1 株產單寧酶戊糖片球菌的篩選及功能評價

池耀卿，盧海強，王衛正，毛若雨，田洪濤，谷新晰

(1.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北斐默特生物科技有限公司，河北石家莊 052460；3.中國農業科學院 飼料所，北京 10081)

單寧是一類天然多酚物質，廣泛存在柿子、葡萄及山楂等水果中。單寧具有較強的生理活性，如抗氧化性、抗炎癥活性和預防動脈粥樣硬化的作用等，但食用過多的單寧往往會對身體造成不同程度的損傷，如單寧可與其他消化酶、淀粉和蛋白質形成復雜的反應，形成“柿結石”［1］。Sharma 等［2］人報道，攝入高濃度單寧可引起氨基酸和蛋白質大量排泄，消化道黏膜受損。此外，這些單寧也會對食品風味及口感造成極大影響。目前，物理法、化學法及生物酶法在單寧的消減中均取得了較好的效果。但是，食品除了基本的安全及營養訴求外，色、香、味、體等也是重要品質特征，這使得物理法和化學法在食品中單寧的消減中的應用受到限制，而生物酶解法因零污染、效率高、條件溫和等優點已成為食品單寧物質消減的主要策略，其中單寧酶的挖掘是生物酶法的關鍵技術。

單寧酶(Tannase，EC 3.1.1.20) 是一類可水解單寧中的沒食子酯鍵，釋放葡萄糖和沒食子酸的酶類［3］，其廣泛的分布在動物、植物和微生物中［4］。目前，微生物來源的單寧酶具有較高的酶活力、較好的穩定性及生產的便利等特征，是目前單寧酶的主要來源［5］。在過去150 多年來，許多研究小組對真菌單寧酶進行了深入分析，如青霉屬和曲霉屬［6］，但乳酸菌單寧酶卻鮮有報道，僅限于乳桿菌、酒球菌等。如Kanpiengjai 等［7］人從傳統發酵茶葉分離出的戊酸乳桿菌BA-7 不僅可以降解單寧，還可以提高茶葉抗氧化能力。到目前為止，并未有其他乳酸菌產單寧酶的相關報道。乳酸菌是一類產乳酸細菌的總稱，是一類重要的發酵食品生產用菌，并往往賦予產品特殊的生理功能，如抗氧化性、抑菌性能及腸道的免疫活性等。因此，挖掘具有單寧酶活性的乳酸菌具有重要的理論和應用價值。

本研究以篩選產單寧酶的乳酸菌為目標，開展菌株生物學特征、酶學性質表征及功能特征等研究，并進行菌株的基因組測定分析，進一步全面解析菌株的應用潛力，為菌株的開發利用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

微生態制劑、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190、大腸埃希菌ATCC 25922、單核細胞增生李斯特菌ATCC 19115 和弗氏志賀氏菌CGMCC1.1868 由本課題保存。

羅丹寧、沒食子酸正丙酯 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 梯希愛化成工業發展有限公司。

MRS 培養基：牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.2 g、1 mL吐溫80，蒸餾水1 000 mL，115 ℃滅菌20 min。發酵培養基：單寧酸1 g、蔗糖10 g、NaNO33 g、磷酸氫二鉀1 g、KCL 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，121 ℃滅菌20 min。單寧酶篩選培養基：100 mL MRS 培養基中加入溴甲酚紫0.04 g、單寧酸1 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 將0.1 g 微生態制劑加入至無菌水中震蕩活化2 h，隨后將菌液梯度稀釋，涂布至單寧酶篩選培養基中，37 ℃培養3～5 d，菌落周圍出現黃色圈的菌株為陽性菌株，于4 ℃保存備用。將陽性菌株涂布于乳酸菌篩選培養基，37 ℃下培養24 h，挑取有透明圈的菌落并進行純化，于4 ℃保存。參考Sharma 等［8］人的方法進行單寧酶活性測定，以每分鐘生成1 μmol 沒食子酸所需的酶量為1 個酶活力單位(U)。

1.2.2 菌株的鑒定 ①形態觀察。將菌株STS-6 涂布于MRS 培養基平板，37 ℃倒置培養24 h，觀察菌落的形狀、大小、顏色、及生長狀況等情況，并進行革蘭氏染色。

