天然產物應用于蜜蜂病毒病防控的研究進展

黃知楚，劉 瑤，周倪紅，黃 倫，鄭火青

（1.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058；2.四川省甘孜州蜂業管理站，四川 甘孜 626000）

1 前言

蜜蜂是重要的經濟昆蟲，也是現代農業中最具經濟價值的傳粉者，約1/3 的農作物依賴于蜜蜂授粉，其授粉服務使世界各地的農作物增值約9.5%[1]。蜂產業的健康發展不僅關系著蜂產品的產量和質量、農作物的增產效益，也關系著生物多樣性維護和生態系統平衡。

盡管世界糧農組織統計數據表明近幾十年來全球蜂群總數增長了45%[2]，但其授粉服務仍不能滿足日益增長的世界人口數量和糧食產量需求[3]。蜜蜂面臨各種生物因素與非生物因素的侵擾，每年仍有大量蜂群損失[4]。引起蜂群損失的因素是雙重的。在蜂群內部，蜜蜂面臨營養水平失衡[5]、蜂王生育性能下降[6]等挑戰，高密度的飼養管理模式下的蜜蜂也極易遭受細菌、真菌、病毒等病原體感染和寄生蟲侵擾[7,8]；在蜂群外部，氣候和環境變化[9]、農業中化學藥物的使用[10]、覓食地的減少與越冬損失[11]等都是影響蜂群健康的重要因素。

在前述眾多因素中，蜜蜂病毒感染很常見但又是在養殖過程中容易被忽視的問題。因為蜜蜂病毒具有極強的隱蔽性，以低濃度的隱性方式感染蜜蜂，只有少數病毒能夠產生可鑒別的臨床癥狀，難以引起養蜂人的重視。目前有二十多種蜜蜂病毒被分離鑒定并廣泛分布于世界各地的蜂群中，其中7 種病毒在蜂群中高度流行，分別是殘翅病毒（D eform ed W ing V irus,D W V）、急性蜜蜂麻痹病毒（A cute Bee Paralysis V irus, A BPV）、 囊 狀 幼 蟲 病 毒（Sacbrood Bee V irus,SBV）、黑蜂王臺病毒（Black Q ueen CellV irus,BQ CV）、以色列急性麻痹病毒（IsraeliA cute Paralysis V irus,IA PV）、慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic Bee Paralysis V irus,CBPV） 和克什米爾病毒（K ashm ir Bee V irus,K BV）。大多數種類蜜蜂病毒的遺傳物質為正義單鏈R N A，歸屬仿小核糖核酸病毒目（Picorna-likevirus），僅有蜜蜂絲狀病毒（A pis M elliferaFilam entous V irus,A m FV） 和蜜蜂虹彩病毒（A pis iridescentvirus,A IV） 是D N A 病毒。近年來，隨著高通量測序技術與生物信息學的發展，又有越來越多的病毒從世界各地的蜂群中被發現，其中還包括一些負義單鏈R N A 和雙鏈R N A 病毒[12,13]。病毒通過食源性傳播、性傳播以及媒介傳播等水平途徑在同一代不同個體間傳播，或以垂直傳播方式借助蜜蜂的繁育行為從親代傳遞到子代[14]。蜜蜂病毒的宿主非常廣泛，并不僅限于蜜蜂種群內，有些病毒能夠在其他膜翅目甚至非膜翅目的節肢動物中檢測到[15]。

蜜蜂并非對病毒疾病沒有抵抗力[16]，在長期進化和自然選擇過程中也形成了與其周圍環境相適應的形態結構和生活方式，具備了一套完善的防御體系以保護自身安全。在個體層面，蜜蜂通過Toll、Im d、JN K 和JA K/STA T 4 條主要的先天免疫通路調控神經、內分泌及免疫系統維持機體平衡[17]；而在群體層面，蜜蜂會更多地收集儲存植物的花蜜、花粉和樹脂（蜂膠），并采食其中特定的植物化學物質，以此作為減少蜂群病原體負荷的一種手段[18-22]。

