基于TaqMan 探針的實時熒光LAMP檢測肉制品中鴨源性成分研究

柳夢思，時國強，高娜婷，焦義然，孫旭飛，孟亞南，董振國

（1.河北三獅生物科技有限公司，河北 石家莊 050035；2.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000；3.河北農業大學 生命科學學院，河北 保定 071000）

近年來，公眾對肉制品的消費需求逐年增長［1～2］。隨著食品加工工藝不斷提高，很大程度改變了食材原有的色澤、味道、紋理、氣味等特性，傳統的感官鑒別技術已無法對食材的真偽進行準確的鑒定［3-5］。其中，肉類及肉制品摻假已成為食品質量控制面臨的重要挑戰之一［6］。由于鴨肉的紋理色澤和牛羊肉較為接近，一些不法商家為獲得高額利潤，會以廉價的鴨肉冒充高價的牛羊肉進行銷售［7-8］。因此，建立快速有效的鴨源性成分鑒定對于肉制品行業的監管具有重要的現實意義。

目前，肉類認證檢測技術以定性檢測為主，主要包括光譜法、質譜法、色譜法、酶聯免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction,PCR）法、環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法等［9-18］。其中光譜法、質譜法和色譜法需要昂貴且精密的儀器，所用試劑價格較高，檢測成本高，且對操作人員的專業素質要求較高，限制了其在肉類檢測中的推廣應用；ELISA 法操作步驟繁瑣，檢測時間長，且樣品加工處理可能導致蛋白質變性，在加工肉制品中的應用受到限制；PCR 法依賴于昂貴的熱循環儀，且需要繁瑣的凝膠電泳來判定結果；LAMP 由于其快速簡便、儀器廉價等優勢迅速發展起來［19-23］。但常規LAMP 法需要通過凝膠電泳法判定結果，無法進行定量檢測，易產生非特性擴增，造成“假陽性”［24］。

本研究通過引入TapMan 探針，建立基于TapMan探針的實時熒光LAMP 方法（TaqMan-LAMP），與常規LAMP 法相比，TaqMan-LAMP 既可以實現定性檢測，又可以實現定量檢測，可有效避免非特異性擴增，為肉制品中鴨源性成分的定量檢測提供新的實用方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用動物源樣品：包括鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、馬肉、驢肉、蝦肉、鴿子肉、鸚鵡肉、狐貍肉、魷魚、鯉魚、鼠肉、水貂均購自各大型超市及電商平臺的單一品類生鮮肉，并經國家標準方法GB/T38164-2019［25］進行驗證。市售待檢樣品：通過菜市場、超市及各線上平臺共采購了47 份牛、羊、豬肉制品，包括牛肉速凍水餃、羊肉速凍水餃、豬肉速凍水餃、牛肉干、牛肉卷、黑椒牛肉餡餅半成品、合成牛排、撒尿牛丸、牛肉漢堡餅、生羊肉串、熟羊肉串、羊肉卷、羊肉燒麥、羊肉烤包子、豬肉脯、豬肉四喜丸子、豬肉香腸、豬肉小籠包、牛肉小籠包等。

1.2 儀器

BBEX-32 全自動核酸提取純化儀（廣州灣區生物科技有限公司）；Q162D 實時熒光定量PCR 儀（河北三獅生物科技有限公司）。

1.3 核酸提取

根據Baypure 磁珠法動物組織基因組DNA 提取試劑盒（廣州灣區生物科技有限公司）說明書要求對各樣品進行DNA 提取，核酸樣本冷藏備用。

1.4 引物探針設計

從Genbank 數據庫中找到鴨線粒體cytb基因（GenBank：EU585609.1）序列保守區域，使用primer explorer v5 網站設計LAMP 引物組，包括內引物（FIP/BIP）、外引物（F3/B3）及環引物（LB/LF）。分別使用LB/LF 設計為LBP/LFP 探針，于3′端與5′端修飾熒光基團-FAM 與淬滅基團-BHQ1。引物及探針由上海生工合成，序列見表1 和表2。