②16S rDNA 分子鑒定。菌株STS-6 接種至100 mL 液體MRS，37 ℃搖床培養24 h，離心收集菌體。采用細菌基因組DNA 提取試劑盒(天根生物，DP302)提取基因組，并使用PCR 擴增引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1 492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR 反應。采用瓊脂糖回收試劑盒(天根生物，DP209)進行PCR產物回收，并送至北京金唯智生物科技有限公司進行測序。采用軟件BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性分析，采用軟件MEGA 7.0構建系統發育樹。

1.2.3 菌株STS-6 的生長及產酶特性分析。菌株STS-6 接種于50 mL 產酶培養基中，37 ℃搖床培養，每隔4 h 取1 次樣，OD600測定吸光值及酶活力，繪制菌株的生長曲線及產酶曲線。將菌株STS-6 接種至產酶培養基中，37 ℃培養48 h 后，離心(12 000 r/min，10 min)收集菌體及發酵上清，收集備用。采用超聲波破碎儀裂解菌體并溶解于緩沖液中，制備細胞內酶液。將細胞重懸于緩沖液中，制備菌體細胞溶液。分別測定細胞內酶液、菌體細胞及發酵上清的酶活力，探究產菌株的單寧酶分布特性。

1.2.4 單寧酶的酶學特性表征 ①溫度對單寧酶活性的影響。參照1.2.1 中單寧酶測定方法，酶液與底物在20～90 ℃的溫度條件下反應測定單寧酶的最適反應溫度，以最高酶活力為100%。將酶液分別在50 ℃和70 ℃處理0、5、10、20、30 和60 min，在最適溫度和pH 條件下測定單寧酶活性，分析其溫度穩定性。以未經處理的酶液做對照，其酶活力定為100%。

②pH 對單寧酶活性的影響。在最適溫度條件下，酶液與不同pH(2.0～12.0)的底物進行反應，測定單寧酶最適pH，以最高酶活力為100%。將酶液置于不同pH(2.0～12.0)緩沖液中，冰浴1 h 后，在最適溫度和pH 條件下測定單寧酶活性，分析其pH 穩定性，以未經處理的酶液做對照，其酶活力定為100%。

③金屬離子和化學試劑對單寧酶活性的影響。在標準反應體系中分別加入金屬離子、表面活性劑SDS、吐溫80、CTAB、金屬離子螯合劑EDTA 及甲醇、乙醇和異丙醇等有機試劑，使其終摩爾濃度分別為1 和5 mmol/L，按照標準方法進行酶活力的測定，以未處理的酶液為對照組，其酶活力定為100%。

1.2.5 菌株STS-6 的益生功能特性分析 ①菌株胃腸液耐受性測定。參考Jeon 等［9］人方法對菌株STS-6 和商業菌株植物乳桿菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarumST-Ⅲ）分別進行胃腸液耐受性分析。

②菌株自聚和共聚能力測定。參考Huang 等［10］人方法分別對菌株STS-6 和植物乳桿菌ST-Ⅲ進行自聚能力和共聚能力分析。

③抗氧化能力的測定。將菌株STS-6 接種至MRS培養基中，37 ℃培養24 h 后，離心(12 000 r/min，10 min)，收集上清液，并通過冷凍干燥機凍干成粉末。稱取1、2、3、4、5、6 mg 粉末分別溶于1 mL蒸餾水中，配制成濃度為1～6 mg/mL 的待測樣品。參考Ilavenil 等［11］人的方法進行清除DPPH 自由基能力測定；參考Wang 等人［12］的方法進行總還原能力的測定；參考Ines 等人［13］的方法進行DNA 損傷保護測定。

1.2.6 菌株STS-6 的基因組測序及數據分析 采用Illumina Hiseq 和PacBio 的測序方式對菌株STS-6進行全基因組測序，利用Glimmer，GeneMarkS，Prodigal 軟件對基因組中的編碼基因(CDS)進行預測，并對預測得到的編碼基因進行功能注釋，探究益生基因的分布研究。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選及鑒定

從微生態制劑中篩選出1 株高產單寧酶的乳酸菌STS-6(圖1 A)，菌株STS-6 在MRS 培養基中菌落呈圓形，乳白色，光滑，凸起，邊緣整齊，不透明(圖1 B)，為革蘭氏陽性菌，菌體形態為球狀，符合乳酸菌外觀特征(圖1 C)。經序列比對及進化樹分析，菌株STS-6 與P.pentosaceus親緣性最高，序列一致性99%以上(圖1 D)。