而在一些特定條件下，在蜜蜂病毒寄主體細胞內大量復制，感染程度超過蜂群可調節能力范圍時，即可表現出強烈的致病性，從而引發致死性蜜蜂病毒病的流行與爆發。由于病毒利用宿主細胞進行繁殖和存活，目前還沒有研發出能夠殺滅病毒而不影響蜜蜂生理的特效療法。同時，蜂群中藥物的使用給蜂產品質量安全帶來很大風險，因此，在科研和生產實踐中，人們期望尋求一種溫和、安全且可長期使用的藥物以提高蜜蜂對病毒的抵抗力并延長蜜蜂壽命，天然產物補充劑在蜂群疾病防控中的需求由此應運而生。

2 天然產物

天然產物，也稱次級代謝產物，是指動物、植物或微生物等天然來源的具有藥理學或生物學活性的化合物或其代謝產物[23]。與生物體生長發育所必需的初級代謝產物不同，天然產物化學結構復雜，且僅出現在特定的物種、器官、組織或細胞中。天然產物對自身無具體的生理功能，主要作用是為生物體帶來某種形式的保護和益處，協助生物體適應復雜的生態環境，如作為引誘劑、驅避劑、拒食劑和抗生物質等，調節與其他生物體的相互作用，從而有利于其生存[24,25]。

天然產物來源廣泛，結構類型多樣，可通過已知結構的天然產物進行化學合成和結構改造，或通過代謝工程等途徑生產，但最直接的獲取途徑仍是從生物體中提取分離。我國是植物資源大國，對中草藥利用歷史悠久，極大地推動了天然植物提取物行業的發展，植物來源的天然產物資源尤其豐富。

3 天然產物與蜜蜂病毒病的防控

植物來源的天然產物也是蜜蜂最常接觸到的天然產物種類。在沒有人工管理的野外條件下，植物花蜜和花粉是蜜蜂唯一的碳水化合物和蛋白質食物來源，蜜蜂通過采食富含天然產物的花蜜和花粉維持蜂群運轉，根據植物中天然產物的濃度相應地改變自己的覓食行為，在寄生蟲和疾病入侵時通過增加采集減少蜂群病原體負荷[26]。植物天然產物對蜂群幾種主要病毒病的防控效果將在下文進行分類闡述。

3.1 殘翅病毒（D W V）

D W V 是世界范圍內蜜蜂感染最普遍的傳染性軟腐病毒科（Iflaviridae） 病毒，于1977年在埃及從無癥狀的蜜蜂中分離出來。D W V最初感染西方蜜蜂蜂群時滴度低、致病力弱、危害小，沒有引起重視。而狄斯瓦螨在全世界西方蜜蜂蜂群廣泛傳播后，改變了D W V 流行程度及其多樣性，成為D W V 最主要的傳播媒介[27]。D W V 對不同性別和發育階段的蜜蜂均有影響，發病成蜂的典型癥狀包括翅殘缺或畸形、腹部萎縮、體色變暗且失去飛行能力，隱性感染D W V 的蜜蜂即使無發病癥狀也會導致壽命縮短。

Y oung 等人[28]測試了蜂群短期攝入7 種天然產物后對健康與免疫的影響，所有被測的天然產物都表現出對蜜蜂健康有益的方面，其中百里酚、地黃梓醇和尼古丁顯著降低了蜜蜂D W V 的感染水平，上調了Im d 和Toll通路調控的抗菌肽基因表達，增強了蜜蜂免疫。Parekh 等人[29]后續在實驗室條件下也證明了百里酚能夠降低D W V 豐度，上調與免疫相關的關鍵R N A i基因、抗菌肽基因、卵黃蛋白原基因的表達，同時在一定程度上緩解了煙曲霉素和新煙堿農藥對蜂群的負面作用?？嘈尤受帐谴嬖谟谠S多植物中的一種氰苷，水解后產生的氫氰酸毒性可致人或動物死亡，但蜜蜂對杏仁苷有較高的耐受性[30,31]，且攝入杏仁苷的蜜蜂在不影響其他微生物和群體免疫基因表達的情況下還能降低D W V 的病毒滴度[32]。Stam ets等人[33]觀察到蜜蜂采食野生菌菇的現象，結合真菌提取物的抗病毒活性[34-36]，通過實驗發現蜜蜂攝入某些多孔菌菇提取物對D W V 具有抑制作用。