表1 TaqMan-LAMP 引物和探針序列Table 1 The primer and probe sequences of TaqMan-LAMP

表2 熒光定量PCR 引物和探針序列Table 2 The primer and probe sequences of realtime fluorescence quantitative PCR

參照GB/T38164—2019 合成鴨源特異性引物和探針，序列見表2。

1.5 TaqMan-LAMP 檢測方法的建立

LAMP 檢測方 法包含：1×ThermoPol Buffer（Vazyme），8U Bst DNA Polymerase Large Fragment（Vazyme），1.4 mmol MgSO4（Vazyme），1.4 mmol dNTPs（Sanshibio），0.5 μL SYTO-9（life technology），FIP 和BIP 各2.0 μmol，F3 和B3 各0.5 μmol，0.5 μmol LB/LF，1.0 μL 模板DNA，（根據試驗設計選擇是否添加），ddH2O 補足25 μL，反應條件：60 ℃，1 min（采集熒光FAM），40 個循環。

TaqMan-LAMP 檢測方法包含：1×ThermoPol Buffer（Vazyme），8U Bst DNA Polymerase Large Fragment（Vazyme），5U Taq DNA polymerase（E001，Sanshibio），1.4 mmol MgSO4（Vazyme），1.4 mmol dNTPs（Sanshibio），FIP 和BIP 各2.0 μmol，F3 和B3 各0.5 μmol，1.5 μmol LB/LF 與LFP/LBP 組合，根據試驗設計選擇組合添加，1.0 μL 模板DNA，ddH2O 補足25 μL，反應條件為：60 ℃，1 min（采集熒光FAM），40 個循環。

實時熒 光PCR 檢測方 法：2× Probe qPCR Mix（EH002，Sanshibio），F、R 和P 各5.0 μmol，5.0 μL 模板DNA，ddH2O 補足25 μL，反應條件：95 ℃/2 min，95 ℃/15 s，65 ℃/80 s（采集熒光FAM），40 個循環。

1.6 特異性試驗

使用TaqMan-LAMP 檢測方法分別對提取的鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、馬肉、驢肉、蝦肉、鴿子肉、鸚鵡肉、狐貍肉、魷魚、鯉魚、鼠肉及水貂等基因組DNA 檢測，以無酶無菌水為陰性對照，測試TaqMan-LAMP 體系的特異性。

1.7 靈敏度試驗

將鴨肉與羊肉混合，使鴨肉質量濃度依次為10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%，充分混勻后，進行核酸提取，分別使用LAMP、TaqMan-LAMP 和實時熒光PCR 法對各梯度核酸模板進行測試，并計算擴增結果的線性相關系數（R2）＞0.980 為靈敏度合格。

1.8 重復性試驗

采用TaqMan-LAMP 檢測方法對低質量濃度鴨源核酸樣品進行8 次重復測試，以ddH2O 為陰性對照，對Ct值的變異系數CV值進行計算，CV＜3%為靈敏度合格。

1.9 實際樣品檢測

同時使用LAMP、TaqMan-LAMP 和實時熒光PCR 法對市售47 份肉制品鴨源成分進行檢測，以實時熒光PCR 作為對照，確定該檢測方法的相對敏感性、相對特異性、相對符合率，對該檢測方法作出評價。分別按下列公式進行計算：

相對敏感性=真陽性數/（真陽性數+假陰性數）；

相對特異性=真陰性數/（真陰性數+假陽性數）；

相對符合率=（真陽性數+真陰性數）/被檢總數。

2 結果與分析

2.1 TaqMan-LAMP 體系建立

在LAMP 檢測方法的內引物（FIP、BIP）和外引物（F3、B3）上，加入不同環引物或環引物探針組合，分別建立了LAMP（無LB/LF）、LAMP（LF）、LAMP（LB）和LAMP（LB/LF）4 種LAMP 檢測體系，以及LAMP（LBP/LF）與LAMP（LB/LFP）2種TaqMan-LAMP 檢測方法，以熒光定量PCR 法作為對照，對同一鴨源核酸進行檢測，結果見表3。