圖1 菌株STS-6 的鑒定Fig. 1 Identification of strain STS-6

2.2 菌株STS-6 的生長及產酶特性分析

菌株STS-6 生長變化情況如圖2 A 所示，該菌以體積分數1%接菌培養8 h 進入穩定期。通過對單寧酶活力測定分析，單寧酶的產量隨著培養時間的增加，表現出先增加再減少的趨勢。該菌隨著菌株的生長，單寧酶的產量也在逐漸增加，直至培養36 h，單寧酶的產量達到最大值，為1.6 U/mL，隨后單寧酶的產量則逐漸降低。

圖2 菌株STS-6 的生長及產酶特性Fig. 2 Growth and enzyme-producing characteristics of strain STS-6

經測定，菌株STS-6 的多個部位均檢測到單寧酶活性(圖2 B)，其中發酵上清酶活力最高（約55 %），除此以外，在細胞及細胞內具有一定的酶活力，上述結果表明菌株STS-6 產生的單寧酶主要以胞外酶為主。

2.3 酶學性質分析

2.3.1 溫度對單寧酶活力的影響 研究發現該單寧酶在20～90 ℃溫度范圍內均表現出一定的酶活力，最適溫度為60 ℃，在40～80 ℃之間表現出60%以上的酶活力（圖3 A），即使反應溫度為90 ℃時，也可表現出20%的酶活力。如圖3 B 所示，該單寧酶表現出較好的穩定性，在50 ℃溫度條件下處理60 min 后，酶活力維持在87%以上，而在70 ℃溫度條件下處理60 min 后，仍保持70%以上的酶活力。

圖3 菌株STS-6 單寧酶的酶學性質Fig. 3 Enzymatic properties of tannase in STS-6 strain

2.3.2 pH 對STS-6 單寧酶活力的影響 在60 ℃溫度條件下，測定了該單寧酶在pH 2.0～12.0 的單寧酶活性，結果如圖3 C 所示。該單寧酶最適pH 為6.0，在pH 5.0～7.0 內酶活力可維持在60.0%以上。將該單寧酶酶液置于不同pH 條件下，0 ℃保溫1 h 后，測定該單寧酶殘余酶活力，由圖3 D 可知，該酶在pH 3.0～9.0 之間殘余酶活力均保持在50%以上。

2.3.3 金屬離子及化學試劑對單寧酶活力的影響在低離子濃度（1 mmol/L）條件下，Na+、Ag+、Ca2+均對單寧酶的酶活性有促進作用，其中Na+可使單寧酶活力提高約11%。而其它金屬離子則對單寧酶活力表現出不同程度的抑制作用，其中Zn2+、Cu2+和Fe3+抑制作用較強，使單寧酶活力均小于25%。在高離子濃度下（5 mmol/L）的金屬離子均使單寧酶活性受到抑制，其中Zn2+可使單寧酶失活（見表 1）。

11 種化學試劑對單寧酶活力均有不同程度的抑制作用，EDTA、SDS、吐溫80、尿素、甲醇、丙三醇、異丙醇及丙酮對單寧酶的抑制作用隨著添加量的增大而增強。在5 mmol/L EDTA 條件下，單寧酶活性顯著下降至(25.32±0.26)%。吐溫 80、CTAB 和丙酮均表現出非常強抑制作用，5 mmol/L 的吐溫80幾乎完全抑制了單寧酶活力，甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮（極性溶劑）會抑制酶的活性（見表 1）。

表1 金屬離子和化學試劑對菌株STS-6 單寧酶的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on tannase of strain STS-6

2.4 菌株STS-6 的益生功能特性分析

2.4.1 胃腸液耐受性分析 菌株STS-6 在模擬人工胃腸液條件下的存活率較高（表 2），菌株STS-6 在經過0.3% 胃蛋白酶處理3 h 后活菌數能達到(7.57±0.43)×108CFU/mL，存活率高達94.17%。在人工腸液中，菌株STS-6 活菌數達到(5.17±0.57)×108CFU/mL，存活率達到92.36%。菌株STS-6 在人工胃腸液中的耐受性均高于菌株ST-Ⅲ。結果表明，菌株STS-6 具有較好的胃腸道環境耐受能力。

表2 菌株STS-6 和ST-Ⅲ在人工模擬腸液和胃液條件下的耐受性Table 2 Tolerance of strains STS-6 and ST-III under artificial simulated gastric fluid and intestinal fluid conditions