對D W V 的防控除了直接針對病毒自身以外，還可以通過防治狄斯瓦螨間接減少病毒載量。含有高濃度百里酚的百里香精油被證明具有良好的殺螨活性[37]，以百里酚為主要成分的天然殺螨劑產品如A piLife V ar、Thym ovar 和A piguard 等已被證明在生產實踐中具有較好的防控效果，可顯著降低蜂群內成年工蜂的瓦螨感染率[38-44]。

3.2 囊狀幼蟲病毒（S B V）

SBV 是首個發現的蜜蜂病毒，20 世紀30～40 年代在西方蜜蜂蜂群中爆發流行，造成了嚴重的經濟損失，但現在西方蜜蜂已進化出對SBV 較強的抗性，很少引起疾病或蜂群損失。1972 年首例SBV 感染中蜂在廣東被報道[45]，此后逐漸成為中蜂的主要致病病原。感染SBV的幼蟲包被特征性的液體囊袋，無法化蛹，封蓋后死亡率大大增加[46]。成蜂感染SBV 后采集能力下降或喪失，壽命縮短，對低溫更加敏感。春、秋季節是囊狀幼蟲病發生的高峰期，被污染的蜂蜜、花粉飼料和攜帶病毒的個體是主要傳染源[47]。

中草藥治療是我國中蜂養殖業中對抗SBV的常用方法。具有清熱解毒功效的中草藥在民間應用廣泛，鄧位喜等人[48]搜集了民間用于SBV 防治的中草藥組方并加以改進，篩選出包括貫眾、虎杖、千里光、金銀花、半枝蓮、地錦草、一枝黃花、板藍根等的中草藥復方“中囊消”組方。孫麗萍等人[49]進一步證明了板藍根提取物可以抑制SBV 復制，調節蜜蜂免疫應答，提高感染SBV 蜜蜂的存活率。Jovanovic等人[50]認為給蜜蜂喂食富含復合維生素B 的植物補充劑能夠減少SBV 病毒負荷，改善蜜蜂健康，提高蜂群的生產性能。

3.3 黑蜂王臺病毒（B Q C V）

BQ CV 最初從死亡的蜂王幼蟲和封蓋王臺的預蛹中分離而來[51,52]。雖然BQ CV 在蜂群中傳播廣泛，但對普通工蜂和雄蜂沒有太大影響[53]，主要對王臺中的幼蟲產生危害。感染BQ CV 的蜂王在發育過程中死亡，形成一個類似于囊狀幼蟲病的硬質囊，其壞死的殘余物將王臺內壁染成黑色。BQ CV 主要通過蜂王產卵或蜜蜂交哺行為進行傳播，感染的主要部位是蜜蜂的腸道或蜂王卵巢[14]，因此BQ CV 與蜜蜂腸道真菌寄生蟲微孢子蟲共同感染時會產生極強的致病性[54]，亞致死劑量的農藥也會導致BQ CV 滴度和死亡率增加[55,56]。

由于BQ CV 主要危害蜂王，而蜂王又在蜂群中處于獨特地位，有關天然產物對BQ CV 或蜂王直接作用的研究較少，更多的研究集中在與其高度關聯的微孢子蟲防控上，目前市面上已經有較多此類天然產物補充劑產品，如以大蒜和肉桂提取物為主要成分的A piH erb○R[57]、富含蘆丁、槲皮素和桉葉腦的Protofil○R[58]等。Chaim anee[59]和O zk1r1m[60]等人分別研究了番荔枝、羅勒、番石榴、蒲桃和小酸模、西洋蓍草、車前草、丹參、百里香、迷迭香、月桂等植物提取物對微孢子蟲的藥效，結果表明這些物質的效果均與煙曲霉素相似甚至更優。A urori等人[61]試驗中單獨證明了月桂葉提取物在不影響卵黃蛋白原基因表達的情況下可以抑制工蜂體內BQ CV 的復制。

