去氫木香內酯對肝纖維化模型小鼠的保護作用

方福如, 蔡濤

(湖南環境生物職業技術學院 醫學院,湖南 衡陽 421001)

肝纖維化是復雜的病理生理過程。當肝臟受到病毒、酒精、藥物等各種損傷性刺激時,肝內結締組織異常增生,導致細胞外基質過多沉積,破壞肝臟原有的結構和功能。肝纖維化可發展為肝硬化、門靜脈高壓甚至肝細胞癌[1]。及時的干預和抗纖維化治療,可使肝纖維化逆轉[2],從而可以大大地降低肝硬化、肝癌的發生。

肝纖維化是世界范圍內的衛生難題[3],探索肝纖維化的有效治療方法迫在眉睫,近年來,國內外學者致力于此方面的研究[4],但引發肝纖維化的機制非常復雜,故針對病因的治療非常困難,根據不同情況定制肝纖維化患者的個性化治療尤為重要,不同藥物聯合治療肝纖維化成為未來肝纖維化治療的主導趨勢。西醫的針對病因治療的方法可以在一定程度上抑制肝纖維化[5]。但是,肝纖維化機制一旦啟動,往往呈主動性進展,單一的病因治療并不能完全抑制炎癥,效果局限[6],因此針對纖維組織增生與降解的抗肝纖維化治療非常必要。

近年來的研究和應用實踐已經表明,中醫藥在治療肝病尤其是防治肝纖維化領域顯示出較大的療效優勢。Huang等[7]通過研究發現陽桃根提取物能改善四氯化碳誘導大鼠的肝纖維化,Liu等[8]研究發現疏肝活血化瘀方通過抑制轉化生長因子-β1/Smad信號通路減輕四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化。木香有行氣止痛、溫中和胃之功效,木香或木香配伍中藥臨床上可用于治療消化系統疾病[9]。木香為疏肝和胃顆粒的主藥之一,其主要活性成分為去氫木香內酯(Dehydrocostus Lactone,DHL)[10]。去氫木香內酯是倍半萜類化合物,具有抗炎[11]、抗腫瘤[12]以及抗菌[13]等藥理活性,已引起人們的關注[14]。有研究表明,去氫木香內酯具有抑制肝癌的作用[15,16]。孫文利等[17]證明,去氫木香內酯可以減輕大鼠肝臟壞死性病理改變,對大鼠肝臟損傷有較好的保護作用。但是去氫木香內酯抗肝纖維化的作用及其相關機制方面尚未見報道。

因此,本研究擬通過探索去氫木香內酯對四氯化碳造模建立的肝纖維化小鼠的抗纖維化保護作用,為肝纖維化的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

40只6～8周齡 C57BL/6J雄性小鼠,SPF級,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 藥品與試劑

去氫木香內酯、四氯化碳、橄欖油由麥克林公司提供;天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒購于南京建成生物工程研究所,伊紅、蘇木素、天狼星紅染色試劑盒均來自上海威奧生物科技有限公司;α-SMA抗體、CollagenⅠ抗體來源于美國Proteintech Group公司。

1.3 實驗分組及干預

分組:將40只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為4組,分別為對照組、模型組、DHL低劑量組(5 mg/kg)、DHL高劑量組(20 mg/kg),每組10只。造模:腹腔注射溶液,每周2次,持續8周;對照組:腹腔注射橄欖油溶液(5 mL/kg);模型組:腹腔注射20%的CCl4橄欖油溶液,給藥體積(5 mL/kg)。干預:于腹腔注射造模第5周進行分組干預,DHL低劑量組灌胃5 mg/kg劑量的藥物,DHL高劑量組灌胃20 mg/kg劑量的藥物,每天1次,持續4周;對照組、模型組給予等容量的生理鹽水。最后一次給藥后,禁食24 h,麻醉處死,眼眶取血。