2.4.2 自聚和共聚能力分析 菌株STS-6 和ST-Ⅲ在4 h 后的自聚集分別為(65.34±2.80)% 和(51.58±2.17)%。24 h 后，分別為(82.78±3.39)%和(69.74±2.31)%(表 3)。STS-6 在4 和24 h 后 與單核細胞增生李斯特菌的共聚集性均低于ST-Ⅲ，STS-6 與其它指示菌的共聚性均高于ST-Ⅲ(表 3)，STS-6 和ST-Ⅲ在24 h 后與鼠傷寒沙門氏菌共聚集性最高分別為(75.14±1.05)% 和(67.00±1.61)%。結果表明，菌株STS-6 表現出較好的自聚和共聚能力。

表3 菌株STS-6 和ST-Ⅲ的自聚、共聚能力Table 3 Autoaggregation and copolymerization ability of strain STS-6 and ST-III

2.4.3 抗氧化活性分析 菌株STS-6 發酵上清液對DPPH 具有高抗氧化活性（圖4 A），最高可達到71.15%，清除活性隨著濃度的增加而增加。發酵上清液具有一定的還原能力(圖4 A)，表現出隨濃度增加而增強的趨勢，當菌液上清濃度為1 mg/mL 時，A700nm為0.17，濃度為6 mg/mL 時，A700nm為0.83。

圖4 戊糖片球菌STS-6 的抗氧化能力分析Fig. 4 Analysis of antioxidant capacity of P.pentosaceus STS-6

菌株STS-6 發酵上清液對質粒DNA 損傷表現出較好的保護作用(圖4 B)。用Fenton 試劑孵育質粒DNA，導致DNA 帶完全降解，通過Gel-Pro Analyzer 對條帶進行灰度值分析，發現發酵上清液加入量為20 和30 μL 時，DNA 損傷程度逐漸減小，條帶亮度損傷保護力分別為20.77%和59.54%。表明發酵上清液對DNA 損傷有較強的抑制作用。

2.5 戊糖片球菌STS-6 的全基因組概況

P.pentosaceusSTS-6 的基因組由1 個1 744 964 bp 的環狀染色體和3 個質粒構成，其質粒片段總長度分別為9 808、57 772 和12 238 bp。GC 含量為37.28%，包含1 767 個編碼基因，占整個基因組的87.86%。其中，NR、Swiss-Prot、Pfam、COG 分別注釋了1 761、1 384、1 539、1 486 個基因。

2.6 益生特性相關基因分析

菌株P.pentosaceusSTS-6 的潛在益生特性在全基因組分析數據中得到了有力支撐(表 4)。本研究中從基因組測序結果中發現了8 個與酸耐受性相關的基因（F0F1 ATP 合成酶）和1 個膽鹽抗性相關的膽鹽水解酶(bsh)基因。此外，菌株P.pentosaceusSTS-6 全基因組中還檢測出5 個熱應激基因及5 個氧應激的相關基因，這些酶可以有效防止不利環境對菌株造成的損傷［14］。

表4 戊糖片球菌STS-6 的益生基因分布Table 4 Prebiotic gene distribution of P. pentosaceus STS-6

2.7 單寧酶基因預測

經研究發現，戊糖片球菌STS-6 中gene0906 基因與植物乳桿菌JDM1 單寧酶基因（ACT61979.1）氨基酸序列一致性為42.9%。gene0906 基因共編碼259 個氨基酸，無信號肽，含有單寧酶的五肽活性位點基序（Gly103-Ser104-Se105r-Ala106-Gly107）。除此以外，該蛋白包含2 個保守結構域，分別為Aes 結構域（乙酰酯酶/脂肪酶）和Abhydrolase-3 結構域（α/β 水解酶折疊）。De 等［15］人報道非“CS-D-HC”單寧酶基因包含上述2 個結構域。gene0906 基因與非“CS-D-HC”單寧酶基因特征相似，但存在差異，可能是由于gene0906 基因自身特異性造成，但還需進一步對該基因進行性質表征研究。

