離度,減少傳質阻抗,提高分離塔板數,該研究采用流動相和乙腈混合溶液作為稀釋劑,可以使峰形尖銳對稱,出峰時間穩定。

4 結論

該研究建立了同時檢測二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑中2種藥效成分的分析方法,分別對其專屬性、精密度、穩定性、線性關系、加樣回收率、方法耐用性和含量測定進行了方法學試驗,結果良好,2種主藥含量平均值分別為99.83%和100.12%,符合檢測標準。綜上,該方法適用于二氯苯醚菊酯吡蟲啉滴劑藥效成分的含量檢測,為新型獸藥驅蟲劑產品質量標準提供參考。