1.4 指標檢測

1.4.1 肝臟組織外觀及肝體比

觀察肝臟外觀形態、組織彈性、表面質感等;稱量小鼠體重、肝臟體重,根據公式(肝體比=肝重/體重×100%)計算出肝體比并進行比較。

1.4.2 檢測血清肝功能

最后一次給藥后,禁食24 h,麻醉處死后,采血后靜置分離獲取血清,采用全自動生化免疫分析儀檢測血清中ALT和AST的含量。

1.4.3 肝臟組織病理學觀察

取肝右葉同一部位新鮮組織,常規固定、石蠟包埋后,采用蘇木精伊紅(HE)染色。經烤片、切片脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、梯度酒精脫水、中性樹膠封片后,光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理形態變化。

1.4.4 天狼星紅膠原染色

取肝右葉同一部位新鮮組織,常規固定、石蠟包埋后,采用天狼星紅染色。經烤片、切片脫蠟至水、天狼星紅染色液染色、沖洗、吹干、透明、封片,光學顯微鏡觀察各組小鼠肝組織中膠原纖維沉積情況。

1.4.5 免疫組化(IHC)染色檢測α-SMA、Collagen Ⅰ在小鼠肝臟的表達情況

取肝右葉同一部位新鮮組織,常規固定、石蠟包埋后,組織切片,經烤片、切片脫蠟、熱修復抗原、滅活內源性酶、孵育一抗(α-SMA、CollagenⅠ)、孵育二抗、DAB顯色、蘇木素復染、各級酒精脫水、中性樹膠封片、顯微鏡觀察α-SMA以及CollagenⅠ在各組小鼠肝臟的表達情況。

1.5 統計學方法

采用IBM SPSS Statistics 25.0統計軟件對數據進行分析,所有實驗數據以均數±標準差表示;多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肝臟組織外觀

肝臟組織外觀(圖1)顯示,對照組小鼠肝臟組織表面光滑、呈紅褐色;模型組小鼠肝臟面不光滑、表面顆粒多、呈灰黃色;與模型組比較,低、高劑量組小鼠肝臟表面欠光滑、有些許顆粒,顏色偏紅。

圖1 對照組、模型組、DHL低劑量組、DHL高劑量組肝臟形態Figure 1 Liver morphology of control group, model group, DHL low dose group and DHL high dose group

2.2 肝體比與肝功能

與對照組相比,CCl4模型組的肝體比、ALT、AST明顯升高(P<0.05),提示CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型造模成功;與模型組比較,DHL低劑量組、HL高劑量組肝體比、ALT、AST明顯下降(P<0.05),且高劑量組各指標差異較低劑量組更明顯(P<0.05),有劑量依賴性,見表1。

表1 小鼠肝體比與肝功能指標比較Table 1 Comparison of liver body ratio and liver function indexes in mice

2.3 HE染色結果

HE染色結果如圖2所示。對照組肝組織中央靜脈位于肝小葉的中部,肝細胞核大而圓,連接緊密,以中央靜脈為中心,放射狀排列,少量炎癥細胞浸潤;CCl4誘導的模型組肝細胞排列紊亂,肝組織中央靜脈周圍可見較多纖維組織增生,甚至形成假小葉;DHL低劑量及高劑量組小鼠肝臟組織病理改變均有不同程度的改善。

圖2 各組小鼠肝組織HE染色結果(400×)Figure 2 HE staining results of liver tissues of mice in each group(400×)

2.4 天狼星紅染色結果

天狼星紅染色結果如圖3所示。與對照組相比,模型組膠原纖維表達面積顯著增加,去氫木香內酯低劑量組、高劑量組小鼠肝臟組織膠原表達有明顯改善,高劑量組更為明顯。

圖3 各組小鼠肝組織天狼星紅染色結果(400×)Figure 3 The results of Sirius scarlet staining in the liver tissues of mice in each group(400×)

2.5 IHC檢測α-SMA、CollagenⅠ在小鼠肝臟的表達情況

(1)α-SMA抗體染色結果(圖4):與對照組相比,模型組小鼠肝組織中α-SMA蛋白表達增加,去氫木香內酯低劑量組、高劑量組肝組織中α-SMA蛋白表達出現了不同程度的下降。