3 結論與討論

本研究成功篩選獲得1 株產單寧酶的戊糖片球菌STS-6。菌株STS-6 所產單寧酶在40～80℃的溫度范圍內具有較高的活性，在60℃時具有最大酶活性。大多數單寧酶的最佳溫度在30～40℃之間［16］，也有嗜熱單寧酶報道，但它們往往來自真菌，如Shao 等人［17］報道黑曲霉FJ0118 的單寧酶最適反應溫度為80 ℃。到目前為止，菌株STS-6 是為數不多的細菌來源的嗜熱單寧酶生產菌。除此以外，該菌單寧酶表現出極好的溫度穩定性。較好的熱穩定性能有利于的單寧酶的生產、儲存及運輸，在實際應用中往往表現出更好的應用前景。菌株STS-6雖單寧酶活力較低，但接下來的研究可通過發酵條件優化或構建單寧酶高效表達重組菌株等手段，提高單寧酶活性。通過全基因組進一步分析發現，該菌株中存在1 個疑似單寧酶基因gene0906。之前報道的單寧酶多為亞型A 和亞型B 單寧酶，這2 種單寧酶基因大約有470～600 個氨基酸，本研究中單寧酶基因僅有259 個氨基酸，但通過預測gene0906基因可能為新單寧酶基因，此單寧酶的發現可能進一步豐富單寧酶類別。

戊糖片球菌在乳酸菌應用中發揮著越來越重要的作用。近年來從發酵食品、水產品、動物、植物和糞便中分離出的許多戊糖片球菌可用作動物生長生物促進劑，食品的生物防腐劑，或者作為新興的益生菌候選物應用于發酵中［18］。然而，迄今為止，與戊糖片球菌作為益生菌的相關的問題仍未解決，如缺乏益生特性相關機制探究。乳酸菌菌株要獲得潛在的益生菌狀態，對胃腸道環境的耐受性至關重要。有研究表明，在模擬胃腸液中菌體發揮功能特性的活菌數臨界值為107CFU/mL［19］。本研究中戊糖片球菌STS-6 菌株胃腸液中活菌數均高于108CFU/mL，可達到菌體發揮功能特性活菌數臨界值，并且存活率分別高達94.17%、92.36%，表現出較好的人工胃腸液耐受性。夏勒合特·巴克爾拜等人［20］從傳統泡菜中篩選出的5 株乳酸菌在腸液中3 h 存活率均達到85%以上。本研究通過全基因組測序檢測到菌株STS-6 含有Na+/H+反轉運蛋白基因nhaK和膽酰甘氨酸水解酶基因bsh，這很可能是該菌株具有較強的腸胃耐受性的關鍵。Qureshi 等［21］人的研究證明Na+/H+反轉運蛋白、膽酰甘氨酸水解酶與胃腸道耐受性有關。

自聚集作用使菌株能夠與腸上皮細胞有效結合，從而提高微生物在胃腸道中的滯留能力，共聚集作用可以阻止病原體在胃腸道定植。Zarali 等人［22］從發酵發芽三葉草種子分離的戊糖片球菌自聚集能力為35.51%，與大腸桿菌共聚集能力為48.71%。Padmavathi 等人［23］篩選的7 株乳酸菌自聚集能力為51.02%～78.95%。本研究中戊糖片球菌STS-6的自聚集能力在24 h 后可達到(82.78±3.39)%，同時與指示菌均有較高的共聚集能力，最高可達到(73.27±0.38)%，結果表明戊糖片球菌STS-6 可以在宿主腸道內很好的定殖，并通過阻止病原微生物的附著形成良好的屏障。

乳酸菌作為功能性發酵劑和潛在的益生菌，其抗氧化活性是極其重要的。本研究發現菌株STS-6的發酵上清表現出較好抗氧化活性。通過全基因組測序進一步分析發現，該菌株存在多個抗氧化基因。例如，該菌株含有硫氧還蛋白arsC 基因，可為硫醇依賴性過氧化物酶提供電子，并參與ROS 和RNS的清除［14］。此外，與應激反應相關的蛋白酶基因也被檢測到，如atp 依賴性細胞內蛋白酶clpP 和hslV 基因，在防止蛋白質異常損傷方面具有重要作用［24］。另外還發現了過氧化氫酶基因cotJC。

在本研究中成功篩選獲得1 株產單寧酶的戊糖片球菌（P.pentosaceusSTS-6），該菌株單寧酶以胞外分泌為主，最高酶活力為1.6 U/mL。該菌具有較好的胃腸液耐受性，具有較高的自聚集和共聚集能力，發酵上清液表現出較高的抗氧化活性。除此以外，該菌株基因組中含有多個益生特性相關基因和1 個疑似單寧酶基因。綜上所述，P.pentosaceusSTS-6 是1 株優良的產單寧酶且具有良好益生特性的菌株，在食品發酵中具有廣闊的應用前景。