表3 不同檢測體系的檢測結果Table 3 Results of the different detection systems

結果顯示，所建立的恒溫檢測方法（Ct值對應的即為檢測時間）相對于熒光定量PCR 法（Ct值為17.57，對應的PCR 檢測時間約為32 min），檢測時間更短。雙環引物LAMP 比無環引物及單環引物的檢測時間均更短，表明體系中加入的環引物在形成擴增元過程中起到了加速的作用。將其中一條環引物引入熒光/淬滅基團，由于LAMP（LBP+LF）較LAMP（LB+LFP）檢測時間更短，故優選LAMP（LBP+LF）為TaqMan-LAMP 檢測體系進行鴨源性成分檢測。

2.2 特異性檢測結果

為驗證引物的特異性，本研究分別以提取的鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、馬肉、驢肉、蝦肉、鴿子肉、鸚鵡肉、狐貍肉、魷魚、鯉魚、鼠肉和水貂等基因組DNA 作為模板，以ddH2O 作為陰性對照，采用TaqMan-LAMP 方法進行檢測。結果如圖1 所示，只有鴨肉出現典型的“S”型擴增曲線，呈現陽性結果，而其他動物源性成分均未出現擴增曲線，判定為陰性結果。表明TaqMan-LAMP 檢測方法具有良好的特異性。

圖1 TaqMan-LAMP 檢測方法特異性檢測結果Fig. 1 Specificity result of TaqMan-LAMP method

2.3 靈敏度檢測結果

將鴨肉分別與生羊肉混合，使其質量濃度（w/w）依次為10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%，充分混勻后，進行核酸提取，分別采用LAMP、TaqMan-LAMP 和熒光定量PCR 法進行檢測，結果見表4。

表4 靈敏度檢測結果Table 4 Test results of sensibility

結果顯示，與LAMP 檢測方法相比，TaqMan-LAMP 法靈敏度一致，均為0.001%（w/w），且陰性對照無“假陽性”結果；與熒光定量PCR 法相比，TaqMan-LAMP 法擴增結果的線性相關系數（R2）相當，均大于0.999，且可在更短時間（25.92 min）內完成靈敏度為0.001%（w/w）的準確檢測。

2.4 重復性檢測結果

采用TaqMan-LAMP 檢測體系對低質量濃度0.001%鴨源核酸樣品進行8 次重復測試，以ddH2O為陰性對照，檢測結果如圖2 所示。

圖2 重復性檢測結果Fig. 2 Repeatability of test results

對Ct值的變異系數CV值進行計算，CV值為1.99%。TaqMan-LAMP 檢測方法靈敏度合格，檢測結果穩定。

2.5 實際樣品結果

以GB/T38164-2019 實時熒光PCR 法鴨源檢測方法為對照，使用TaqMan-LAMP 和LAMP（LB/LF）檢測體系同時對收集的47 份肉制品進行平行測試，見表5。結果顯示，LAMP（LB/LF）檢測體系的相對敏感性為100%，但出現了2 份“假陽性”結果，故影響了相對特異性和相對符合率（分別為88.89%和95.74%）；而本研究所建立的TaqMan-LAMP 檢測方法相對敏感性、相對特異性和相對符合率均為100%。

表5 實際樣品檢測結果Table 5 Accuracy of test results

3 結論

本研究建立了快速有效的TaqMan-LAMP 檢測方法，用于檢測肉制品中的鴨源性成分。結果表明，該檢測方法的特異性良好，可在30 min 內完成準確檢測，靈敏度為0.001%（w/w），重復性好。通過對47 份實際樣品檢測，與國標法相比，該方法相對敏感性、特異性和符合率均為100%?？傊?，本研究建立的鴨源性成分TaqMan-LAMP 檢測方法快速、特異性強、靈敏度高，適用于肉制品中鴨源性成分的快速檢測，為肉制品中摻假成分的檢測提供了一種新方法。