柞蠶微粒子病集團磨蛾鏡檢試驗初探

赫英姿 于庭洪 賈 姝 趙 翀 左玲玲 宋 策

(遼寧省蠶業科學研究所,遼寧鳳城 118100)

柞蠶微粒子病是柞蠶的主要傳染性病害之一,用光學顯微鏡檢查微孢子蟲仍然是生產上較為直接的診斷方法。針對我國人口老齡化導致用工荒加劇和目前柞蠶繁種地區北移使得種繭微孢子蟲感染比例降低的現狀[1-2],柞蠶集團母蛾鏡檢提上日程。不同于桑蠶集團母蛾鏡檢,桑蠶滯育后為集團母蛾鏡檢預留了時間,而柞蠶集團母蛾鏡檢需要當日完成。為了提高檢出率,對研磨液進行離心處理,而離心后鏡檢檢出率與不離心相比有無差別,尤其是與純凈孢子液(清水稀釋液)相比,脂肪細胞的大量存在是否影響微孢子蟲的檢出率,是此項工作需要探討的問題。為此進行了以下技術處理方法試驗。

1 材料與方法

1.1 供試材料

柞蠶微孢子蟲由患病柞蠶母蛾中分離提取,制成純孢子懸浮液,計數后貯存于4 ℃冰箱中備用,常規鏡檢無銹母蛾若干。

普通血球計數板一塊;TD-4低速臺式離心機一臺,由江陰保利器械有限公司生產。

1.2 試驗方法

鏡檢方法分為常規鏡檢和離心鏡檢,以上檢查均是在光學顯微鏡(640倍)下觀察、統計;離心采用3 000 r/min轉3 min。

稀釋液分為清水、90%清水+10%蛾脂肪(水和脂肪按照體積比混合)兩種。

用血球計數板測出孢子懸浮液濃度為1×108個/mL,根據經驗配制了1×106個/mL、1×105個/mL、9×104個/mL、1×104個/mL、1×103個/mL、1×102個/mL幾個濃度的溶液,鏡檢每片取樣量為20 μL。

1.3 調查方法

鏡檢結果分為5個視野可見微孢子蟲和6-10個視野可見微孢子蟲兩種,每處理3次重復。每次鏡檢凡看到微孢子蟲無論數量多少記為1、未見到微孢子蟲記為0,以幾率值計算。

2 結果與分析

2.1 常規鏡檢

2.1.1 稀釋液為清水的各個濃度微孢子蟲檢出率

當稀釋液為清水時,視野里比較純凈,微孢子蟲形態易于識別,只要有孢子出現就能看到,不容易漏檢。缺點是捕捉視野比較困難。1×105個/mL濃度是個比較臨界的濃度,前5個視野能檢出孢子是生產上十分必要的環節,當低于這個濃度時,極易造成漏檢。具體見表1。

表1 稀釋液為清水時微孢子蟲檢出情況

2.1.2 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪各個濃度微孢子蟲檢出率

根據表1結果,在稀釋液中加入10%蛾脂肪,有了脂肪球,視野捕捉容易,但是視野清晰度會變差,在檢出臨界點濃度1×105個/mL上,即每個視野能見到一個孢子,脂肪球等的干擾會影響檢出率。具體如表2。

表2 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪時微孢子蟲檢出情況

2.2 離心處理后鏡檢

2.2.1 稀釋液為清水時離心沉淀各個濃度微孢子蟲檢出率

將含有一定量微孢子蟲的液體離心沉淀,當稀釋液為清水時,1×104個/mL處理濃度,離心沉淀3個重復前5個視野均檢出孢子;1×103個/mL處理中有兩個重復前5個視野檢出孢子,另外一個重復中前10個視野檢出孢子;1×102個/mL處理全部視野檢不出孢子。具體見表3。

表3 清水稀釋液離心沉淀后微孢子蟲檢出情況

表3結果表明,當孢子濃度低至1×104/(個/mL)且稀釋液為清水時,通過離心富集的方法,可以很容易檢出孢子,但當孢子濃度進一步低時,達到100個/mL,離心仍未檢測出孢子。

2.2.2 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪離心沉淀各個濃度微孢子蟲檢出率

當稀釋液為清水+脂肪時,離心沉淀由于脂肪球的密集干擾,鏡下視野觀察較清水稀釋液困難,1×104/(個/mL)、1×103/(個/mL)都僅有1個重復前5個視野檢出孢子,1個重復10個視野檢出孢子,1個重復始終沒檢出孢子;但同時由于有脂肪球的指示作用,捕捉視野較清水稀釋液容易,因此1×102/(個/mL)處理中1個重復前5個視野檢出孢子,但另外兩個重復始終檢不出孢子。具體見表4。

表4 稀釋液為90%清水+10%蛾脂肪離心沉淀后微孢子蟲檢出情況

3 討 論

3.1 柞蠶微粒子病由于胚種傳染的特點使其成為生產中毀滅性的傳染性病害,為避免其危害,研發出了免疫學和分子生物學等具有很高的靈敏度檢測技術,即使樣品中微孢子蟲濃度為1×102個/mL,檢出率仍達到90%,但當樣品為感染微粒子病病蛾時,這些檢測技術的靈敏度大幅下降[3]。顯微鏡檢測母蛾技術在孢子檢出率上要求樣品中孢子達到一定濃度方可檢出,劉仁華等人[4]指出1×104個/mL是集團母蛾鏡檢是否檢出的濃度臨界值,低于這個濃度檢出概率為0～1,高于這個濃度檢出概率為1。那么,在柞蠶生產中,新鮮母蛾脂肪干擾前提下,集團母蛾鏡檢的檢出率怎樣,是否還遵循上面的規律,還需要試驗驗證。

3.2 本次試驗通過比較稀釋液中有無鮮蛾脂肪球,發現鮮蛾脂肪球的存在會影響孢子的檢出率。光學顯微鏡下當孢子濃度為1×105個/mL左右時,在清水稀釋液純凈孢子中,10個視野3個重復均檢出孢子,加入10%蛾脂肪后,檢出率會變差,全部10個視野有一個重復始終未檢出孢子;當孢子濃度為9×104個/mL時,稀釋液無論有無脂肪球干擾,都只有一個重復全部10個視野觀察到孢子,且數量僅為1個;當孢子濃度為1×104個/mL時,稀釋液無論有無脂肪球,都觀察不到孢子。通過離心極大提高孢子的檢出率,即使孢子濃度低至1×103個/mL時,清水稀釋液全部10個視野均能檢出孢子,當加入了蛾脂肪球后,離心處理后微孢子蟲檢出率也有所下降,前5個視野檢出概率較清水低,且全部10個視野有一個重復始終檢不出孢子。

3.3 柞蠶集團母蛾鏡檢是微粒子病檢驗檢疫技術發展的必然趨勢,本次集團母蛾檢驗試驗過程中發現:與傳統的顯微鏡母蛾檢查相比,樣品制作要求蘸取沉淀的量要適當,且要一個樣品制作多個片子,逐漸稀釋脂肪利于觀察;顯微鏡檢查時觀測的視野數量要多,細致程度要高,至少觀察10個視野,不能一帶而過。這一點與家蠶集團母蛾鏡檢的要求相一致[5]。

3.4 家蠶集團檢驗中為提高檢出率,磨蛾通常使用0.5%K2CO3作為研磨液[6],秦利等指出在卵及蟻蠶整體取樣檢驗時,可加入1%KOH或NaOH研磨[7]制成臨時標本進行檢查。生產中柞蠶集團研磨是否應使用堿液作為研磨液,以及使用的濃度和方法,今后還需要進一步試驗。