3.4 以色列急性麻痹病毒（IA P V）

IA PV 屬雙順反子病毒科（D icistroviridae）病毒[62]，發病癥狀與A BPV 相似，表現為染病的成年工蜂體色變暗，絨毛脫落，伴隨翅震顫麻痹癥狀，失去飛行能力，離巢后快速死亡。IA PV 的生物學特性和序列同源性與A BPV 和K BV 非常相近[63,64]。IA PV 于2004 年才在以色列被發現[65]，但因其在崩潰失調癥（Colony Collapse D isorder，CCD） 蜂群中的流行，一經發現就引起廣泛關注。CCD 蜂群的典型特征是成年工蜂短時間內突然消失，蜂巢內外找不到蜜蜂尸體，蜂巢中僅剩下蜂王、卵、幼蟲和少量新出房工蜂[66]。CCD 爆發期間，美國約有23% 的蜂場受其影響，導致了近50% 的授粉服務和蜂產品損失[67]。宏基因組學數據顯示IA PV 與CCD 蜂群之間的相關性高于其他可能的病原體，IA PV 序列在CCD 蜂群中的普遍存在，以及二者在時間和地理上的重疊都表明IA PV 與CCD 有密切相關性[68]，但IA PV 與CCD 的因果關系沒有得到廣泛認同。

H sieh 等人發現感染IA PV 的蜜蜂攝入1.5×10-5（植物源常見的自然濃度） 的咖啡因可以顯著提高其存活率[69]?？Х纫蚴欠植甲顝V泛的植物次生代謝物之一[70,71]，蜜蜂在實驗室里對含有咖啡因的蔗糖溶液表現出偏好性[72,73]，攝入咖啡因有助于提高蜜蜂對新事物的認知能力，鞏固已習得的嗅覺記憶[74-76]，緩解新煙堿類殺蟲劑誘導的氧化應激[77]。野外條件下受咖啡因刺激的蜜蜂舞蹈頻率增加，極大地提高覓食效率[78]。對香豆酸可以特異性上調蜜蜂p450家族基因[79]和抗菌肽基因[80]的表達，觸發解毒機制，調節免疫功能[81]。雖然在H sieh 等的試驗中對香豆酸沒有表現出對IA PV 顯著的作用效果[69]，但先前的研究表明對香豆酸能夠抑制人類鼻病毒rhinovirus 的復制[82]，該病毒和IA PV 一樣同屬小核糖核酸病毒目，因此對香豆酸仍是未來防治IA PV 的潛力物質。由于瓦螨也是IA PV 的病毒載體，因此對瓦螨具有防治作用的物質在生產實踐中也可應用于IA PV的防控。

4 小結與展望

綜上所述，天然產物在蜂群幾種主要病毒病防控中表現出了很好的應用潛力。但由于病毒結構復雜、變異迅速，天然產物種類繁多，二者產生的抗性機制、生理益處等作用原理尚不完全清楚。因此仍需要漫長的研究過程，未來有潛力的研究方向可能在以下方面。首先，病毒感染對蜜蜂覓食行為的影響，尤其對可能有“療效”植物產品的偏好性；其次，天然產物對蜜蜂病毒的作用機制和原理，參考人體和其他動物模型中天然產物的作用機制以及病毒結構的相似性進行推導和試驗驗證；第三，天然產物的組合應用，利用化合物間的拮抗與協同作用發揮天然產物的最佳效益；最后，完成實驗室成果到田間試驗再到生產實踐的應用與推廣。以上研究將極大地提高人們對“天然產物- 蜜蜂- 病毒”關系網絡重要性的理解，維護蜂產品的質量安全與蜜蜂授粉服務，促進蜂產業的健康發展，對于人類健康和生態環境保護也具有重要意義。