圖4 各組小鼠肝組織α-SMA抗體染色結果(400×)Figure 4 Staining results of α-SMA antibody in liver tissues of mice in each group(400×)

(2)CollagenⅠ抗體染色結果(圖5):與對照組相比,模型組小鼠肝組織中CollagenⅠ蛋白表達增加,去氫木香內酯低劑量組以及高劑量組肝組織中CollagenⅠ蛋白表達出現不同程度的下降。

圖5 各組小鼠肝組織CollagenⅠ抗體染色結果(400×)Figure 5 Staining results of CollagenⅠantibody in liver tissues of mice in each group (400×)

3 討論與結論

肝纖維化是由各種慢性肝病所致細胞外基質異常沉積的病理過程,早期有效的干預可使肝纖維化逆轉,這亦是預防慢性肝病進展為肝硬化、肝癌的關鍵。病因的治療可在一定程度上減輕對肝臟的損傷,但是肝纖維化機制一旦啟動,往往呈主動性進展,單一的病因治療不能完全抑制炎癥,效果有限,因此,針對纖維組織的增生和降解的抗肝纖維化治療是非常必要的[6]。

本研究發現,去氫木香內酯能夠降低CCl4誘導的小鼠肝纖維化水平,改善其肝功能。去氫木香內酯作為木香的成分之一,可能為肝纖維化的治療提供一種新的治療方法。CCl4誘導的小鼠肝纖維化是肝纖維化研究中常用的模型,研究中模型組的肝體比、ALT、AST明顯升高,病理可見肝細胞排列紊亂,肝組織中央靜脈周圍可見較多纖維組織增生,甚至形成假小葉,膠原纖維表達面積顯著增加,均提示CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型造模成功。DHL低劑量組、DHL高劑量組肝體比、ALT、AST明顯下降(P<0.05),且高劑量組各指標差異較低劑量組更明顯(P<0.05);各劑量組小鼠肝臟組織病理變化得到明顯的改善,肝組織中α-SMA蛋白、CollagenⅠ蛋白表達出現不同程度的下降;均提示去氫木香內酯能夠改善CCl4誘導的肝纖維化小鼠肝功能和纖維化水平,具有保護作用。

目前,研究表明,肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cell,HSC)的激活是肝纖維化的發生和發展的中心環節,各種損傷因素導致肝星狀細胞的增殖和活化[18];活化的肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞,分泌α-SMA,導致大量ECM的合成增加;產生大量細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM),而CollagenⅠ是HSCs活化后釋放的最主要的細胞外基質[19]。本研究通過免疫組化染色探究了DHL對小鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA的影響,結果顯示,模型組小鼠肝組織中CollagenⅠ、α-SMA蛋白的表達水平均較對照組顯著升高,提示小鼠肝纖維化模型建模成功。

傳統治療肝纖維化的研究中表明,TGF-β1是促進肝纖維化的關鍵細胞因子,可通過多種途徑刺激肝星狀細胞活化,促進肝纖維化[20],同時,TGF-β1的釋放會進一步促進炎癥的發展、抑制免疫反應;Smad蛋白是TGF-β信號轉導的關鍵下游信號分子,TGF-β通過提高Smad2/3的磷酸化水平促進肝纖維化[21]。去氫木香內酯對肝星狀細胞的增殖、凋亡和細胞周期是否有影響,其中的內在分子機制如何,是否通過調控TGF-β1/Smad2/Smad3信號通路防治肝纖維化的發生發展,是我們深入探索的方向,有待進一步研究。

綜上所述,去氫木香內酯對四氯化碳造模建立的肝纖維化小鼠具有抗纖維化作用。本研究從肝臟生化、病理、免疫組化的層面進一步證明去氫木香內酯對肝纖維化的改善作用,為肝纖維化的臨床治療提供實驗依據,為肝纖維化的研究提供理論依據。